CN110257414A - 一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途 - Google Patents

一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种小鼠MIP3α‑endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途，包括：以mMIP3α‑F，R1引物扩模板mouse MIP3α质粒；以F1，mEndoglin‑R引物扩模板mouse Endoglin；以第一轮PCR产物为模板，以mMIP3α‑F，mEndoglin‑R为引物做PCR扩增；pcDNA3.1(+)/Fc质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选。本发明将极有可能大大增强其肿瘤组织靶向性，明显提高其抗肿瘤免疫活性，展示了良好的临床应用价值。

Description

一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途。
背景技术
Endoglin(CD105)是一个TGF-β受体复合物的膜表面糖蛋白分子，在肿瘤组织中特异性高表达，是肿瘤血管生成的标志性分子之一。由于肿瘤新生血管均起源于内皮细胞，所表达的特异抗原物质具有共性，这样就可避免肿瘤由于遗传物质在不断突变所导致的肿瘤抗原的异质性，故针对肿瘤血管内皮细胞的治疗策略不会或只会引起微乎其微的抗药性。由此可见，Endoglin作为肿瘤靶向结合位点优于传统的肿瘤抗原靶点。MIP3α(巨噬细胞炎性蛋白3α)是一种分子量只有9kDa的CC型小分子细胞趋化因子。CC趋化因子受体6(CCR6)是MIP3α的唯一受体。研究表明，MIP3α是DC最重要的特异性趋化因子之一，它通过吸引表达CCR6的未成熟DC趋化于病原感染组织，使DC能够接触处理和递呈抗原。可见，如果设法让肿瘤组织中的MIP3α水平增加，就能够促使DC向肿瘤组织趋化，进而提高DC递呈肿瘤抗原的能力。因此，为了使体内MIP3α趋化募集而来的DC能够更有效地靶向肿瘤细胞并提高其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性必须寻找新的有效策略。如何有效提高肿瘤抗原的免疫原性和免疫效果是肿瘤免疫亟待探索的问题，需要另辟蹊径。Fc融合蛋白又称抗体融合蛋白，是利用基因工程技术将具有活性功能的蛋白分子与抗体的Fc段融合所产生的新型功能蛋白。这类融合蛋白不仅保留原功能蛋白的全部生物学活性和长效体内半衰期，而且可以完全取代抗体功能而免疫原性极低，是理想的信号通路阻断剂。研究表明，使用Fc融合蛋白作为肿瘤治疗性抗体除了在动物体内半衰期长外，来源于小鼠的Fc还可以增强抗原提呈细胞对靶抗原的提呈能力，这均大大增强其抗肿瘤免疫效果。
综上所述，现有技术存在的问题是：树突状细胞(dendritic cells，DC)疫苗是当前肿瘤免疫研究的热点。目前制备DC疫苗往往需要通过体外扩增DC，再把患者的肿瘤细胞或人工制备的抗原和扩增的DC细胞进行体外共同培养，让这些DC在体外对抗原进行适当处理修饰后再输回患者体内，但是这些“作坊”式的DC疫苗体外制备方法存在操作复杂、成本高、规范难等不足。因此，寻找一种诱导肿瘤免疫的“体内”DC疫苗方法能够使DC疫苗治疗肿瘤变得更加简单有效，是一种更好的治疗策略。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途。
本发明是这样实现的，一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途，所述小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途包括：
步骤一，第一轮PCR:以mMIP3α-F，R1引物扩模板mouse MIP3α质粒；以F1，mEndoglin-R引物扩模板mouse Endoglin；
步骤二，第二轮PCR:以第一轮PCR产物为模板，以m MIP3α-F，mEndoglin-R为引物做PCR扩增；
步骤三，pcDNA3.1(+)/Fc质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选。
进一步，所述步骤一PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环25次；72℃充分延伸5min。
进一步，所述步骤二PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次；72℃充分延伸5min。
进一步，所述PCR产物的凝胶回收包括：
向DNA Binding column B吸附柱中加入500ul平衡液，12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
将凝胶液转移至吸附柱中，室温放置2分钟；12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。；
向吸附柱中加入600ul已加好无水乙醇的漂洗液washing,12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
在此时间内将洗脱用的超纯水50℃水浴预热；
12000rpm离心2分钟,以彻底去除吸附柱中残余漂洗液；
将吸附柱置于干净的已做好名称标记的1.5ml离心管中，向柱膜中央悬空滴加30-50ul预热好的超纯水，室温放置2分钟；12000rpm离心1分钟，丢弃吸附柱，回收完毕；
使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步，所述重组质粒PCR鉴定先94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸120sec，30个循环，最后72℃延伸5min。所得产物以1.2％琼脂糖电泳检测。
进一步，所述重组质粒QC鉴定的PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次。
本发明将通过基因工程的方法构建MIP3α-endoglin Fc融合蛋白，将极有可能大大增强其肿瘤组织靶向性，极大地提高其抗肿瘤免疫活性，展示了良好的临床应用价值。利用endoglin主要表达于肿瘤新生血管内皮细胞的特性，采用基因工程技术构建抗endoglin的抗体和能有效趋化募集DC的MIP3α的Fc融合蛋白(简称MIP3α-endoglin Fc)，将适量的重组融合蛋白输入肿瘤动物模型，则有可能让肿瘤部位靶向获得高浓度MIP3α，充分发挥体内MIP3α趋化募集DC作用，并巧妙借助endoglin的天然靶向特性使整个MIP3α-endoglin Fc融合蛋白(具有长效体内半衰期)更精确地靶向肿瘤细胞(和/或肿瘤新生血管)进而诱导更强力更持久的特异性免疫反应，同时来源于小鼠的endoglin/Fc可以增强抗原提呈细胞对靶抗原endoglin的提呈能力进而增强抗肿瘤免疫效应，加上endoglin/Fc靶向抗肿瘤血管生成协同/叠加作用，这必将极大增强它们对肿瘤细胞和/或肿瘤新生血管特异性靶向杀伤作用。因此，这种兼具肿瘤靶向、抗肿瘤血管生成和体内DC疫苗的多功效融合蛋白极有可能是一种简单而有效的肿瘤疫苗模式。
本发明的MIP3α-EndoglinFc融合蛋白是一种全新的序列且解决了现有技术中普通重组的蛋白的体内半衰期非常短，需要大剂量频繁给药的技术问题。将功能性蛋白与免疫球蛋白Fc段融合，形成新的长效功能蛋白是具有创新性的。
附图说明
图1是本发明实施例提供的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途流程图。
图2是本发明实施例提供的目标表达载体的结构示意图。
图3是本发明实施例提供的MIP3α-endoglin目的基因的扩增示意图；
图中：Lane M:DNA分子量标准；Lane 1:mMIP3α-F目的基因扩增产物；Lane 2:mEndoglin-R目的基因扩增产物。
图4是本发明实施例提供的重组质粒PCR鉴定示意图；
图中：Lane 1，2，4-6：阳性克隆；Lane M：DNA Marker。
图5是本发明实施例提供的重组质粒酶切和测序鉴定示意图；
图中：Lane 1：阳性克隆质粒；Lane 2：阳性克隆的PCR鉴定(2024bp)；Lane 3：阳性克隆，AflII/XbaI双酶切验证；Lane M：DNAMarker。
图6是本发明实施例提供的MIP3α-endoglinFc融合蛋白的纯化及复性示意图；
图中：Lane 1:Mouse MIP3α-endoglinFc,1ug,Reducing(变性电泳)；Lane 2:Mouse MIP3α-endoglinFc,1ug,Non-Reducing(非变性电泳)；Lane M:Protein Marker(Fermentas,SM0661)。
图7是本发明实施例提供的体外发现MIP3α-endoglin Fc融合蛋白具有较好的树突状细胞趋化作用示意图。
图8是本发明实施例提供的体外发现MIP3α-endoglin Fc融合蛋白具有肿瘤组织特异性和血管靶向性示意图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途包括以下步骤：
S101：第一轮PCR:以mMIP3α-F，R1引物扩模板mouse MIP3α质粒(由江苏省弗泰生物科技有限公司提供)；以F1，mEndoglin-R引物扩模板mouse Endoglin(由江苏省弗泰生物科技有限公司提供)；
S102：第二轮PCR:以第一轮PCR产物为模板，以mMIP3α-F，mEndoglin-R为引物做PCR扩增；
S103：pcDNA3.1(+)/Fc(Mouse IgG2a)质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
一、基因构建
1.序列信息
1)Mouse MIP3αmRNA(CDS):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_016960.2
ATGGCCTGCGGTGGCAAGCGTCTGCTCTTCCTTGCTTTGGCATGGGTACTGCTGGCTCACCTCTGCAGCCAGGCAGAAGCAGCAAGCAACTACGACTGTTGCCTCTCGTACATACAGACGCCTCTTCCTTCCAGAGCTATTGTGGGTTTCACAAGACAGATGGCCGATGAAGCTTGTGACATTAATGCTATCATCTTTCACACGAAGAAAAGAAAATCTGTGTGCGCTGATCCAAAGCAGAACTGGGTGAAAAGGGCTGTGAACCTCCTCAGCCTAAGAGTCAAGAAGATGTAA
Protein Sequence:
MACGGKRLLFLALAWVLLAHLCSQAEAASNYDCCLSYIQTPLPSRAIVGFTRQMADEACDINAIIFHTKKRKSVCADPKQNWVKRAVNLLSLRVKKM
2)Mouse Endoglin,mRNA(CDS):
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001146348.1
ATGGACCGTGGCGTGCTCCCTCTGCCCATTACCCTGCTGTTTGTCATCTATAGCTTTGTACCCACAAGTCTCGCAGAAAGAGTCGGCTGTGATCTACAGCCTGTGGACCCCACAAGGGGTGAGGTGACGTTTACCACCAGCCAGGTCTCCGAGGGCTGTGTAGCTCAGGCTGCCAATGCTGTGCGTGAAGTCCACGTTCTCTTCCTGGATTTTCCCGGAATGCTGTCACATCTGGAGCTGACTCTTCAGGCATCCAAGCAAAATGGCACGGAGACCCAGGAGGTGTTCCTGGTCCTCGTTTCGAACAAAAATGTCTTCGTGAAGTTCCAGGCCCCGGAAATCCCATTGCACTTGGCCTACGACTCCAGCCTGGTCATCTTCCAAGGACAGCCAAGAGTCAACATCACAGTGCTACCATCCCTTACCTCCAGGAAACAGATCCTCGACTGGGCAGCCACCAAGGGCGCCATCACCTCGATAGCAGCACTGGATGACCCCCAAAGCATCGTCCTCCAGTTGGGCCAAGACCCAAAGGCACCATTCTTGTGCTTGCCAGAAGCTCACAAGGACATGGGCGCCACACTTGAATGGCAACCACGAGCCCAGACCCCAGTCCAAAGCTGTCGCTTGGAAGGTGTGTCTGGCCACAAGGAGGCCTACATCCTGAGGATCCTGCCAGGTTCTGAGGCCGGGCCCCGGACGGTGACCGTAATGATGGAACTGAGTTGCACATCTGGGGACGCCATTCTCATCCTGCATGGTCCTCCATATGTCTCCTGGTTCATCGACATCAACCACAGCATGCAGATCTTGACCACAGGTGAATACTCCGTCAAGATCTTTCCAGGAAGCAAGGTCAAAGGCGTGGAGCTCCCAGACACACCCCAAGGCCTGATAGCGGAGGCCCGCAAGCTCAATGCCAGCATTGTCACCTCCTTTGTAGAGCTCCCTCTGGTCAGCAATGTCTCCCTGAGGGCCTCCAGCTGCGGTGGTGTGTTCCAGACCACCCCTGCACCCGTTGTGACCACACCTCCCAAGGACACATGCAGCCCCGTGCTACTCATGTCCCTGATCCAGCCAAAGTGTGGCAATCAGGTCATGACTCTGGCACTCAATAAAAAACACGTGCAGACTCTCCAGTGCACCATCACAGGCCTGACTTTCTGGGACTCCAGCTGCCAGGCTGAAGACACTGACGACCATCTTGTCCTGAGTAGCGCCTACTCCAGCTGCGGCATGAAAGTGACAGCCCATGTGGTCAGCAATGAGGTGATCATCAGTTTCCCGTCAGGCTCACCACCACTTCGGAAAAAGGTACAGTGCATCGACATGGACAGCCTCTCCTTCCAGCTGGGCCTCTACCTCAGCCCGCACTTCCTCCAGGCATCCAACACCATCGAACTAGGCCAGCAGGCCTTCGTACAGGTGAGCGTGTCTCCATTGACCTCTGAGGTCACAGTCCAGCTAGATAGCTGCCATCTGGACTTGGGGCCCGAAGGGGACATGGTGGAACTCATCCAGAGCCGAACAGCCAAGGGCAGCTGTGTGACCTTGCTGTCTCCAAGCCCTGAAGGTGACCCACGCTTCAGCTTCCTCCTCCGGGTCTACATGGTGCCCACACCCACCGCTGGCACCCTCAGTTGCAACTTAGCTCTGCGCCCTAGCACCTTGTCCCAGGAAGTCTACAAGACAGTCTCCATGCGCCTGAACATCGTCAGCCCTGACCTGTCTGGTAAAGGCCTTGTCCTGCCCTCTGTACTGGGTATCACCTTTGGTGCCTTCCTGATTGGGGCCCTGCTCACAGCTGCACTCTGGTACATCTATTCTCACACACGTGGCCCCAGCAAGCGGGAGCCCGTGGTGGCAGTGGCTGCCCCGGCCTCCTCTGAGAGCAGCAGTACCAACCACAGCATCGGGAGCACCCAGAGCACCCCCTGCTCCACCAGCAGCATGGCGTAG
Protein Sequence:
MDRGVLPLPITLLFVIYSFVPTSLAERVGCDLQPVDPTRGEVTFTTSQVSEGCVAQAANAVREVHVLFLDFPGMLSHLELTLQASKQNGTETQEVFLVLVSNKNVFVKFQAPEIPLHLAYDSSLVIFQGQPRVNITVLPSLTSRKQILDWAATKGAITSIAALDDPQSIVLQLGQDPKAPFLCLPEAHKDMGATLEWQPRAQTPVQSCRLEGVSGHKEAYILRILPGSEAGPRTVTVMMELSCTSGDAILILHGPPYVSWFIDINHSMQILTTGEYSVKIFPGSKVKGVELPDTPQGLIAEARKLNASIVTSFVELPLVSNVSLRASSCGGVFQTTPAPVVTTPPKDTCSPVLLMSLIQPKCGNQVMTLALNKKHVQTLQCTITGLTFWDSSCQAEDTDDHLVLSSAYSSCGMKVTAHVVSNEVIISFPSGSPPLRKKVQCIDMDSLSFQLGLYLSPHFLQASNTIELGQQAFVQVSVSPLTSEVTVQLDSCHLDLGPEGDMVELIQSRTAKGSCVTLLSPSPEGDPRFSFLLRVYMVPTPTAGTLSCNLALRPSTLSQEVYKTVSMRLNIVSPDLSGKGLVLPSVLGITFGAFLIGALLTAALWYIYSHTRGPSKREPVVAVAAPASSESSSTNHSIGSTQSTPCSTSSMA
2.目标表达载体的结构如图2所示。
3.目标全序列SEQ ID NO：1
Target Sequence:
mMIP3α(Met1-Met97)+Linker(GGGS)3+mEndoglin(Glu26-Gly580)+Fc(MouseIgG2a)
Afl II Kozak
CTTAAGCGGCCGCCACCATGGCCTGCGGTGGCAAGCGTCTGCTCTTCCTTGCTTTGGCATGGGTACTGCTGGCTCACCTCTGCAGCCAGGCAGAAGCAGCAAGCAACTACGACTGTTGCCTCTCGTACATACAGACGCCTCTTCCTTCCAGAGCTATTGTGGGTTTCACAAGACAGATGGCCGATGAAGCTTGTGACATTAATGCTATCATCTTTCACACGAAGAAAAGAAAATCTGTGTGCGCTGATCCAAAGCAGAACTGGGTGAAAAGGGCTGTGAACCTCCTCAGCCTAAGAGTCAAGAAGATGGGTGGAGGTTCGGGTGGAGGTTCAGGTGGAGGTTCTGAAAGAGTCGGCTGTGATCTACAGCCTGTGGACCCCACAAGGGGTGAGGTGACGTTTACCACCAGCCAGGTCTCCGAGGGCTGTGTAGCTCAGGCTGCCAATGCTGTGCGTGAAGTCCACGTTCTCTTCCTGGATTTTCCCGGAATGCTGTCACATCTGGAGCTGACTCTTCAGGCATCCAAGCAAAATGGCACGGAGACCCAGGAGGTGTTCCTGGTCCTCGTTTCGAACAAAAATGTCTTCGTGAAGTTCCAGGCCCCGGAAATCCCATTGCACTTGGCCTACGACTCCAGCCTGGTCATCTTCCAAGGACAGCCAAGAGTCAACATCACAGTGCTACCATCCCTTACCTCCAGGAAACAGATCCTCGACTGGGCAGCCACCAAGGGCGCCATCACCTCGATAGCAGCACTGGATGACCCCCAAAGCATCGTCCTCCAGTTGGGCCAAGACCCAAAGGCACCATTCTTGTGCTTGCCAGAAGCTCACAAGGACATGGGCGCCACACTTGAATGGCAACCACGAGCCCAGACCCCAGTCCAAAGCTGTCGCTTGGAAGGTGTGTCTGGCCACAAGGAGGCCTACATCCTGAGAATCCTGCCAGGTTCTGAGGCCGGGCCCCGGACGGTGACCGTAATGATGGAACTGAGTTGCACATCTGGGGACGCCATTCTCATCCTGCATGGTCCTCCATATGTCTCCTGGTTCATCGACATCAACCACAGCATGCAGATCTTGACCACAGGTGAATACTCCGTCAAGATCTTTCCAGGAAGCAAGGTCAAAGGCGTGGAGCTCCCAGACACACCCCAAGGCCTGATAGCGGAGGCCCGCAAGCTCAATGCCAGCATTGTCACCTCCTTTGTAGAGCTCCCTCTGGTCAGCAATGTCTCCCTGAGGGCCTCCAGCTGCGGTGGTGTGTTCCAGACCACCCCTGCACCCGTTGTGACCACACCTCCCAAGGACACATGCAGCCCCGTGCTACTCATGTCCCTGATCCAGCCAAAGTGTGGCAATCAGGTCATGACTCTGGCACTCAATAAAAAACACGTGCAGACTCTCCAGTGCACCATCACAGGCCTGACTTTCTGGGACTCCAGCTGCCAGGCTGAAGACACTGACGACCATCTTGTCCTGAGTAGCGCCTACTCCAGCTGCGGCATGAAAGTGACAGCCCATGTGGTCAGCAATGAGGTGATCATCAGTTTCCCGTCAGGCTCACCACCACTTCGGAAAAAGGTACAGTGCATCGACATGGACAGCCTCTCCTTCCAGCTGGGCCTCTACCTCAGCCCGCACTTCCTCCAGGCATCCAACACCATCGAACTAGGCCAGCAGGCCTTCGTACAGGTGAGCGTGTCTCCATTGACCTCTGAGGTCACAGTCCAGCTAGATAGCTGCCATCTGGACTTGGGGCCCGAAGGGGACATGGTGGAACTCATCCAGAGCCGAACAGCCAAGGGCAGCTGTGTGACCTTGCTGTCTCCAAGCCCTGAAGGTGACCCACGCTTCAGCTTCCTCCTCCGGGTCTACATGGTGCCCACACCCACCGCTGGCACCCTCAGTTGCAACTTAGCTCTGCGCCCTAGCACCTTGTCCCAGGAAGTCTACAAGACAGTCTCCATGCGCCTGAACATCGTCAGCCCTGACCTGTCTGGTAAAGGGGATCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGAGTCTAGA
Stop XbaI
4.引物设计及克隆方案
4.1
1)目标
将目标序列用AflII/BamHI克隆至pcDNA3.1(+)/Fc(Mouse IgG2a)质粒(由江苏省弗泰生物科技有限公司提供,Fc(Mouse IgG2a)由BamHI/XbaI克隆入pcDNA3.1(+))，获得目标质粒
2)引物设计
mMIP3α-F:ATATCCTTAAGCGGCCGCCACCATGGCCTGCGGTGGCAAGCG；SEQ ID NO：2
R1:GATCACAGCCGACTCTTTCAGAACCTCCACCTGAACCTCCACCCGAACCTCCACCCATCT；SEQID NO：3
F1:AGATGGGTGGAGGTTCGGGTGGAGGTTCAGGTGGAGGTTCTGAAAGAGTCGGCTGTGATC；SEQID NO：4；
mEndoglin-R:ATATGGGATCCCCTTTACCAGACAGGTCAG；SEQ ID NO：5。
3)实验方案
第一轮PCR:以mMIP3α-F，R1引物扩模板mouseMIP3α质粒(由江苏省弗泰生物科技有限公司提供)；以F1，mEndoglin-R引物扩模板mouse Endoglin(由江苏省弗泰生物科技有限公司提供)；
第二轮PCR:以第一轮PCR产物为模板，以mMIP3α-F，mEndoglin-R为引物做PCR扩增；
pcDNA3.1(+)/Fc(Mouse IgG2a)质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选；
5.实验过程与数据
5.1.基因的获取
1)以mMIP3α-F，R1引物及F1，mEndoglin-R引物，分别做第一轮PCR扩增
PCR体系
PCR反应条件：
95℃预变性5min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环25次；
72℃充分延伸5min；
2)以第一轮PCR扩增产品为模板，mCCL20-F，mFGFR1-R引物为上下游引物，做第二轮PCR扩增(回收)
PCR体系
PCR反应条件：
95℃预变性5min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次；
72℃充分延伸5min；
PCR产物的凝胶回收
使用1.8％的琼脂糖胶对PCR产物进行电泳分离，在紫外透射仪中用手术刀切下含有目的PCR产物的琼脂糖凝胶，然后用江苏省弗泰生物科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物(详细步骤见相关说明书)
详细实验步骤：
在紫外透射仪里，用手术刀切下通过琼脂糖凝胶电泳方式分离开的、含有目的DNA的琼脂糖凝胶(切胶应尽量的小并避免切到其他条带)。切碎该凝胶，置入做好标记的2.0ml离心管中。用含该凝胶的离心管重量减去空白2.0ml离心管重量，得到凝胶重量。按每100mg折换为100ul的方式，确定凝胶体积。向含该凝胶的离心管中，加入3倍凝胶体积的BindingI溶液。50℃水浴，每2分钟进行一次颠倒混合，直至凝胶完全溶解。在此时间内进行吸附柱的柱平衡。
方法如下：
向DNABinding column B吸附柱(杭州莱枫)(该吸附柱已放置于2ml收集管中)中加入500ul平衡液，12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
将凝胶液转移至吸附柱中，室温放置2分钟。12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
向吸附柱中加入600ul已加好无水乙醇的漂洗液washing,12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
在此时间内将洗脱用的超纯水50℃水浴预热。
12000rpm离心2分钟,以彻底去除吸附柱中残余漂洗液。
将吸附柱置于干净的已做好名称标记的1.5ml离心管中，向柱膜中央悬空滴加30-50ul预热好的超纯水，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟，丢弃吸附柱，回收完毕。
使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测
5.2目标质粒的构建及筛选、鉴定
具体内容如下(附实验图片)：
1)LB培养基制备
液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入950ml去离子水溶解后，用5mol/LNaOH调至pH 7.2，最后加水至1000ml，分装后10磅高压灭菌20min。
固体培养基：琼脂粉1.5g，溶于100ml LB液体培养基中，10磅高压灭菌20min。
2)目的基因片段和质粒的酶切
常规碱裂解法小抽目标质粒，以QIAquickPCR纯化试剂盒按说明书操作。
将纯化的目的片段和pcDNA3.1(+)/Fc(Mouse IgG2a)分别按如下反应体系进行酶切反应：
将上述体系置37℃水浴6h，然后65℃，15min灭活限制性内切酶。酶切产物用江苏省弗泰生物科技有限公司的凝胶回收试剂盒分别做凝胶回收纯化，10g/L琼脂糖电泳鉴定后，以紫外分光光度计定量两种双酶切产物的量。
质粒和目的基因片段的连接
将上述的酶切目的片段产物和pcDNA3.1(+)/Fc(Mouse IgG2a)按如下反应体系进行连接反应：
连接反应体系置于4℃12h后，以65℃，15min灭活连接酶。
4)制备新鲜感受态细菌及转化
接种E coli DH5α单菌落于1.5ml LB培养基，37℃培养过夜250rpm；转种1ml过夜培养菌液于40ml LB，37℃培养至细菌密度OD 600为0.4，取1ml菌液至1.5ml离心管，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；加500μl 75mM CaCl2混匀，冰浴30min；4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；加100μl 75mM CaCl2重新混匀，此即为新鲜的感受态细菌。另取1.5ml离心管，加连接反应液5μl，再加50μl新鲜感受态细菌，混匀，冰浴30min；42℃水浴100s，再冰浴2min；加600μl LB，37℃1h后，取100μl涂布于含100μg/ml Amp的LB平皿，37℃培养过夜。
5)重组质粒PCR鉴定
在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定。PCR反应体系如下：
以上体系先94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸120sec，30个循环，最后72℃延伸5min。所得产物以1.2％琼脂糖电泳检测。
重组质粒QC鉴定
上述PCR产物阳性之克隆移入3mL LB液体培养基中，于37℃恒温振荡细菌摇床中250rpm培养12小时。小量抽取质粒后，按如下反应体系进行PCR反应：
PCR体系
ddH2O 41ul
10×PCR Buffer 5ul
dNTP(2.5mM each) 1ul
mCCL20-F(20mM) 0.5ul
mEndoglin-R(20mM) 0.5ul
Pfu高保真DNA聚合酶(2.5U/μl) 1ul
阳性克隆质粒 1ul
共计 50ul
PCR反应条件：
95℃预变性5min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次；
2)上述PCR产物阳性之克隆小量抽取质粒后，按如下反应体系进行酶切反应：
混匀，5000rpm稍离心后，37℃水浴2h后，65℃水浴灭活AflII、XbaI15min。用含终浓度为50μg/ml溴化乙锭(EB)的1.2％琼脂糖制胶，分别取DNA Marker、酶切产物后，100v电压电泳30min后观察结果。
5.3阳性克隆寄送苏州金唯智生物科技有限公司测序，结果正确。
二、蛋白生产实验
1.1、细胞传代
1.1.1培养液配置
根据不同细胞配置相应的培养液，加入一定量的FBS，血清浓度可视细胞状态和传代次数做相应调整。
1.1.2细胞的消化与传代
取出处于对数生长期的细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化，镜下可见细胞漂浮并分散后，加入适量含血清的培养基终止消化，细胞吹散后加入离心管中，1000rpm离心4min。弃上清，轻轻滑动离心管，使底部细胞沉淀飘起。加入适量体积的培养液吹打细胞使其分散均匀，将细胞悬浮液转入培养皿中，摇匀，置于CO2培养箱中培养。
1.2、细胞瞬时转染
1.2.1待转染细胞的准备
将正处于对数生长期细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化，镜下可见细胞漂浮并分散后，加入适量含血清的培养基终止消化，细胞吹散后加入离心管中，1000rpm离心4min。弃上清，轻轻滑动离心管，使底部细胞沉淀飘起。根据细胞计数结果，加入相应体积的含血清培养液，使细胞密度在2.5*105个/ml。将密度为2.5*105个/ml的细胞液加入到10cm培养皿中，每平皿10ml。将平皿放入37℃培养箱培养，当细胞贴壁90-95％时进行转染(培养16-20h)。
1.2.2转染试剂的准备
1.2.2.1将脂质体、DNA、培养液置于15～25℃环境中20分钟。
1.2.2.2取8μg DNA加入到1ml培养液中，用涡旋混合仪震荡2-3秒混匀。
1.2.2.3按照最适比例(转染试剂：DNA为5:2)向DNA溶解液中加入20ul转染试剂。1.2.2.4漩涡震荡转染混合液2-3秒，使其充分混匀后15～25℃环境中孵育20分钟。
1.2.3细胞转染
用移液器轻柔吹打转染液(1ml)，将混匀后的转染液加入到10cm培养皿中，轻轻摇匀，37℃培养箱培养6小时后，弃去培养皿中的培养基，重新加入20mL新鲜培养基。
1.2.4上清收集
待培养皿中培养基变黄后(约48小时后)，取样检测蛋白表达量(见表1)。每隔24小时取10ml上清，补加10ml新鲜培养基，转染后第4-6天，每隔24小时取15ml上清，补加15ml新鲜培养基。取样10-12天后，结束上清收集。
1.2.5细胞上清的离心
用500mL平底离心瓶7500rpm，4℃，离心15min，将上清倒出，收集上清，过滤。
1.3、上清上ProteinA柱与纯化
1.3.1上清过ProteinA柱前准备
1.3.1.1上清收集后及时离心，用0.22um滤膜过滤，根据蛋白等电点加入适量Tris8.0调pH至7.0-7.4，且上清PH值至少偏离蛋白等电点一个pH值，确保上清pH值远离蛋白等电点又在层析柱最佳结合目的蛋白的pH范围内。
1.3.1.2根据上清的培养方式选择纯化柱的类型，瞬时转染上清选择GE预装柱。
1.3.1.3处理、平衡柱子：将软管的进液端插入1X PBS，用15倍柱体积的PBS处理柱子。
1.3.2上清过Protein A柱
1.3.2.1将软管的进液端插入装有细胞上清液的蓝盖瓶最底端，柱子的出液连接废液筒，在蓝盖瓶、软管，柱子及废液筒上做好对应的标记。调节蠕动泵至合适的转速，过亲和层析柱。
1.3.2.2过柱结束前从柱子的出液口续取1ml液体，废液筒中取1ml废液做ELISA检测，废液中有一定量蛋白(0.5mg以上)仍需再过柱。
1.3.3洗脱
1.3.3.1上样结束后，用平衡液(一般为1X PBS)平衡柱子，洗掉一部分杂蛋白，直至洗脱液加入到蛋白测定液中不变蓝为止，平衡液的PH值偏离蛋白的等电点。
1.3.3.2进液端换上pH 3.4的柠檬酸洗脱液，先空走一段，排除管内气泡后再接上层析柱顶端接头。用蛋白测定液检查是否有蛋白流出，若测定液显蓝色，开始收集蛋白。蛋白收集管中加入一定量的Tris8.0缓冲液，调节蛋白PH至弱碱环境，但不接近蛋白等电点。当蛋白测定液不再变蓝后，结束收集。
1.3.4蛋白透析
1.3.4.1将洗脱下的目的蛋白放透析袋中，再放入含1xPBS缓冲液的烧杯中，烧杯置磁力搅拌器上，4℃透析，6小时后，换新的1x PBS再透析6小时。
1.3.4.2透析结束后,用无菌吸头吸取蛋白至离心管中，管子做好标记。取样检测SDS-PAGE(见表2)
1.3.5洗脱后柱子处理
1.3.5.1用5倍柱体积甘氨酸溶液(pH2.5)洗脱其余蛋白，蛋白测定液不再变蓝后换5倍柱体积Tris溶液(PH8.0)冲洗柱子
1.3.5.2用10倍柱体积的平衡液(1X PBS)平衡柱子，最后用5倍柱体积的20％ET封存层析柱。
2.4MIP3α-endoglin Fc融合蛋白在293T细胞中的表达
取瞬转培养上清，用双抗夹心法ELISA检测试剂盒做检测，邻苯二胺显色后经酶标仪读数测定表明本发明构建的真核表达载体能够在293T细胞中的表达，表达浓度大约10mg/L。
三、FITC标记蛋白流程
1.1将待交联的蛋白(浓度≥1mg/ml)对交联反应液透析三次(4℃)，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56gNaHCO3，1.06gNa2CO3，7.36gNaCl，加水定容至1L。
1.2将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
1.3按P:F(蛋白质:FITC)＝1mg:150ug的比例将FITC缓慢加入于蛋白溶液中，边加边轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处4℃反应8hr。
1.4加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2hr。
1.5将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
1.6交联物的鉴定蛋白浓度(mg/ml)＝[A280–0.31×A495]/1.4F/P比例:3.1×A495/[A280–0.31×A495]，该值应介于2.5-6.5之间。
1.7FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃暗处保存。
图3是本发明实施例提供的MIP3α-endoglin目的基因的扩增示意图；
以第一轮PCR产物为模版，以mMIP3α-F，mEndoglin-R为引物做PCR扩增之后使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。由图3可知获得大小约2024bp特异性性DNA片段，与理论值相符，表明成功获得MIP3α-endoglin Fc目的基因序列。
图4是本发明实施例提供的重组质粒PCR鉴定示意图；
在培养的转化菌平板上随机挑取大小均匀一致的克隆进行PCR反应，所得产物以1.2％琼脂糖电泳检测，电泳结果如图4所示，1，2，4-6泳道表明5个阳性克隆均扩增得到大小约为2024bp特异性DNA分子片段，初步表明重组质粒构建成功。
图5是本发明实施例提供的重组质粒酶切和测序鉴定示意图；
PCR阳性克隆进行小量抽取质粒后，分别进行PCR鉴定和AflII和XbaI双酶切鉴定，鉴定结果如图5所示：泳道2表明获得大小约2024bp的特异性DNA片段，泳道3酶切下来的片段大小和预计片段大小一致，表明重组质粒构建成功。阳性克隆寄送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序的序列与所预测的序列一致，进一步说明重组载体构建成功。
图6是本发明实施例提供的MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的纯化及复性示意图；
MIP3α-endoglin Fc重组质粒阳性克隆转染293T细胞中进行表达，经ProteinA层析柱分离纯化，结果如下图6所示。经变性电泳和非变性电泳分离鉴定，本发明成功地分离纯化了MIP3α-endoglin Fc融合蛋白。
本发明实施例提供的MIP3α-endoglin Fc融合蛋白在293T细胞中的表达浓度；
取瞬转培养上清，用双抗夹心法ELISA检测试剂盒做检测，邻苯二胺显色后经酶标仪读数测定表明本发明构建的真核表达载体能够在293T细胞中的表达，表达浓度大约10mg/L。
本发明实施例提供的MIP3α-endoglin Fc融合蛋白血浆半衰期测定；
给4只10周龄大的C57BL/6小鼠尾静脉注射小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白，每只给药0.1毫克，在如下时间点交替眶后取血：30分钟，2小时，4小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时。血样用特异性ELISA检测小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的浓度。结果显示MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的半衰期长达28小时。
图7是本发明实施例提供的体外发现MIP3α-endoglin Fc融合蛋白具有趋化募集树突状细胞作用示意图；
1)树突状细胞的获取
使用淋巴细胞分离液(GE公司)从健康人外周血中分离单个核细胞，用无血清免疫细胞培养基(Takara公司)将细胞密度调整到1x106/ml接种至培养皿中。5％二氧化碳37℃静置培养2小时，晃动培养皿，吸去未贴壁细胞，加入无血清培养基、1000U/ml的GM-CSF、以及1000U/ml的IL-4继续培养，每两天换液一次，培养6天。
2)细胞迁移实验检测MIP3α-Fc融合蛋白对树突状细胞的趋化作用
使用Transwell小室进行细胞迁移实验。将上述树突状细胞消化后计数，并调整密度至5×105/ml，取细胞悬液100μl加入Transwell上室，下室加入500μl含2ug/ml的MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的无血清培养液，对照组下室为不加MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的空白无血清培养基，将24孔板放置37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。用棉签擦去上室内的细胞，移去Transwells，倒置，风干，24孔板中加入500ul含0.1％结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在染料中，37℃30min后取出，PBS清洗,照相(放大倍数200X)。结果显示，MIP3α-endoglin Fc融合蛋白对树突状细胞有很好的趋化募集作用(图7)。
图8是本发明实施例提供的体内发现MIP3α-endoglin Fc融合蛋白具有肿瘤组织特异性和血管靶向性示意图；
建立4T1乳腺癌模型，待肿瘤长到体积约1000mm3经尾静脉注射药物到达峰浓度后处死小鼠取出肿瘤组织进行冰冻切片并行免疫荧光染色观察MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的肿瘤血管靶向活性。结果显示，MIP3α-endoglin Fc融合蛋白作为疫苗可以特异性识别肿瘤组织中的微血管(肿瘤微血管表面见红色荧光信号沉积)(图8-A)，其它组织成份没有明显荧光信号；对照抗体则没将肿瘤微血管染色(图8-B)，说明本发明制备的MIP3α-endoglinFc融合蛋白具有较高的肿瘤组织特异性和血管靶向性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南医学院
<120> 一种小鼠MIP3α-endoglin Fc 融合蛋白的制备方法及其用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2718
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttaagcggc cgccaccatg gcctgcggtg gcaagcgtct gctcttcctt gctttggcat 60
gggtactgct ggctcacctc tgcagccagg cagaagcagc aagcaactac gactgttgcc 120
tctcgtacat acagacgcct cttccttcca gagctattgt gggtttcaca agacagatgg 180
ccgatgaagc ttgtgacatt aatgctatca tctttcacac gaagaaaaga aaatctgtgt 240
gcgctgatcc aaagcagaac tgggtgaaaa gggctgtgaa cctcctcagc ctaagagtca 300
agaagatggg tggaggttcg ggtggaggtt caggtggagg ttctgaaaga gtcggctgtg 360
atctacagcc tgtggacccc acaaggggtg aggtgacgtt taccaccagc caggtctccg 420
agggctgtgt agctcaggct gccaatgctg tgcgtgaagt ccacgttctc ttcctggatt 480
ttcccggaat gctgtcacat ctggagctga ctcttcaggc atccaagcaa aatggcacgg 540
agacccagga ggtgttcctg gtcctcgttt cgaacaaaaa tgtcttcgtg aagttccagg 600
ccccggaaat cccattgcac ttggcctacg actccagcct ggtcatcttc caaggacagc 660
caagagtcaa catcacagtg ctaccatccc ttacctccag gaaacagatc ctcgactggg 720
cagccaccaa gggcgccatc acctcgatag cagcactgga tgacccccaa agcatcgtcc 780
tccagttggg ccaagaccca aaggcaccat tcttgtgctt gccagaagct cacaaggaca 840
tgggcgccac acttgaatgg caaccacgag cccagacccc agtccaaagc tgtcgcttgg 900
aaggtgtgtc tggccacaag gaggcctaca tcctgagaat cctgccaggt tctgaggccg 960
ggccccggac ggtgaccgta atgatggaac tgagttgcac atctggggac gccattctca 1020
tcctgcatgg tcctccatat gtctcctggt tcatcgacat caaccacagc atgcagatct 1080
tgaccacagg tgaatactcc gtcaagatct ttccaggaag caaggtcaaa ggcgtggagc 1140
tcccagacac accccaaggc ctgatagcgg aggcccgcaa gctcaatgcc agcattgtca 1200
cctcctttgt agagctccct ctggtcagca atgtctccct gagggcctcc agctgcggtg 1260
gtgtgttcca gaccacccct gcacccgttg tgaccacacc tcccaaggac acatgcagcc 1320
ccgtgctact catgtccctg atccagccaa agtgtggcaa tcaggtcatg actctggcac 1380
tcaataaaaa acacgtgcag actctccagt gcaccatcac aggcctgact ttctgggact 1440
ccagctgcca ggctgaagac actgacgacc atcttgtcct gagtagcgcc tactccagct 1500
gcggcatgaa agtgacagcc catgtggtca gcaatgaggt gatcatcagt ttcccgtcag 1560
gctcaccacc acttcggaaa aaggtacagt gcatcgacat ggacagcctc tccttccagc 1620
tgggcctcta cctcagcccg cacttcctcc aggcatccaa caccatcgaa ctaggccagc 1680
aggccttcgt acaggtgagc gtgtctccat tgacctctga ggtcacagtc cagctagata 1740
gctgccatct ggacttgggg cccgaagggg acatggtgga actcatccag agccgaacag 1800
ccaagggcag ctgtgtgacc ttgctgtctc caagccctga aggtgaccca cgcttcagct 1860
tcctcctccg ggtctacatg gtgcccacac ccaccgctgg caccctcagt tgcaacttag 1920
ctctgcgccc tagcaccttg tcccaggaag tctacaagac agtctccatg cgcctgaaca 1980
tcgtcagccc tgacctgtct ggtaaagggg atcccagagg gcccacaatc aagccctgtc 2040
ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc atcttccctc 2100
caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt gtggtggtgg 2160
atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac 2220
acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg gtggtcagtg 2280
ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca 2340
acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg tcagtaagag 2400
ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa caggtcactc 2460
tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg accaacaacg 2520
ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat ggttcttact 2580
tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat agctactcct 2640
gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc tcccggactc 2700
cgggtaaatg agtctaga 2718
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atatccttaa gcggccgcca ccatggcctg cggtggcaag cg 42
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcacagcc gactctttca gaacctccac ctgaacctcc acccgaacct ccacccatct 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatgggtgg aggttcgggt ggaggttcag gtggaggttc tgaaagagtc ggctgtgatc 60
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atatgggatc ccctttacca gacaggtcag 30

Claims (7)

1.一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法包括：
步骤一，第一轮PCR:以mMIP3α-F，R1引物扩模板mouse MIP3α质粒；以F1，mEndoglin-R引物扩模板mouse Endoglin；
步骤二，第二轮PCR:以第一轮PCR产物为模板，以mMIP3α-F，mEndoglin-R为引物做PCR扩增；
步骤三，pcDNA3.1(+)/Fc质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选。
2.如权利要求1所述的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环25次；72℃充分延伸5min。
3.如权利要求1所述的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次；72℃充分延伸5min。
4.如权利要求1所述的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR产物的凝胶回收包括：
向DNA Binding column B吸附柱中加入500ul平衡液，12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
将凝胶液转移至吸附柱中，室温放置2分钟；12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
向吸附柱中加入600ul已加好无水乙醇的漂洗液washing,12000rpm离心30秒，倒净收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
在此时间内将洗脱用的超纯水50℃水浴预热；
12000rpm离心2分钟,以彻底去除吸附柱中残余漂洗液；
将吸附柱置于干净的已做好名称标记的1.5ml离心管中，向柱膜中央悬空滴加30-50ul预热好的超纯水，室温放置2分钟；12000rpm离心1分钟，丢弃吸附柱，回收完毕；
使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
5.如权利要求1所述的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组质粒PCR鉴定先94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸120sec，30个循环，最后72℃延伸5min。所得产物以1.2％琼脂糖电泳检测。
6.如权利要求5所述的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组质粒QC鉴定的PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次。
7.一种由权利要求1所述小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法制备的小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白，其特征在于，所述小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白为MIP3α-Endoglin和Fc的二聚体融合蛋白，MIP3α-Endoglin与Fc之间通过免疫球蛋白的铰链区或柔性肽段连接。
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