CN108359680A - 含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用 - Google Patents

含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108359680A
CN108359680A CN201810108127.3A CN201810108127A CN108359680A CN 108359680 A CN108359680 A CN 108359680A CN 201810108127 A CN201810108127 A CN 201810108127A CN 108359680 A CN108359680 A CN 108359680A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human cytomegalovirus
containing human
genetic engineering
engineering bacterium
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810108127.3A
Other languages
English (en)
Inventor
朱桦
何玲玲
刘奋勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
University of Jinan
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201810108127.3A priority Critical patent/CN108359680A/zh
Publication of CN108359680A publication Critical patent/CN108359680A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/088—Varicella-zoster virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。该重组质粒通过将人巨细胞病毒的UL146基因插入大肠杆菌克隆表达载体pET32a(+)中，获得重组载体pET32a(+)‑UL146，然后将其转化入原核表达工程菌BL21(DE3)中，获得含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌。利用该工程菌表达获得对应的UL146重组蛋白，该融合蛋白可用于制备针对HCMV UL146基因的抗体，且可以用于研究UL146基因的功能，为进一步研究UL146的功能及其分子机制提供了基础。

Description

含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒、基因工程菌及其 应用
技术领域
本发明涉及生物学领域，特别涉及一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重 组质粒、基因工程菌及其应用。
背景技术
UL146基因是人巨细胞病毒(HCMV)中的一个开放性阅读框(ORF)， 人巨细胞病毒基因组是疱疹病毒中最大的基因组，含有200多个阅读框，基因 组中的大部分基因都是高度保守的，但是也存在高度多态性的基因，即其基因 和核酸序列在不同病毒株之间有差异性，它们编码一些膜相关蛋白和分泌蛋白 如gB、UL144、UL146及UL147基因。
HCMV UL146基因长约345～360bp，UL146基因在HCMV基因组中存在 于一个高度变异的区域，该区域UL146翻译的起始位点之前开始并贯穿与之毗 邻的UL147的翻译起始位点，由于大多数情况下核苷酸的变化是非同义的，因 此这种基因序列的变异性决定了其氨基酸序列的多态性，UL146在HCMV的各 临床株中氨基酸序列高度变异，但也存在少数高度保守的氨基酸。Arav-Boger 等人经过系统树分析发现UL146在不同HCMV病毒株中的变异是随机发生的， 它发生在UL146整个基因中，虽然ULL146的变异在整个基因中随机发生，但是在其发生趋化因子功能区的氨基酸序列(ELR)确是高度保守的，这说明该基 因对于HCMV是十分重要的。
HCMV UL146的ORF约115～120个氨基酸，编码大小约13KD的小分子 蛋白，Penfold等人通过序列比对分析及趋化性实验发现来源于Toledo的趋化因 子vCXCL-1与宿主细胞因子白细胞介素-8(IL-8)序列类似，且具有趋化因子 的特征性结构如信号肽、Cys残基及趋化因子与趋化因子受体结合及嗜中性粒细 胞激活所必须的ELR基序，同时还具有趋化因子的某些功能如诱发钙流通、诱 导嗜中性粒细胞的趋化性及嗜中性粒细胞的脱粒等功能，因此认为UL146编码 的是一个类IL-8的病毒趋化因子，它是第一个被发现的病毒α趋化因子 vCXCL-1。趋化因子是一群参与免疫调控的小分子蛋白，可吸引白细胞到达感 染部位。根据其结构的不同，将其分为四类：C,CC,CXC和CX3C。HCMV可 通过与趋化因子结合或表达趋化因子类类似物蛋白抑制其功能。例如：US28通 过与CC趋化因子结合抑制宿主的免疫应答；UL128是五聚体复合物 ((gH/gL/UL128-UL130-UL131A)中的一员，编码一种CC趋化因子而影响组 织嗜性。vCXCL-1由具有高度多态性的HCMV UL146基因编码，且这种变异大 多是错义突变，因此不同HCMV病毒株的vCXCL-1具有差异性。Heo等人进行 研究发现不同的vCXCL-1其功能如引发嗜中性粒细胞的迁移，与嗜中性粒细胞 表面受体结合的亲和力及vCXCL-1对信号通路的响应等有所差异，说明 vCXCL-1的多态性影响了vCXCL-1与受体结合的亲和力及嗜中性粒细胞的激 活。CXCR1与CXCR2受体均可在嗜中性粒细胞表面表达，是常见的趋化因子 受体，二者氨基酸序列有77％同一性，Lu¨ttichau研究发现vCXCL-1不仅可以 与CXCR2结合还可与CXCR1结合并引发嗜中性粒细胞的迁移，但是与CXCR1 结合的亲和力较低。Yamin等人经过研究发现vCXCL-1不仅可以与CXCR1和 CXCR2结合，还能与自然杀伤(NK)细胞表面表达的CX3CR1结合，且能通 过与CXCR2结合优先吸引嗜中性粒细胞而不是在免疫过程中起重要作用的NK 细胞。
以上研究都表明HCMV UL146基因对于HCMV的在体内的扩散及传播有 着十分重要的作用，所以进一步研究UL146作用的分子机制是十分必要的。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含有人巨细 胞病毒UL146基因的重组质粒。
本发明的另一目的在于提供含有上述人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的 基因工程菌。
本发明的又一目的在于提供上述含有巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基 因工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含有人巨细胞病毒UL146基因 的重组质粒，含有UL146基因片段，其中，UL146基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
所述的含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒的构建方法，通过常规方 法将UL146基因片段插入到pET32a(+)载体中获得。
一种含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌，转化有上述含 有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒。
所述的基因工程菌优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌DH5α或 BL21(DE3)。
所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的构建方法， 将上述含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒转化入原核表达工程菌中，得 到含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌；其构建方法优选为包 括如下步骤：
(1)以HCMV BAC Towne文库作为模板设计针对UL146基因的引物序列， 引入SalI和BamHI两个酶切位点；
(2)以HCMV BAC Towne文库为模板PCR扩增UL146基因；
(3)对步骤(2)中扩增得到的UL146基因进行电泳并回收UL146DNA；
(4)将步骤(3)中回收的UL146DNA和载体质粒pET32a(+)进行SalI和 BamHI双酶切，并进行纯化；
(5)将步骤(4)中纯化后的产物进行连接，使UL146目的基因和载体质 粒pET32a(+)相连接；
(6)将(5)中连接后的产物转化大肠杆菌感受态细胞中，得到含有人巨 细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌。
步骤(3)中所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的构建方法， 在步骤(5)之后还包括所得到的重组质粒进行双酶切鉴定阳性克隆并测序的步 骤。
所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌在UL146重组 蛋白制备中的应用。
一种UL146重组蛋白的制备方法，将上述含有人巨细胞病毒UL146基因重 组质粒的基因工程菌经过活化培养和发酵培养，再加入诱导剂IPTG进行诱导表 达，得到UL146重组蛋白；优选为：将上述工程菌接种至含有氨苄青霉素(Amp) 抗性的LB液体培养基中进行活化培养，然后转接到含有氨苄青霉素抗性LB液 体培养基中进行发酵培养，再加入诱导剂IPTG进行诱导表达，得到UL146重 组蛋白。
所述的诱导表达的条件优选为：在20℃诱导10h。
所述的IPTG的工作浓度为0.5mM。
所述的UL146重组蛋白的制备方法，还包括将获得的UL146重组蛋白进行 纯化的步骤。
所述的纯化为采用镍柱亲和层析进行纯化，组氨酸标签是纯化标签。
所述的UL146重组蛋白的制备方法，还包括将获得的UL146重组蛋白进行 定量的步骤：采用BCA法进行蛋白定量。
所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌在制备人巨细 胞病毒UL146蛋白多克隆抗体中的应用；该工程菌可以表达出带有组氨酸标签 的融合蛋白，可应用亲和层析纯化制备多克隆抗体。
所述的重组蛋白含6×His组氨酸标签。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的目的是构建一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒工程 菌，用于研究HCMV扩散和传播的分子机制，为HCMV治疗靶点提供基础。
2、本发明提供了一种包含人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的工程菌，通 过将人巨细胞病毒的UL146蛋白基因插入大肠杆菌克隆表达载体pET32a(+)中， 获得重组载体pET32a(+)-UL146，然后将其转化入原核表达工程菌BL21(DE3) 中，获得重组质粒表达菌BL21(DE3)-pET32a(+)-UL146，并进一步研究了该 重组蛋白在BL21(DE3)中的表达情况，并对重组蛋白在原核中的表达量进行了 条件优化；再利用Western blot方法鉴定诱导的重组蛋白以及采用镍柱亲和层析 的方法分离纯化带有His标签的重组蛋白；最后采用BCA发对纯化的重组蛋白 进行定量。在本发明的基础上可以制备针对UL146基因的抗体或者用于体外研 究UL146的功能。
附图说明
图1是pET32a(+)-UL146重组质粒构建示意图。
图2是UL146基因扩增结果图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为UL146 PCR扩增产物。
图3是pET32a(+)-UL146重组表达载体的双酶切结果图；其中，泳道M为 DNAmarker；泳道1为pET32a(+)-UL146重组表达载体经限制性内切酶SalI和 BamHI双酶切；泳道2为pET32a(+)-UL146重组表达载体未经酶切。
图4是SDS-PAGE分析重组蛋白原核诱导表达的温度优化结果图；其中，泳 道M为蛋白marker；泳道1，3，5分别为20℃、30℃、37℃时未加诱导剂前BL21(DE3) 中各蛋白的表达情况；泳道2，4，6分别为20℃、30℃、37℃时加诱导剂后 BL21(DE3)各蛋白的表达情况。
图5是SDS-PAGE分析重组蛋白原核诱导表达的IPTG浓度优化结果图；其中， 泳道M为蛋白marker；泳道1，2，3和4分别为加入IPTG浓度分别为0.2Mm， 0.5mM，1.0Mm，2.0mM诱导后BL21(DE3)菌株中蛋白的表达情况；泳道5，6， 7，8泳道分别为加入诱导剂前BL21(DE3)菌株中蛋白的表达情况。
图6是SDS-PAGE分析重组蛋白原核诱导表达的时间优化的结果图；其中泳 道M为蛋白marker；泳道1～9分别为诱导0h，2h，4h，5h，6h，8h，10h，12h， 24h时BL21(DE3)菌株中蛋白的表达情况。
图7是SDS-PAGE分析重组蛋白的表达场所的结果图；其中泳道M为蛋白 marker；泳道1和2为培养上清；泳道3和4为细胞裂解液；泳道5和6为可溶性蛋白， 泳道7和8为指包涵体；泳道1，3，5，7为未经IPTG诱导的BL21(DE3)菌株中蛋 白的表达；泳道2，4，6，8为IPTG诱导的BL21(DE3)菌株中蛋白的表达。
图8是Western blot鉴定重组蛋白的表达场所的结果图。
图9是SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白的纯化结果图；其中，泳道M为蛋 白marker，泳道1为包涵体溶液；泳道2和3为穿出蛋白；泳道4为纯化后蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此。
实施例1
一、重组质粒构建
(1)UL146基因引物设计
根据已发表在genebank上的HCMV BAC towne的基因序列(GenBank:FJ616285.1)，经Primer Primier 5.0设计PCR引物。扩增的引物长度为357bp (核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其蛋白翻译产物如SEQ ID No：2所示)。
设计好的引物如下表：
表1 UL146引物设计表
注：F(上游引物)；R(下游引物)；下划线处为相应的酶切位点。
(2)UL146基因PCR
以HCMV BAC Towne文库(参考文献：Human embryonic lung fibroblaststreated with artesunate exhibit reduced rates of proliferation and humancytomegalovirus infection in vitro)为PCR的模板，在以下反应体系中进行PCR：
表2 PCR反应体系表
组分 体积(μL)
5×Primer STAR Buffer 10
dNTP Mixture 4
上游引物 2
下游引物 2
模板(Template) 1
Primer STAR HS DNA polymerase 0.5
ddH2O 30.5
总体积 50
表3 PCR反应条件设置表
(3)PCR产物经2％的琼脂糖凝胶分析，并通过胶回收试剂盒Gel Extraction kit(OMEGA Bio-Tek，美国)回收PCR产物。
PCR产物回收步骤如下：
①PCR产物经电泳后，在紫外条件下切取含目的条带的凝胶置于干净的1.5 mL的EP管中；
②在EP管中加入与凝胶等体积的XP2溶液；
③将混有XP2溶液的凝胶块的1.5mL的EP管置于水浴锅中，57℃加热， 每隔2～3min颠倒混匀，直至凝胶块完全融化即可；
④待完全融化后的凝胶冷却，便可将其斡旋混匀并短暂离心，最后将其加 入事先组装好的硅胶柱，室温，10000×g，离心1min，倾倒收集管中的废液；
⑤再加入300μL XP2溶液到硅胶柱中，室温10000×g离心1min后，将收 集管中的液体倒掉；
⑥用700μL SPW洗涤溶液洗涤硅胶柱，室温10000×g离心1min，将收集 管中的液体倒掉；
⑦重复6步骤一次；
⑧空甩硅胶柱，室温12000×g离心2min，去除多余的SPW洗涤溶液；
⑨取出硅胶柱并将其放入到灭菌的1.5mL EP管中，室温放置2min后，向 硅胶柱中加入30μL事先已加热到65℃无菌ddH20，室温静置1min后，12000×g 离心1min，取出已废弃的硅胶柱，EP管中收集的液体即为目的DNA溶液；
⑩检测回收的目的DNA浓度及纯度，样品放于-20℃保存。
实验结果：PCR扩增产物如图2所示，与预期大小结果一致，目的基因片 段大小为357bp。
(4)质粒抽提
①抽质粒前晚，从-20℃冰箱取出含有pET32a(+)质粒(质粒购于优宝生物 有限公司)的DH5α菌种，吸取40μL，接种于含氨苄青霉素(氨苄青霉素浓度 为100μg/mL)的4mL LB液体培养基中，37℃培养箱中250rpm/min培养12～ 16h；
②第二天，取出过夜培养好的菌液，并将菌体加到1.5mL EP管中，12000×g 室温离心1min，弃上清，重复步骤，将5mL菌液全部收集到1.5mL EP管中；
③吸净多余的上清后，加250μL solution I到EP管中，用移液器轻轻吹打 菌体沉淀，待菌体重悬后，放于涡旋振器上，使其完全混匀；
④再加入250μL solution II，轻轻地上下颠倒混匀数次，颠倒时间要把握好， 控制在2min～5min之间，颠倒完之后，液体一般会透明澄清；
⑤最后加入350μL solution III，轻轻地上下颠倒混匀数次，至有白色沉淀形成，颠倒混匀次数不能过多，紧接着放于小型离心机中，室温，13000×g离心 10min；
⑥离心结束后，将移液枪把上清液转移到已标记好的硅胶柱中，硅胶柱放 进2mL的离心管里，勿将白色沉淀物吸入硅胶柱中，放于小型离心机中，室温 10000×g，离心1min；
⑦倒掉收集管中的废液，吸取500μL HB溶液，加入到硅胶柱中，室温 10000×g离心1min；
⑧倒掉收集管中的废液，加700μL DNA Wash Buffer到硅胶柱中，(请先 检查DNAWash Buffer是否已加入无水乙醇！)室温10000×g离心1min；
⑨重复8步骤一次；
⑩空甩硅胶柱，室温13000×g离心2min，去除多余的DNA Wash Buffer；
取出硅胶柱将其放入到灭菌的1.5mL EP管中，向硅胶柱中加入30μl～ 50μL事先已加热到65℃无菌ddH20，室温静置1～2min后，12000×g离心1min， 取出已废弃的硅胶柱，EP管中液体即为目的DNA溶液；
取1μL样品检测抽提好质粒的浓度及纯度，其余样品用于后续实验或放 于-20℃保存。
(5)双酶切
将抽提好的质粒与回收的PCR产物于37℃恒温水浴40min进行双酶切， 双酶切体系如下表：
表4 PCR产物双酶切体系表
完成酶切反应后的质粒和PCR产物需进行纯化，用产物纯化试剂盒回收双 酶切产物，纯化步骤如下：
①根据双酶切体系加入4～5倍的结合液CP，充分混匀；
②将上一步所得溶液加入吸附柱EC中，室温放置1min，10000×g，离心1 min倒掉收集管中的废液；
③加入700μL漂洗液Wash Buffer(先检查是否已加入无水乙醇)，10000×g， 离心1min，弃掉废液；
④重复3步骤一次；
⑤将吸附柱EC放回收集管中，10000×g，离心1min，尽可能除去漂洗液， 以免残留乙醇抑制下游反应；
⑥取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30～ 50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中加热效果更好)，室 温放置2min，13000×g离心1min。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重 新加入吸附柱中，离心1min。取出已废弃的硅胶柱，EP管中手记的液体即为 目的DNA溶液；
⑦检测回收的目的DNA浓度及纯度，以更好的用于后续实验。样品放于 -20℃保存。
(6)酶连接
将双酶切回收后的质粒和目的DNA在16℃连接16h以上，酶连接反应体 系如下：
表5连接反应体系表
(7)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
①做DH5α感受态前一晚，从-20℃取出空载DH5α菌种，按体积比1：100 进行接种，37℃恒温摇床250rpm/min活化12～16h；
②第二天，将活化好的DH5α空菌重新按体积比1：100进行接种至新鲜的 4mL LB培养基中，置于37℃恒温摇床中，转速为250rpm/min培养2～3h至 OD600值约0.5±0.1时即可；
③当OD600达到规定要求后，将菌液分装至1.5mL EP管中，每管1mL， 置于冰上冰浴10min；
④将冷却好的菌液置于预冷的冷冻离心机中，4℃，4000rpm，离心5min 后尽可能弃尽上清；
⑤加入1mL预冷的0.1M的CaCl2重悬菌体，再冰浴30min；
⑥4℃，4000rpm，离心5min后尽可能弃尽上清(可以用灭菌后干燥过的 滤纸将残存液体吸尽)；
⑦加入50μL 0.1M的CaCl2重悬菌体，冰浴0.5h后即可使用，此即为制备 好的DH5α感受态细胞；
⑧将制备好的感受态菌DH5α放在-20℃冻存(一个月内使用完)。
(8)转化
①吸取体积为2.5μL的连接液加入到事先制备好的装有50μL的DH5α感 受态细胞的EP管中，用移液枪轻轻地吹打混匀，吹打混匀后，便放置于冰上， 冰浴30min；
②待冰浴完成后，将加有连接液的感受态放于事先预热好的42℃恒温水浴 锅中，热激90s；
③完成热激后，立马将感受态放置于冰上，冰浴2min；
④冰浴2min后，向EP管中加入500μL室温的LB液体培养基，放于37℃ 恒温振荡培养箱振荡，转速为200rpm，培养50min；
⑤将培养好的菌放于离心机中，室温，6000rpm离心1min，离心结束后， 小心地吸去上清，留约100μL培养基，重悬菌体；
⑥吸取100μL的菌体涂布于事先配制好的加了氨苄青霉素(终浓度为100 μg/mL)抗性的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中，正置15min后，待菌液 完全被吸收，倒置培养，培养时间为12～16h。
(9)双酶切鉴定
①转化完成后第二天，从转化后的含氨苄青霉素抗性的LB平板上挑取克隆 出的单菌落至含有100μg/mL氨苄抗性的LB液体培养基中培养12～16h，通过 质粒抽提试剂盒抽提出重组质粒。
②将抽提得到的重组质粒进行双酶切鉴定，反应体系见下表：
表6重组质粒双酶切反应体系表
组分 体积(μL)
10×FastDigest Buffer 2
重组质粒DNA 6
FastDigest enzyme Sal I 1
FastDigest enzyme Bamh I 1
ddH2O 10
总体积 20
注：酶切反应条件：37℃恒温酶切30min
③双酶切产物经2％的琼脂糖凝胶分析，经凝胶成像系统进行拍照，分析和 保存结果。
(10)重组质粒质粒样品测序
将可以双酶切出目的基因大小片段的质粒样品送公司(生工生物工程(上海) 股份有限公司)测序，将测序结果与GennBank下载的UL146基因序列在NCBI 上进行比对分析。
(11)感受态菌BL21(DE3)的制备，参照(7)。
(12)pET32a(+)-UL146重组质粒转化表达菌BL21(DE3)，参照(8)。
实验结果：pET32a(+)-UL146重组表达载体的双酶切结果如图3所示。
二、UL146重组融合蛋白的原核表达
(1)融合蛋白的原核诱导表达温度优化
①转接已培养好的200μL菌液至新鲜的含有100μg/mL氨苄抗性的20mL LB的150mL锥形瓶中，放于37℃振荡培养至OD600值为0.5～0.8即可；
②OD600值达0.5～0.8时加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，分别置于 20℃、30℃、37℃培养箱中培养，转速为160rpm，振荡诱导5h；
③分别取诱导前和诱导后的菌液1mL，置于小型离心机中，6000rpm离心 10min，弃上清；
④菌体沉淀用1mL PBS洗涤3次，10000rpm离心5min，弃上清；
⑤加入48μL PBS重悬，并加入5×SDS-PAGE loading buffer，置于斡旋振 荡器中混匀，99℃煮沸5～10min，立即置于冰上冷却3min；
⑥进行SDS-PAGE电泳，表达产物通过12％的SDS-PAGE电泳分离，在胶 底部约1cm处时停止电泳，55V 50min，120V约40min。
SDS-PAGE凝胶电泳步骤如下：
①安装垂直式电泳槽；
②配制12％分离胶(重组蛋白大小为35kD左右)见下表：
表7 12％分离胶配制表
混匀后将试剂灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平，凝胶完全聚合 需要30～60min；
③配置5％浓缩胶见下表：
表8 5％浓缩胶配制表
将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将 梳子插入玻璃板间，完全聚合需15～30min；
④待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上；
⑤上样；
⑥电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶的电 压设为55V，分离胶电压设为120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止(约需 2～3h)；
⑦染色：小心将胶从玻璃板中取出，放入考马斯亮蓝染色液中染色，室温 放置4～6h。
⑧脱色：轻轻将胶从染色液中取出，放入脱色液中，放在脱色摇床上，多 次脱色至蛋白带清晰；
⑨凝胶摄像和保存：将完成脱色的凝胶进行摄像，凝胶假如还有其他实验 用途，可暂时保存于7％乙酸溶液或者双蒸水中。
实验结果：SDS-PAGE分析重组蛋白原核诱导表达的温度优化结果如图4 所示，最佳诱导温度为20℃。
(2)融合蛋白的原核诱导表达诱导剂浓度优化
①转接已培养好的300μL菌液至新鲜的含有100μg/mL氨苄抗性的30mL LB的250mL锥形瓶中，放于37℃振荡培养至OD600值为0.5～0.8既可；
②OD600值达0.5～0.8时分别加入终浓度为0.2mM，0.5mM，1.0mM， 2.0mM的IPTG诱导剂，置于20℃培养箱中培养，转速为160rpm，振荡诱导 5h；
③分别取诱导前和诱导后的菌液1mL，置于小型离心机中，6000rpm离心 10min，弃上清；
④菌体沉淀用1mL PBS洗涤3次，10000rpm离心5min，弃上清；
⑤加入48μL PBS重悬，并加入5×SDS-PAGE loading buffer，置于斡旋振 荡器中混匀，99℃煮沸5～10min，立即置于冰上冷却3min；
⑥进行SDS-PAGE电泳，表达产物通过12％的SDS-PAGE电泳分离，在胶 底部约1cm处时停止电泳，55V 50min，120V约40min。
实验结果：SDS-PAGE分析重组蛋白原核诱导表达的IPTG浓度优化结果如 图5所示，最佳诱导剂浓度为0.5mM。
(3)融合蛋白的原核诱导表达时间优化
①转接已培养好的300μL菌液至新鲜的含100μg/mL有氨苄抗性的30mL LB的250mL锥形瓶中，放于37℃振荡培养至OD600值为0.5～0.8既可；
②OD600值达0.5～0.8时分别加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，置于 20℃培养箱中培养，转速为160rpm，分别振荡诱导2h，3h，4h，5h，6h，8 h，10h，12h，24h；
③分别取诱导前和诱导后的菌液1mL，置于小型离心机中，6000rpm离心 10min，弃上清；
④菌体沉淀用1mL PBS洗涤3次，10000rpm离心5min，弃上清；
⑤加入48μL PBS重悬，并加入5×SDS-PAGE loading buffer 12μL，置于斡 旋振荡器中混匀，99℃煮沸5～10min，立即置于冰上冷却3min；
⑥进行SDS-PAGE电泳，表达产物通过12％的SDS-PAGE电泳分离，在胶 底部约1cm处时停止电泳，55V 50min，120V约40min。
实验结果：SDS-PAGE分析重组蛋白原核诱导表达的时间优化结果如图6 所示，最佳诱导时间为10h。
(4)融合蛋白的原核诱导表达场所的确定
①转接已培养好的40μL菌液至新鲜的含有100μg/mL氨苄抗性的4mL LB 的试管中，放于37℃振荡培养至OD600值为0.5～0.8既可；
②OD600值达0.5～0.8时分别加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，置于 20℃培养箱中培养，转速为160rpm，振荡诱导10h；
③分别取诱导前和诱导后的菌液1mL，置于小型离心机中，6000rpm离心 10min，分别得到诱导前后的上清和沉淀，将上清分别置于新的1.5mL EP管中。 在诱导前后的沉淀中分别加入1mL 4℃的PBS(pH＝7.4)重悬，重悬好的菌体 超声破碎。采用超声波破碎仪进行破菌，破菌参数设置为：150W，工作5s停 5s，破碎3～5min至菌液澄清即可；
④将破碎好的菌体重悬液配平置于4℃冷冻离心机中，11000rpm，4℃离心 30min，取上清弃沉淀；
⑤分别取准备好的上清48μL，并加入5×SDS-PAGE loading buffer 12μL， 置于斡旋振荡器中混匀，99℃煮沸5～10min，立即置于冰上冷却3min；
⑥取一部分进行SDS-PAGE电泳，表达产物通过12％的SDS-PAGE电泳分 离，在胶底部约1cm处时停止电泳，55V 50min，120V约40min；
⑦剩余部分进行Western Blot鉴定。
Western Blot步骤如下：
①首先将细胞蛋白经12％SDS-PAGE凝胶电泳进行分离并转移至PVDF膜 上；
②用5％的脱脂奶粉室温封闭1h；
③封闭完的PVDF膜与anti-His鼠抗(1:1000)4℃共孵育过夜；
④用含有1/2000吐温的TBST洗3次，每次20min；
⑤洗后的膜与荧光二抗山羊抗鼠(1:5000)4℃共孵育2～3h；
⑥再用含有1/2000吐温的TBST洗3次，每次20min；
⑦最后通过LI-COR ODYSSEY FC成像系统进行曝光进行免疫印迹分析。
实验结果：SDS-PAGE分析重组蛋白的表达场所的结果如图7所示，在 35KD位置处有较明显的诱导表达条带，该条带即为重组蛋白，从结果中可以看 出重组蛋白在胞内表达，且表达形式为包涵体；Western blot鉴定重组蛋白的表 达场所的结果如图8所示，Western blot结果表明诱导表达的蛋白是含有UL146 基因的重组蛋白，进一步证明重组蛋白在胞内以包涵体的形式存在。
(5)融合蛋白镍柱纯化
①转接已培养好的4mL菌液至新鲜的含有100μg/mL氨苄抗性的2L的锥 形瓶中，放于37℃振荡培养至OD600值为0.5～0.8即可；
②OD600值达0.5～0.8时分别加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，置于 20℃培养箱中培养，转速为160rpm，振荡诱导10h；
③收集培养好的菌体，配平置于4℃高速冷冻离心机中8000rpm,4℃离心 10min。弃上清；
④将离心好的菌体沉淀称重，加入10倍体积的Wash 1buffer(50mM磷酸 钠，300mM氯化钠，5mM咪唑，8M尿素，pH 8.0)重悬；
⑤超声破碎：55％，工作5s，停5s，破碎30min左右至菌体澄清；
⑥将破碎好的菌体重悬液配平置于4℃高速冷冻离心机中11000rpm,4℃离 心30min，弃沉淀；
⑦取破菌后的上清，0.22μm的滤膜过滤，取出1mL置于4℃保存。剩余样 品置于冰上待纯化；
⑧装柱；
⑨用2倍柱体积(CV)的水过柱，洗掉保存镍柱的酒精，过柱速率5mL/min；
⑩柱平衡：用10CV的平衡液(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，pH 8.0) 平衡，2mL/min；
上样，流速为1mL/min，收集柱穿；
洗涤：先用Wash 1以1mL/min的流速洗涤至基线，收集柱穿；再用Wash 2(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，25mM咪唑，8M尿素，pH 8.0)以2 mL/min的流速洗涤出杂蛋白至基线；
洗脱：洗脱液(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，500mM咪唑，8M尿 素，pH 8.0)以2mL/min流速洗脱，收集洗脱峰；
再平衡：平衡液以2mL/min流速平衡至基线；
贮存：20％的酒精过柱5CV，4℃冰箱贮存镍柱；
将纯化收集到的蛋白溶液及7中预留的未纯化蛋白溶液各取48μL，并加 入5×SDS-PAGE loading buffer 12μL,置于斡旋振荡器中混匀，99℃煮沸5～10 min，立即置于冰上冷却3min，剩余的纯化后的蛋白进行透析除盐；
进行SDS-PAGE电泳，表达产物通过12％的SDS-PAGE电泳分离，在胶 底部约1cm处时停止电泳，55V 50min，120V约40min。
实验结果：SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白的纯化结果如图9所示，在 35KD的位置处有条带，该条带即为目的蛋白，纯化结果表明在咪唑浓度为500 nM时可较好地纯化目的蛋白，且经灰度扫描分析得到纯化后的目的蛋白纯度达 80％。
(6)蛋白样品透析
①透析袋处理：将10cm长的透析袋置于500mL含有1mmol/L EDTA和 2％NaHCO3溶液中煮沸10min，用干净的镊子或皮手套取出，然后再在去离子 水中煮沸10min，取出透析袋并在去离子水中漂洗干净后即可使用或置于去离 子水中4℃保存备用；
②装样：取已处理好的透析袋，用橡皮筋先将一段夹紧，另一端加入蛋白 样品，再用橡皮筋夹住，将透析袋两端的橡皮筋绑在一根玻璃棒，把透析袋架 在烧杯上，架空两端，防止漏蛋白；
③透析：往烧杯加入去离子水，调节好尽量让透析袋泡完全泡在去离子水 中，在烧杯底部放一个磁子，放在磁力搅拌器上进行透析，30min后更换去离 子水，最少更换15次去离子水。
(7)BCA蛋白定量试剂盒检测UL146重组蛋白的含量
①使用1×PBS将BSA Standard Solution稀释为500μg/mL；
②根据样品数将BCASolution A和BCASolution B按50:1的比例稀释成工 作液，充分混匀；
③按照下表，在96孔板的样品孔中对稀释后的标准溶液进行配置：
表9 BSA标准曲线的绘制
④用1×PBS将待测样品按照一定比例稀释后，取20μL加入96孔板的样品 孔中；
⑤向样品孔中加入200μL的BCA工作液，37℃放置30min；
⑥将96孔板置于562nm波长下检测；
⑦绘制标准曲线，计算待测蛋白样品浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL146基因
<400> 1
atgcgattaa tttttggttc gctgattagt cttttgatgg catttatgta ttaccatggg 60
gttcacagta gagaattgcg ttgtccgtgt acccacaaag ctttacatca tcctataggt 120
ggcttatttt gggttggtcg tgaccctccc aatcctcctg agtgtgacaa acctcaacat 180
tatctattgc ctcctcgagg taaacctgta tgtttagctc ccgatcatca tttgtccaaa 240
tggctggatg gtaaaaaaga caactcatgg cacagagtat tggtaaaagt aaaggatagt 300
aatggaccgc atgtagaaga aaacgctgtc actaacaaac gtccgcgttg gaaataa 357
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL146蛋白
<400> 2
Met Arg Leu Ile Phe Gly Ser Leu Ile Ser Leu Leu Met Ala Phe Met
1 5 10 15
Tyr Tyr His Gly Val His Ser Arg Glu Leu Arg Cys Pro Cys Thr His
20 25 30
Lys Ala Leu His His Pro Ile Gly Gly Leu Phe Trp Val Gly Arg Asp
35 40 45
Pro Pro Asn Pro Pro Glu Cys Asp Lys Pro Gln His Tyr Leu Leu Pro
50 55 60
Pro Arg Gly Lys Pro Val Cys Leu Ala Pro Asp His His Leu Ser Lys
65 70 75 80
Trp Leu Asp Gly Lys Lys Asp Asn Ser Trp His Arg Val Leu Val Lys
85 90 95
Val Lys Asp Ser Asn Gly Pro His Val Glu Glu Asn Ala Val Thr Asn
100 105 110
Lys Arg Pro Arg Trp Lys
115
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL146引物-F
<400> 3
cgcggatcca tgcgattaat ttttggttcg ct 32
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL146引物-R
<400> 4
acgcgtcgac ttccaacgcg gacgtttg 28

Claims (8)

1.一种含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒，其特征在于：含有UL146基因片段，其中，UL146基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.一种含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌，其特征在于：转化有权利要求1中所述的含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒。
3.根据权利要求2所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)。
4.权利要求2所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌的构建方法，其特征在于：将权利要求1中所述的含有人巨细胞病毒UL146基因的重组质粒转化入原核表达工程菌中，得到含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌。
5.权利要求2或3所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌在UL146重组蛋白制备中的应用。
6.一种UL146重组蛋白的制备方法，其特征在于：将权利要求2或3中所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌经过活化培养和发酵培养，再加入诱导剂IPTG进行诱导表达，得到UL146重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的UL146重组蛋白的制备方法，其特征在于，还包括将获得的UL146重组蛋白进行纯化的步骤；
所述的纯化为采用镍柱亲和层析进行纯化。
8.权利要求2或3所述的含有人巨细胞病毒UL146基因重组质粒的基因工程菌在制备人巨细胞病毒UL146蛋白多克隆抗体中的应用。
CN201810108127.3A 2018-02-02 2018-02-02 含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用 Pending CN108359680A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810108127.3A CN108359680A (zh) 2018-02-02 2018-02-02 含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810108127.3A CN108359680A (zh) 2018-02-02 2018-02-02 含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108359680A true CN108359680A (zh) 2018-08-03

Family

ID=63004567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810108127.3A Pending CN108359680A (zh) 2018-02-02 2018-02-02 含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108359680A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113788880A (zh) * 2021-09-12 2021-12-14 南京珀尔泰生物技术有限公司 一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1763203A (zh) * 2005-08-11 2006-04-26 山东省医药生物技术研究中心 一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1763203A (zh) * 2005-08-11 2006-04-26 山东省医药生物技术研究中心 一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINGLING HE ET AL.,: ""Preparation of polyclonal antibody against human cytomegalovirus UL146 gene product-α chemokine vCXC-1"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF SCIENCE》 *
匿名: ""GenBank: FJ616285.1"", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113788880A (zh) * 2021-09-12 2021-12-14 南京珀尔泰生物技术有限公司 一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法
CN113788880B (zh) * 2021-09-12 2023-11-28 南京珀尔泰生物技术有限公司 一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022121322A1 (zh) 一种新型冠状病毒的重组亚单位疫苗及其应用
CN116333161B (zh) 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN104826100A (zh) 一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用
CN117186246B (zh) 一种重组纤连蛋白Pro.FN及其制备方法和应用
CN111647055B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用
CN112724208A (zh) 一种SADS-CoV重组S蛋白胞外段及其制备方法与应用
CN103131676A (zh) 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN108359680A (zh) 含有人巨细胞病毒ul146基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
CN106754981A (zh) 一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN107200776A (zh) 细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法
CN104862331B (zh) 一种可溶性表达马红球菌致病基因VapA蛋白的方法
CN105420174A (zh) 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建
CN102643335B (zh) 重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备
CN108530521A (zh) 重组丙型肝炎抗原的制备及应用
CN109055416A (zh) 一种可溶性重组蛋白的制备方法
CN107253988A (zh) 一种人源程序性死亡因子配体pd‑l2蛋白的制备方法
CN107163109A (zh) Balf4多肽的克隆、表达和应用
CN106085932A (zh) 一种重组VEGF与GnRH融合蛋白的基因工程菌的构建
CN102094038A (zh) 一种转基因水稻Bt蛋白cry1c的原核表达及纯化方法
CN110257414A (zh) 一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途
CN105085638A (zh) KSHV病毒vIRF4 DNA结合域、其多克隆抗体及制备方法
CN111378016A (zh) 小反刍兽疫病毒的亚单位h蛋白及其制备方法和应用
CN115010814B (zh) 一种诺如病毒p颗粒嵌合棘球蚴eg95蛋白的重组蛋白及其应用
CN108359679A (zh) 含有人巨细胞病毒ul147基因的重组质粒、基因工程菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180803