CN105420174A - 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，本发明公开提供了一种重组VEGF的大肠杆菌菌株及制备方法。本发明提供的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/VG₆，CCTCC？NO：M2015497。该工程菌含有重组质粒pET28a-VEGF？I-M₂-GRP₆，质粒上有重组突变VEGF基因，该基因具有SEQ？ID？NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/VG₆菌株经乳糖诱导，可高效表达重组蛋白VEGF？I-M₂-GRP₆。该重组蛋白预期可以提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，打破免疫耐受，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。

Description

一种表达重组VEGF融合蛋白的基因工程菌的构建

技术领域

在基因工程领域，本发明公开了一种新的融合蛋白重组工程菌及其构建方法，以及该融合蛋白的纯化。

背景技术

重组质粒指的是在基因工程的领域，在体外将目的基因和载体结合成一个具有自我复制能力的DNA分子，继而转化或转染入宿主菌株或细胞，筛选出含目的基因的重组子。融合蛋白技术是为了获得目标蛋白而进行的有目的性的基因重组和蛋白表达的方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。

肿瘤疫苗按抗原成分的类型可分为肿瘤细胞型疫苗、肿瘤抗原多肽及蛋白疫苗、DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。无论何种类型的肿瘤疫苗，其研制的关键都在于选择合适的靶抗原和提高免疫原性。

肿瘤细胞会表达肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，针对这些抗原发展起来的肿瘤特异性免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方法。

肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)：指并非某一种肿瘤所特有，在其他肿瘤细胞或正常细胞上也存在的抗原分子。正常细胞与肿瘤细胞仅在增殖中有量的差异，因此称为相关抗原。

血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor)是最重要的血管内皮细胞刺激因子，它可与血管内皮细胞相应受体结合，刺激血管内皮细胞的增殖、迁移，诱导新生血管形成，提高血管通透性，使肿瘤持续生长。大多数肿瘤细胞均高水平表达VEGF，而正常组织中仅肾、卵巢等少数脏器有较高水平的表达，因此VEGF是抗肿瘤血管治疗理想的靶部位。VEGF₁₂₁突变体I是本实验室用破伤风毒素两个强T辅助表位618-627和831-838替换hVEGF₁₂₁的1-8和115-121两个肽段。结果说明在保持半胱氨酸结原有二聚体结构的前提下，破伤风毒素两个强T辅助表位hVEGF非关键残基置换后，可有效提高VEGF的免疫原性。

胃泌素释放肽(gastrin-releasingpeptide，GRP)是哺乳动物中的蛙皮素同系物，为一种胃肠道神经激素，含有27个氨基酸，具有生长因子样作用。通过自分泌或旁分泌途径，GRP可以刺激肿瘤细胞的生长，参与肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤的转移等。GRP及其受体在多种肿瘤细胞中存在过表达，在有限的正常组织中有少量的分布，因此GRP及其受体是肿瘤治疗的理想靶点。GRP的C端7至8个氨基酸就是其抗原表位，因此我们选择GRP的C端十肽可以完全覆盖GRP的表位。抗原表位多肽重复多次，可以增加抗原表位的剂量，增加整个抗原的分子量，从而增加抗原表位多肽的免疫原性。

由于单独用VEGF或GRP免疫原性相对较低，本发明将VEGF₁₂₁I-M2基因同GRP基因连接起来，组建pET28a-VEGFI-M₂-GRP₆重组质粒，诱导表达融合蛋白，将其作为疫苗刺激机体产生主动免疫，打破免疫耐受，产生针对VEGF和GRP特异性肽段的抗体，从而抑制肿瘤的生长。

发明内容

本发明公开一种表达重组VEGF融合蛋白的基因工程菌。

本发明的一个目的是提供该重组菌的制备方法，方法简便，易于操作。

本发明的另一个目的是公开该重组蛋白的纯化方法。

在本发明的第一个方面，该大肠杆菌菌株命名为EscherichiacoliBL21(DE3)/VG₆：pET28a-VEGFI-M₂-GRP₆，菌株已提交中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学。保藏日期：2015年8月21日，保藏编号为CCTCCNO：M2015497，分类命名为EscherichiacoliBL21(DE3)/VG₆，其细胞中含有重组质粒pET28a-VEGFI-M₂-GRP₆，质粒中含有SEQIDNO.1所示的重组突变VEGF基因序列。

在本发明的第二个方面，提供了该重组质粒的制备方法，其技术路线详述如下：

1.重组质粒pET28a-VEGFI-M₂-GRP₆及相应基因工程菌的构建

根据本实验室已有的关于重组质粒pET28a-HSP₆₅-GRP₆和pET28a-VEGFI-M₂的序列信息，利用引物设计软件Primer5和oligo7来设计上游引物V1、V2和下游引物G1、G2。上游引物V1中引入NcoI，NheI酶切位点以及DPTGG连接肽序列。采用PCR技术从pET28a-VEGFI-M₂质粒中克隆得到基因VEGFI-M₂-DPTGG，以及从pET28a-HSP₆₅-GRP₆质粒中克隆得到GRP₆基因。通过酶切、酶连和转化技术将PCR的产物VEGFI-M₂-DPTGG插入pET-28a质粒载体的相应酶切位点中，再将GRP₆基因转入刚转化成功的质粒中组成重组质粒pET28a-VEGFI-M₂-GRP₆，将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21获得需要的重组基因的工程菌。

2.融合蛋白的诱导表达

将重组工程菌进行活化，接种至含卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜，按1∶100转接于新鲜LB培养液中，37℃培养至A600值为0.6-0.8时，加入乳糖(终浓度7mM)进行诱导表达，7h后离心收取菌体沉淀，进行12％SDS-PAGE分析，观察目的蛋白条带位置和表达量。

3.融合蛋白的分离纯化

收集菌体，每克湿菌体加入10mL菌体裂解缓冲液溶解，再进行超声裂解操作，充分裂解菌体；离心收集沉淀。将沉淀先用包涵体洗涤液A溶解，室温磁力搅拌30min，离心取沉淀；再分别用包涵体洗涤液B和双蒸水溶解，重复上述洗涤步骤，去除部分杂蛋白和核酸。将沉淀加入包涵体裂解液，4℃搅拌过夜溶解，离心收集上清。将上清用梯度复性法进行复性，最后用层析缓冲液于4℃充分透析，离心弃沉淀，上清液过阴离子交换柱DEAE-cellulose做进一步纯化，用浓度梯度为0-1MNaCl层析缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，检测合并目的蛋白峰组分，对蒸馏水充分透析后冻干保存。

附图说明

图1重组质粒构建原理示意图。

图21.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物VEGF₁₂₁I-M₂-DPTGG基因的结果。

Lane1：ProteinMarker，Lane2：VEGF₁₂₁I-M₂-DPTGG基因

图31.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物GRP₆基因的结果。

Lane1：ProteinMarker，Lane2：GRP₆基因

图4携带VEGF₁₂₁I-M₂-DPTGG基因的pET28a质粒正向测序图

图51.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物VEGF₁₂₁I-M₂-GRP₆基因的结果。

Lane1：ProteinMarker，Lane2：VEGF₁₂₁I-M₂-GRP₆基因

图6重组质粒的基因正向测序图。

图715％SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线。

Lane1：ProteinMarker，Lane2：诱导前的全菌蛋白样品，Lane3-10：诱导后1-8h每个小时的全菌蛋白样品

图815％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白破碎后图。

Lane1：诱导前全菌蛋白，Lane2：诱导后6h全菌蛋白，Lane3：菌体离心后上清，Lane4：菌体离心后沉淀，Lane5：超声破碎后取样，Lane6：超声破碎后离心上清，Lane7：超声破碎后沉淀

图915％SDS-PAGE电泳检测蛋白梯度复性

Lane1：ProteinMarker，Lane2：8M尿素溶解上清，Lane3：4M尿素透析外液，Lane4：4M尿素透析内液，Lane5：2M尿素透析外液，Lane6：2M尿素透析内液，Lane7：1M尿素透析内液，Lane8：Tris-HCL透析内液，Lane9：Tris-HCL透析外液

具体实施方式

材料

(1)菌株

载体pET28a-HSP₆₅-GRP₆，EscherichiacoliBL21(DE3)，菌株pET28a-VEGF₁₂₁I-M₂均为本实验室保存。

(2)酶和试剂

分子克隆工具酶为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒为上海捷瑞生物科技有限公司；产物纯化试剂盒以及PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司的产品。

(3)培养基

LB培养基，配方见参考文献SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989。

本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、PCR产物的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，pp.16-340。

实施例1VEGF₁₂₁I-M₂-GRP₆基因的克隆

根据本实验室已构建的关于pET28a-VEGF₁₂₁I-M₂的序列信息，利用引物设计软件primer、oligo分别设计两对引物V1、V2：

V1：5’-CATGCCATGGACATCATCGACGACT-3’

V2：5’-CGGCTAGCGCCACCAGTCGGATCCTTGTTGTGAGCGGCAA--3’

上游引物V1中引入酶切位点NcoI，下游V2中引入酶切位点NheI以及柔性肽DPTGG。用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-VEGF₁₂₁I-M₂和质粒pET28a。利用引物V1、V2克隆VEGF₁₂₁I-M₂-DPTGG基因，PCR反应体系见表1，反应参数见表2。

表1VEGFI-M2-DPTGGPCR反应体系

表2VEGFI-M2-DPTGGPCR反应参数

1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见附图2)，条带位置与预期的593bp一致。

通过切胶回收获得目的片段VEGF₁₂₁I-M₂-DPTGG，将目的片段和pET28a载体质粒分别经NcoI、NheI双酶切，双酶切反应体系见表3、表4。

表3VEGFI-M₂-DPTGG基因双酶切反应体系

表4pET28a双酶切反应体系

酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用E.coliDNA连接酶4℃连接，用冷CaCl₂法制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，将酶连产物转化感受态细胞后涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养后挑取单菌落，将单菌落接种至LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，通过PCR、单酶切和双酶切方法初筛阳性克隆，将阳性克隆菌株送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见附图3)。

根据本实验室已构建的关于pET28a-HSP₆₅-GRP₆的序列信息，利用引物设计软件primer、oligo分别设计两对引物G1、G2：

G1：5’-GCGACATGGGTGGCATGGATTTC-3’23bp

G2：5’-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGT-3’25bp

利用引物G1、G2克隆基因GRP₆，PCR反应体系见表5，反应参数见表6。

表5GRP₆PCR反应体系

表6GRP₆PCR反应参数

1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见附图4)，条带位置与预期的290bp一致。

通过切胶回收获得目的片段GRP₆，将目的片段和pET28a-VEGFI-M₂-DPTGG载体质粒分别经NheI、HindIII双酶切，双酶切反应体系见表7、表8

表7pET28a-VEGFI-M₂-DPTGG载体质粒双酶切反应体系

表4pET28a双酶切反应体系

酶切产物GRP₆通过PCR产物纯化试剂盒来纯化，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用E.coliDNA连接酶4℃连接，转化至E.coliBL21感受态细胞后涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，以引物V1和G2进行PCR验证(参见附图5)，将阳性克隆送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见附图6)。至此重组质粒pET28a-VEGFI-M₂-GRP₆构建完成。

实施例2VEGFI-M₂-GRP₆基因在大肠杆菌中的表达及培养

重组菌以1％接种量在液体LB培养基试管中37℃振荡培养过夜，再以1％的接种量转接摇瓶大批培养，培养4h后加入终浓度为7mM乳糖诱导表达，诱导6h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的65％(参见附图7)。

实施例3融合蛋白的初步分离纯化

挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入LB培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。5000r/min离心15min，上清及沉淀均留样。将沉淀用配制好的菌体裂解液(10mL/g菌体)溶解，超声裂解菌体。12000r/min离心20min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体沉淀中，故可判断融合蛋白为胞内包涵体表达(参见附图8)。

实施例4包涵体的洗涤和溶解

将沉淀先用包涵体洗涤液A(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM，NaCl10mM，2％TritonX-100)溶解，室温磁力搅拌30min，4℃，12000r/min，离心20min，取沉淀；再分别用包涵体洗涤液B(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM，NaCl10mM，0.5M尿素)和双蒸水溶解，重复上述洗涤步骤，去除部分杂蛋白和核酸。每g沉淀加入20mL包涵体裂解液(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM，8M尿素)，加入DTT至终浓度为10mmol/L，4℃搅拌过夜溶解，4℃，12000r/min，离心20min，收集上清。

实施例5包涵体的复性

上清装入透析袋中，用层析缓冲液I(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM，4M尿素)于4℃充分透析，去除DTT。透析后的上清进行梯度复性，首先将溶液放入含氧化型谷胱甘肽0.1mM和还原型谷胱甘肽1mM的层析缓冲液II(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM，2M尿素)中4℃搅拌透析6h，再放入层析缓冲液III(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM，1M尿素)中4℃搅拌透析6h，最后用层析缓冲液Ⅳ(pH8.0Tris·HCl20mM，EDTA5mM)透析过夜(参见附图9)。

实施例6DEAE-52阴离子交换层析

本实验采用的DEAE52是弱酸型阴离子交换剂，将DEAE-52用NaOH、HCl和NaOH分别处理后用蒸馏水将其洗至中性，再将DEAE-52装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接核酸蛋白检测仪，利用离子交换缓冲液(pH8.0，20mMTris·HCl)进行层析柱的平衡，平衡完毕后以1mL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作，再用NaCl(0-1M)进行梯度洗脱，收集洗脱峰留样，进行SDS-PAGE电泳分析。

实施例7脱盐冻干

收集蛋白纯度较高的洗脱液，4℃对其用蒸馏水透析过夜，将透析后的洗脱液在冻干机中冻干，刮取蛋白干粉冷冻保存。

除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种生产重组蛋白VEGFI-M₂-GRP₆的大肠杆菌菌株，其特征在于大肠杆菌菌株Escherichiacoli.BL21(DE3)/VG₆，保藏编号：CCTCCNO：M2015497。

2.根据权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株BL21(DE3)/VG₆，其特征在于：大肠杆菌细胞中含有重组质粒pET-28a-VEGFI-M₂-GRP₆。

3.根据权利要求书2所述的该大肠杆菌菌株BL21(DE3)/VG₆中重组质粒pET-28a-VEGFI-M₂-GRP₆，其特征在于：含有重组的VEGFI-M₂-GRP₆基因，可表达融合蛋白，其具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

4.一种制备权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株的方法，它包括以下步骤：

(I)用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-HSP₆₅-GRP₆、pET28a-VEGFI-M₂，通过PCR方法扩增出目的片段VEGFI-M₂-DPTGG和GRP₆；

(II)用限制性内切酶NcoI、NheI切割VEGFI-M₂-DPTGG和pET28a质粒，用E.coliDNA连接酶4℃连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得含质粒pET28a-VEGFI-M₂-DPTGG的菌株；

(III)用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-VEGFI-M₂-DPTGG，用限制性内切酶NheI、HindIII切割GRP6和质粒pET28a-VEGFI-M₂-DPTGG，用E.coliDNA连接酶4℃连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得BL21(DE3)/VG₆菌株；

(IV)鉴定重组质粒：使用PCR法、和单酶切、双酶切方法进行验证，将重组菌株进行测序验证。

5.根据权利要求3所述的一种新型融合蛋白VEGFI-M₂-GRP₆，其特征在于：该基因表达的融合蛋白实际分子量约为27kDa，其N端为VEGFI和M₂(Hsp70(407-426)的两段串联重复序列)，C端为六段串联重复的GRP序列，N端和C端之间利用DPTGG柔性肽连接。

6.根据权利要求5所述的VEGFI-M₂-GRP₆肽的重组方法，其特征在于：包含抗肿瘤疫苗的抗原表位VEGF、GRP，及分子内佐剂M₂，具有更强的抗肿瘤功能。

7.一种VEGFI-M₂-GRP₆肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(I)根据权利要求4所述步骤构建宿主菌；

(II)通过乳糖诱导，超声破碎，包涵体洗涤和溶解，梯度复性来初步获得重组蛋白；

(III)通过DEAE-52离子交换层析分离出VEGFI-M₂-GRP₆，该融合蛋白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。