CN113788880A - 一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人巨细胞病毒重组抗原（CMV重组抗原pp150）的纯化方法，涉及蛋白纯化技术领域。本发明从含有GST‑pp150抗原的大肠杆菌中进行目的蛋白纯化。本发明所述方法，可有效去除绝大多数宿主蛋白质，使其对目的蛋白的后续应用的影响降到最低；去除杂蛋白及相关物质，最终使目的蛋白产品纯度达到95％以上。本发明采用的亲和层析方法可放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。

Description

一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，特别涉及一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法。

背景技术

巨细胞病毒(CMV)属疱疹病毒科（Herpesviridae），是一种双链DNA病毒。巨细胞病毒在人群中感染非常普遍，可以在被感染个体中终生潜伏。巨细胞病毒是TORCH病原体的一种，虽然对正常人而言，其感染通常无症状，但巨细胞病毒对胎儿和免疫力低下者的危害非常大。感染病毒的孕妇，可导致胎停，流产或胎儿畸形；对于免疫低下个体，特别是新生儿和器官移植患者，原发性感染和重新激活的巨细胞病毒感染会产生严重的并发症，损伤听觉神经，引起肝脏疾患乃至危及生命。对巨细胞病毒的诊断可以减少病毒感染孕妇，育龄妇女，以及其他高风险人群。

目前，已知为数不多的几种巨细胞病毒编码蛋白具有免疫活性，其中pp150抗原性较强，常被用来诊断检测巨细胞病毒感染的IgM抗体。

由于CMV感染所致症状和体征多是非特异性的，而且许多感染者并不表现任何症状，因此必须结合实验室诊断才能确诊。目前多用血清学方法诊断CMV感染。机体感染CMV后，首先会产生IgM抗体，一般在感染后的1-2周出现IgM，且在体内持续时间较短，约一个月后会逐渐转阴，是机体近期感染CMV的一项参考标志。而机体产生CMV-IgG抗体的时间相比IgM较晚，且CMV-IgG抗体的浓度水平会持续升高，在1-2个月后出现高峰值，且在体内持续时间较长，是机体既往感染CMV的一项参考标志，通过观察CMV-IgG抗体能够对机体CMV免疫力进行判断。酶联免疫吸附实验（ELISA）由于其操作简便、快速以及设备要求低等原因，成为检测IgG、IgM最常用的方法之一。利用有限的几种CMV蛋白能与不同临床感染阶段的阳性血清中的IgG、IgM抗体反应，识别并筛选特异性强的抗原蛋白，应用基因工程技术进行高效的表达，有助于快速、便捷地纯化生产抗原原料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，该方法得到高纯度人巨细胞病毒重组抗原，有助于高效、便捷地纯化生产抗原原料。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，包括以下步骤：

步骤（1）、将含有重组表达的人巨细胞病毒重组抗原菌体沉淀放入平衡缓冲液中搅拌，菌体重悬均匀后进行超声破碎，超声破碎后的破碎液经离心后，收集上清液；

步骤（2）、将步骤（1）中得到的上清液进行滤器过滤处理；

步骤（3）、将步骤（2）中过滤处理后的上清液上样到亲和层析柱，经过洗涤步骤去除杂蛋白，再采用解离液洗脱得到含有目的蛋白的洗脱峰；

步骤（4）、将步骤（3）中得到的洗脱缓冲液透析于保存缓冲液中，进行后续的分析鉴定。

进一步的，所述步骤（1）中，超声破碎功率200W，超声破碎99次，每次超声破碎时间4s，相邻两次超声破碎间隔8s；离心转速为15000 rpm，离心时间为30 min，离心在4℃下进行。

进一步的，所述步骤（2）中，使用滤器过滤的过滤孔径为0.45μm。

进一步的，所述步骤（3）中，所述亲和层析柱为GST标签蛋白纯化柱，洗脱液为50mM Tris+10 mM GSH，pH 8.0。

进一步的，所述步骤（4）中，透析采用的透析袋截留分子量8 kD-14 kD，缓冲液为10 mM PBS+20%甘油，pH7.4。

进一步的，所述步骤（1）中，含有重组表达的人巨细胞病毒重组抗原菌体沉淀的制备方法，包括以下步骤：

步骤（11）、将含有GST-pp150目的基因的表达载体转化到大肠杆菌中，放大培养含有基因的大肠杆菌，利用IPTG诱导蛋白表达，菌液离心后，收集菌体沉淀。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种人巨细胞病毒重组抗原（CMV重组抗原pp150）的纯化方法，涉及蛋白纯化技术领域。本发明从含有GST-pp150抗原的大肠杆菌中进行目的蛋白纯化。本发明所述方法，可有效去除绝大多数宿主蛋白质，使其对目的蛋白的后续应用的影响降到最低；去除杂蛋白及相关物质，最终使目的蛋白产品纯度达到95％以上。本发明采用的亲和层析方法可放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。

附图说明

图1 为目的蛋白GST - pp150纯化电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1

一种人巨细胞病毒重组抗原（CMV重组抗原pp150）的纯化方法，包括以下步骤：

步骤（11）、将含有GST-pp150目的基因的表达载体转化到大肠杆菌中，放大培养含有基因的大肠杆菌，利用IPTG诱导蛋白表达，菌液离心后，收集菌体沉淀；

具体地讲，步骤（11），将表达pp150蛋白的基因连接到质粒pGEX4T中，转化大肠杆菌，利用IPTG诱导蛋白产生，菌液离心后，收集菌体沉淀；

步骤（1）、将步骤（11）中得到的含有重组表达的人巨细胞病毒重组抗原菌体沉淀放入平衡缓冲液中搅拌，菌体重悬均匀后进行超声破碎，超声破碎后的破碎液经离心后，收集上清液；

所述步骤（1）中，超声破碎功率200W，超声破碎99次，每次超声破碎时间4s，相邻两次超声破碎间隔8s；离心转速为15000 rpm，离心时间为30 min，离心在4℃下进行；

步骤（2）、将步骤（1）中得到的上清液进行滤器过滤处理；

所述步骤（2）中，使用滤器过滤的过滤孔径为0.45μm；

步骤（3）、将步骤（2）中过滤处理后的上清液上样到亲和层析柱，经过洗涤步骤去除杂蛋白，再采用解离液洗脱得到含有目的蛋白的洗脱峰；

所述步骤（3）中，所述亲和层析柱为GST标签蛋白纯化柱，洗脱液为50 mM Tris+10mM GSH，pH 8.0；

步骤（4）、将步骤（3）中得到的洗脱缓冲液透析于保存缓冲液中，进行后续的分析鉴定。

具体地讲，步骤（4），将步骤（3）中滤得的上清液经GST层析纯化柱，解离时采用含有特定浓度的谷胱甘肽解离液洗脱得到含有目的蛋白的洗脱峰。

进一步的，所述步骤（4）中，透析采用的透析袋截留分子量8 kD-14 kD，缓冲液为10 mM PBS+20%甘油，pH7.4，其中20%甘油指适量分数为20%的甘油。

实施例2

本发明将所述目的基因连接到质粒pGEX4T中后，将所示的质粒转化大肠杆菌，然后利用IPTG诱导蛋白产生。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。本发明所述利用IPTG诱导蛋白产生优选的包括以下步骤：将菌液涂Amp(+)的LB培养平板，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落接种于3 mLAmp(+)LB培养液中，37 ℃、210rpm振荡培养4 h，后加IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE检测成功后，取50 μL菌液接种于50mL Amp(+)LB培养液中，37 ℃、180rpm振荡培养过夜。再按1:100 比转接到2L新鲜Amp(+)LB液体液，摇菌培养至OD₆₀₀达到0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度 1mmol/L，25℃诱导表达6h即可。

本发明将上述诱导表达后的菌液进行离心，收集菌体沉淀，所述离心的转速优选为6000rpm，所述离心的时间优选为5min。

本发明将所述菌体沉淀破碎后，离心收集上清。本发明对所述破碎方法为超声破碎，并将破碎后的菌体离心，所述离心优选在4℃下进行，转速优选为15000 rpm，所述离心的时间优选为30 min。

本发明将所述含有人巨细胞病毒重组抗原的破碎上清液进行滤器处理，收集过滤后的上清液。本发明将过滤后的上清液上样到GST亲和层析柱，采用洗涤去除杂蛋白，再进行洗脱液解离目的蛋白，洗脱液优选为50 mM Tris+10 mM GSH（pH 8.0）。本发明所述亲和层析柱优选为GST标签蛋白纯化柱，GST蛋白纯化柱时的上样流速优选为1 mL/min，洗脱流速优选为3 mL/min。本发明将洗脱液透析于缓冲液中，收集透析后的人巨细胞病毒重组抗原，缓冲液优选为10 mM PBS+20%甘油（pH7.4）。

实施例3

（1）重组蛋白的诱导表达

将菌液涂Amp(+)的LB培养平板，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落接种于3 mLAmp(+)LB培养液中，37 ℃、210rpm振荡培养4 h，后加IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE检测成功后，取50 μL菌液接种于50 mL Amp(+)LB培养液中，37 ℃、180rpm振荡培养过夜。再按1:100比转接到2L新鲜Amp(+)LB液体液，摇菌培养至OD₆₀₀达到0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，25℃诱导表达6h即可。菌液进行离心，收集菌体沉淀，离心转速为6000rpm，离心时间5min。

对上述诱导表达系统进行评估，结果如图1所示，经诱导后可在菌中表达目的蛋白。

（2）纯化工艺

（21）试剂配制

10mM PBS：Na₂HPO₄·12H₂O 29 g，NaH₂PO₄·2H₂O 2.96 g，NaCl 87.66 g，倒入1L烧杯中，再加入适量超纯水，搅拌溶解，调pH至7.4，定容至1L。

1.5M NaCl：NaCl87.66g，倒入1L烧杯中，再加入适量超纯水，搅拌溶解，定容至1L。

GST标签蛋白柱缓冲液：

Buffer A：10mM PBS(pH 7.4）

Buffer B：50 mM Tris+10 mM GSH (pH 8.0）

Buffer C：10mM PBS (pH 7.4）

（22）上清制备工艺

（221）菌体破碎

菌体超声破碎仪破碎，并将破碎后的菌体离心，4℃，15000 rpm，30 min。

（222）滤器过滤

将上清经过滤器过滤处理得含有人巨细胞病毒重组抗原的上清液。

（23）亲和纯化工艺

（231）GST标签蛋白柱

层析填料：Glutathione Beads 4FF

层析柱处理：用平衡缓冲液Buffer A：10mM PBS(pH 7.4）平衡层析柱，冲洗5-10倍柱体积。

上样样品：过滤的人巨细胞病毒重组抗原的上清液

上样流速：1mL/min

上样量：约30 mL

洗脱流速：3mL/min

洗脱缓冲液：50 mM Tris+10 mM GSH (pH 8.0）

（24）保存工艺

将利用实施例3中的纯化方法得到的人巨细胞病毒重组抗原浓度调节至2.0mg/mL左右，-20℃保存。

实施例4

实施例4是对于实施例3中得到的产物进行了以下理化功能研究：

（1）纯度

SDS-PAGE纯度>95％(如图1所示)。

（2）活性

采用间接法检测重组GST-pp150抗原活性，与市面上在售CMV抗原活性基本一致，符合要求。

本发明提供了一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，可获得纯度大于95％的人巨细胞病毒重组抗原，适合于制备纯度高的人巨细胞病毒重组抗原。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）、将含有重组表达的人巨细胞病毒重组抗原菌体沉淀放入平衡缓冲液中搅拌，菌体重悬均匀后进行超声破碎，超声破碎后的破碎液经离心后，收集上清液；

步骤（2）、将步骤（1）中得到的上清液进行滤器过滤处理；

步骤（3）、将步骤（2）中过滤处理后的上清液上样到亲和层析柱，经过洗涤步骤去除杂蛋白，再采用解离液洗脱得到含有目的蛋白的洗脱峰；

步骤（4）、将步骤（3）中得到的洗脱缓冲液透析于保存缓冲液中，进行后续的分析鉴定。

2.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）中，超声破碎功率200W，超声破碎99次，每次超声破碎时间4s，相邻两次超声破碎间隔8s；离心转速为15000 rpm，离心时间为30 min，离心在4℃下进行。

3.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中，使用滤器过滤的过滤孔径为0.45μm。

4.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述亲和层析柱为GST标签蛋白纯化柱，洗脱液为50 mM Tris+10 mM GSH，pH 8.0。

5.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（4）中，透析采用的透析袋截留分子量8 kD-14 kD，缓冲液为10 mM PBS+20%甘油，pH7.4。

6.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）中，含有重组表达的人巨细胞病毒重组抗原菌体沉淀的制备方法，包括以下步骤：

步骤（11）、将含有GST-pp150目的基因的表达载体转化到大肠杆菌中，放大培养含有基因的大肠杆菌，利用IPTG诱导蛋白表达，菌液离心后，收集菌体沉淀。

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