CN110669141A - 一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，包括以下步骤：步骤1：Annexin V蛋白表达纯化：1.1：基因序列优化：查找人Annexin V蛋白的基因序列，将人Annexin V基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；1.2：Annexin V蛋白诱导表达：挑取重组质粒单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD600为0.4‑0.6；在菌液中加入诱导剂诱导培养；本发明在设计Annexin V基因序列时保留蛋白两端的His标签，便于Annexin V蛋白和Annexin V‑APC偶联物纯化，只需常规的镍柱纯化，无需专门的纯化设备，纯化步骤少、时间短，降低了纯化成本，且保持蛋白良好的生物活性，可用于细胞凋亡检测。

Description

一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法
技术领域
本发明涉及一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法。
背景技术
Annexin V是一种人体内源性蛋白，属于钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，具有抗凝作用，分布广泛，在多种组织细胞(如心肌细胞、肝细胞、内皮细胞等)中表达。AnnexinV在染色体上位于人的第4条染色体4q26-q28上的AnnexinV基因编码，共320个氨基酸，包括70-80个氨基酸的重复单元，分子量约36kD。在细胞凋亡过程中，凋亡细胞膜发生变化，PS从细胞膜的脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡级联反应的初始事件，AnnexinV蛋白与细胞膜上的PS有很高的亲和力，因此利用AnnexinV高亲和PS可早期检测凋亡的发生。
目前AnnexinV蛋白主要应用于细胞凋亡检测。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是由基因控制的细胞主动的有序性死亡，是生物体调节和维持机体相对平衡的重要方式，与多种疾病病理密切相关。PCD的主要形式有凋亡、自噬和焦亡等，是不同于坏死和意外死亡的。作为细胞生命周期中重要的组成部分，在凋亡的过程中伴随着细胞形态的改变以及一系列基因的激活、表达及调控等作用。细胞发生凋亡最早期改变发生在细胞膜上，磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内层翻向外层，使PS暴露于细胞膜外表面，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、核内DNA片段化等凋亡现象。AnnexinV与PS有高度亲和力，故可与细胞凋亡早期暴露在细胞膜外侧的PS结合。Annexin V标记荧光素FITC、PE、APC等，利用流式细胞仪等检测细胞凋亡现象，可作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。这是目前公认的灵敏、高效和特异的凋亡细胞检测的方法。
碘化丙啶(PI)和7-氨基放线菌素(7-AAD)是常用的核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期或死细胞，PI和7-AAD能够透过细胞膜给细胞核染色。因此将AnnexinV与PI或7-AAD结合使用，就可以将不同时期的细胞区分开。
APC与AnnexinV蛋白偶联后，偶联后的产物有AnnexinV-APC偶联物、游离的APC和AnnexinV。目前偶联后混合物纯化方法有分子筛高压液相色谱柱纯化、凝胶过滤层析、离子交换等。
分子筛高压液相色谱柱纯化，纯化纯度高，分辨效率高，但是由于只能少量纯化，不能量产，在生产上存在很大的局限性；
凝胶过滤层析，即分子筛，按照分子的大小分离蛋白子，由于AnnexinV分子量约36kD，APC分子量约104kD，Annexin V-APC偶联物约140kD，APC和AnnexinV-APC偶联物分子量差别很小，凝胶过滤层析不能很好的把两者分离开；
离子交换分离纯化蛋白，是建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上分离方法，由于Annexin V、APC和Annexin V-APC偶联物等电点很接近，所以不能用离子交换法分离纯化。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种别藻蓝蛋白(APC)与AnnexinV蛋白偶联方法，只需常规的镍柱纯化，无需专门的纯化设备，纯化步骤少、时间短，降低了纯化成本，且保持蛋白良好的生物活性，可用于细胞凋亡检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，包括以下步骤：
步骤1：AnnexinV蛋白表达纯化：
1.1：基因序列优化：查找人AnnexinV蛋白的基因序列，将人AnnexinV基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；
1.2：AnnexinV蛋白诱导表达：挑取重组质粒单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD600为0.4-0.6；在菌液中加入诱导剂诱导培养；
1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：收集的菌液经离心、缓冲液清洗后，加入超声裂解液重悬菌体，加入溶菌酶和PMSF，混匀后进行冰上孵育，再经超声破碎处理后，离心收集上清溶液进行纯化；
1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni琼脂糖层析柱纯化表达的AnnexinV蛋白，用平衡缓冲液平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白，透析袋对纯化的Annexin V蛋白进行透析过夜，收集透析后AnnexinV蛋白进行蛋白定量；
1.5：AnnexinV蛋白巯基化：将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于有机溶剂中配置SPDP母液，AnnexinV加入SPDP母液混匀反应获得Annexin V-SPDP溶液，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子；脱盐后的AnnexinV-SPDP溶液中加入DTT，混匀反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；
步骤二：别藻蓝蛋白(APC)衍生化：将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于有机溶剂中配置SMCC母液，取APC溶液离心弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对APC脱盐处理后加入SMCC母液混匀反应获得APC-SMCC溶液，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；
步骤三：APC-SMCC与AnnexinV-SPDP共价偶联：按照APC-SMCC与AnnexinV-SPDP混合后孵育，孵育结束后加入N-乙基马来酰胺(NEM)终止反应，得到偶联的AnnexinV-APC。
步骤四：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上述偶联的AnnexinV-APC，用平衡缓冲液平衡层析柱，将偶联的AnnexinV-APC总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，透析袋对具有活性的Annexin V-APC进行透析过夜，收集透析后偶联产物Annexin V-APC。
优选的，所述原核表达载体为pET28a，重组质粒单菌落为pET28a-Annexin V质粒单菌落。进一步的，所述步骤一:
1.2：挑取pET28a-Annexin V质粒单菌落，接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜；按照1：100将培养的菌液接种到含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD600为04-0.6；取菌液加入IPTG至终浓度0.5mM，置于恒温摇床中，于28℃、150rpm/min诱导6h；
1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：将收集的菌液离心，PBS清洗两遍，加入超声裂解液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 7.4，重悬菌体，加入终浓度500μg/ml溶菌酶和1mM PMSF，混匀后，冰上孵育15min；冰上超声破碎仪破碎处理，超声条件：20％W，开5s，停10s，超声20min；超声结束后，4℃，12000rpm离心20min，收集上清溶液进行纯化；
1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化表达的Annexin V蛋白，用平衡缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白；用PBS缓冲液，10kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后Annexin V蛋白，BCA法对蛋白定量；
1.5：AnnexinV蛋白巯基化：将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于DMSO中配制10mg/ml母液；调整AnnexinV蛋白浓度为5mg/ml，按照AnnexinV与SPDP摩尔比1:20加入SPDP母液。轻轻混匀，室温搅拌反应2小时；反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子；脱盐后的AnnexinV-SPDP溶液中加入DTT至终浓度50mM，轻轻混匀后，室温静止反应30min；反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；
步骤二：别藻蓝蛋白(APC)衍生化：取APC溶液5mg/ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，加入PBS重悬沉淀，利用脱盐柱对APC脱盐处理，脱盐后调整浓度为5mg/ml；将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于DMSO中配制10mg/ml母液；按照APC与SMCC摩尔比1:20加入SMCC母液；轻轻混匀，用铝箔纸封好反应混合物，室温搅拌反应2小时；反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；
步骤三：APC-SMCC与AnnexinV-SPDP共价偶联：按照APC-SMCC与AnnexinV-SPDP摩尔比1.2:1混合后，室温搅拌孵育4h。孵育结束后加入N-乙基马来酰胺(NEM)至终浓度5μM，终止反应；得到AnnexinV-APC；
步骤四：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上述偶联的AnnexinV-APC，用平衡缓冲液平衡层析柱，将偶联的AnnexinV-APC总蛋白上柱，用平衡缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，用PBS缓冲液，50kD的透析袋对具有活性的Annexin V-APC进行透析过夜，收集透析后偶联产物AnnexinV-APC。
进一步的，所述步骤1.2中取未加诱导剂的菌液作为未诱导对照。
本发明的有益效果：在生产中，既要考虑纯化后的纯度，又要考虑纯化的产量，本发明在设计AnnexinV基因序列时保留蛋白两端的His标签，便于AnnexinV蛋白和AnnexinV-APC偶联物纯化，只需常规的镍柱纯化，无需专门的纯化设备，纯化步骤少、时间短，降低了纯化成本，且保持蛋白良好的生物活性，可用于细胞凋亡检测。
附图说明
图1为本发明偶联AnnexinV-APC与市面上商品化产品的流式检测结果：
1-1：本发明AnnexinV-APC染色后流式散点图；
1-2：本发明AnnexinV-APC染色后流式直方图；
1-3：市面上商品化AnnexinV-APC染色后流式散点图；
1-4：市面上商品化AnnexinV-APC染色后流式直方图。
具体实施方式
实施例1
一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，包括以下步骤：
步骤1：AnnexinV蛋白表达纯化：
1.1：基因序列优化：查找人AnnexinV蛋白的基因序列，将人AnnexinV基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体pET28a上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；
1.2AnnexinV蛋白诱导表达：挑取pET28a-AnnexinV质粒单菌落，接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜；按照1：100将培养的菌液接种到含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD600为04-0.6；取出1ml菌液作为未诱导，剩余菌液加入IPTG至终浓度0.5mM，置于恒温摇床中，于28℃、150rpm/min诱导6h；
1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：将收集的菌液离心，PBS清洗两遍，加入超声裂解液(20mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 7.4)重悬菌体，加入终浓度500μg/ml溶菌酶和1mM PMSF，混匀后，冰上孵育15min；冰上超声破碎仪破碎处理，超声条件：20％W，开5s，停10s，超声20min；超声结束后，4℃，12000rpm离心20min，收集上清溶液进行纯化；
1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化表达的Annexin V蛋白，用平衡缓冲液(20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白；用PBS缓冲液，10kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后Annexin V蛋白，BCA法对蛋白定量；
1.5：AnnexinV蛋白巯基化：将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于DMSO中配制10mg/ml母液；调整AnnexinV蛋白浓度为5mg/ml，按照AnnexinV与SPDP摩尔比1:20加入SPDP母液，轻轻混匀，室温搅拌反应2小时；反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子；脱盐后的AnnexinV-SPDP溶液中加入DTT至终浓度50mM，轻轻混匀后，室温静止反应30min；反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；
步骤二：别藻蓝蛋白(APC)衍生化：取APC溶液(5mg/ml)于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，加入PBS重悬沉淀，利用脱盐柱对APC脱盐处理，脱盐后调整浓度为5mg/ml；将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于DMSO中配制10mg/ml母液；按照APC与SMCC摩尔比1:20加入SMCC母液；轻轻混匀，用铝箔纸封好反应混合物，室温搅拌反应2小时；反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；
步骤三：APC-SMCC与AnnexinV-SPDP共价偶联：按照APC-SMCC与AnnexinV-SPDP摩尔比1.2:1混合后，室温搅拌孵育4h，孵育结束后加入N-乙基马来酰胺(NEM)至终浓度5μM，终止反应；得到AnnexinV-APC。
步骤四：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上述偶联的AnnexinV-APC，用平衡缓冲液(20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)平衡层析柱，将偶联的AnnexinV-APC总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，用PBS缓冲液，50kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后偶联产物AnnexinV-APC。
将偶联产物进行检测细胞凋亡：
收集5×105-1×106个Eca109细胞，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清,
用500μl阳性质控液重悬细胞，置冰上孵育30分钟,
用预冷PBS离心洗涤，弃上清,
加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混匀,加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。
单染管分别加入5μlAnnexin V-APC或10μl 7-AAD，室温避光孵育10分钟；结果对比市面上商品化AnnexinV-APC如图1所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：AnnexinV蛋白表达纯化：
1.1：基因序列优化：查找人AnnexinV蛋白的基因序列，将人AnnexinV基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；
1.2：AnnexinV蛋白诱导表达：挑取重组质粒单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD600为0.4-0.6；在菌液中加入诱导剂诱导培养；
1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：收集的菌液经离心、缓冲液清洗后，加入超声裂解液重悬菌体，加入溶菌酶和PMSF，混匀后进行冰上孵育，再经超声破碎处理后，离心收集上清溶液进行纯化；
1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni琼脂糖层析柱纯化表达的AnnexinV蛋白，用平衡缓冲液平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白，透析袋对纯化的Annexin V蛋白进行透析过夜，收集透析后AnnexinV蛋白进行蛋白定量；
1.5：AnnexinV蛋白巯基化：将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于有机溶剂中配置SPDP母液，AnnexinV加入SPDP母液混匀反应获得Annexin V-SPDP溶液，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子；脱盐后的AnnexinV-SPDP溶液中加入DTT，混匀反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；
步骤二：别藻蓝蛋白(APC)衍生化：将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于有机溶剂中配置SMCC母液，取APC溶液离心弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对APC脱盐处理后加入SMCC母液混匀反应获得APC-SMCC溶液，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；
步骤三：APC-SMCC与AnnexinV-SPDP共价偶联：按照APC-SMCC与AnnexinV-SPDP混合后孵育，孵育结束后加入N-乙基马来酰胺(NEM)终止反应，得到偶联的AnnexinV-APC。
步骤四：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上述偶联的AnnexinV-APC，用平衡缓冲液平衡层析柱，将偶联的AnnexinV-APC总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，透析袋对具有活性的Annexin V-APC进行透析过夜，收集透析后偶联产物Annexin V-APC。
2.根据权利要求1所述一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，所述原核表达载体为pET28a，重组质粒单菌落为pET28a-Annexin V质粒单菌落。
3.根据权利要求2所述一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，所述步骤一:
1.2：挑取pET28a-Annexin V质粒单菌落，接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜；按照1：100将培养的菌液接种到含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD600为04-0.6；取菌液加入IPTG至终浓度0.5mM，置于恒温摇床中，于28℃、150rpm/min诱导6h；
1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：将收集的菌液离心，PBS清洗两遍，加入超声裂解液20mMNaH2PO4，300mM NaCl，pH 7.4，重悬菌体，加入终浓度500μg/ml溶菌酶和1mM PMSF，混匀后，冰上孵育15min；冰上超声破碎仪破碎处理，超声条件：20％W，开5s，停10s，超声20min；超声结束后，4℃，12000rpm离心20min，收集上清溶液进行纯化；
1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化表达的Annexin V蛋白，用平衡缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白；用PBS缓冲液，10kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后Annexin V蛋白，BCA法对蛋白定量；
1.5：AnnexinV蛋白巯基化：将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于DMSO中配制10mg/ml母液；调整AnnexinV蛋白浓度为5mg/ml，按照AnnexinV与SPDP摩尔比1:20加入SPDP母液。轻轻混匀，室温搅拌反应2小时；反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子；脱盐后的AnnexinV-SPDP溶液中加入DTT至终浓度50mM，轻轻混匀后，室温静止反应30min；反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；
步骤二：别藻蓝蛋白(APC)衍生化：取APC溶液5mg/ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，加入PBS重悬沉淀，利用脱盐柱对APC脱盐处理，脱盐后调整浓度为5mg/ml；将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于DMSO中配制10mg/ml母液；按照APC与SMCC摩尔比1:20加入SMCC母液；轻轻混匀，用铝箔纸封好反应混合物，室温搅拌反应2小时；反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；
步骤三：APC-SMCC与AnnexinV-SPDP共价偶联：按照APC-SMCC与AnnexinV-SPDP摩尔比1.2:1混合后，室温搅拌孵育4h。孵育结束后加入N-乙基马来酰胺(NEM)至终浓度5μM，终止反应；得到AnnexinV-APC；
步骤四：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上述偶联的AnnexinV-APC，用平衡缓冲液平衡层析柱，将偶联的AnnexinV-APC总蛋白上柱，用平衡缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，用PBS缓冲液，50kD的透析袋对具有活性的Annexin V-APC进行透析过夜，收集透析后偶联产物AnnexinV-APC。
4.根据权利要求1所述一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，所述步骤1.2中取未加诱导剂的菌液作为未诱导对照。
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