CN111499699A - 一种新型冠状病毒covid-19-n蛋白表达和纯化的方法 - Google Patents

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张进
钟芳林
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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒COVID‑19‑N蛋白表达和纯化的方法，步骤有：构建并转化COVID‑19‑N蛋白表达质粒；取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基培养，加入IPTG诱导培养；培养液离心，重悬，破碎后离心，取上清，选用镍柱纯化；依次用不同咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将纯化的COVID‑19‑N蛋白进行透析。本发明的有点有：使用Pet‑28a载体，利用大肠杆菌表达系统得到高产量、纯度高达98％以上的COVID‑19‑N蛋白，免疫原性高，稳定性好。该制备方法耗费成本低、操作简单，可重复性高，可投入大量生产。

Description

一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白制备技术。
背景技术
新型冠状病毒(下简称新冠病毒)感染肺炎传播性强、传染速度快、致死率高，对此新冠病毒检测以及治疗药物研究显得尤为重要。
COVID-19-N蛋白是新冠病毒衣壳内最重要的蛋白之一，也是含量最丰富的蛋白。COVID-19-N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时，COVID-19-N蛋白在新冠病毒中相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗COVID-19-N蛋白的高水平抗体。因此，它常作为新冠病毒的诊断检测工具，是免疫学快速诊断的核心原料，也可以用来进一步制备单抗或开展解析该蛋白结构等研究。然而，市面上制备COVID-19-N蛋白主要采用哺乳动物细胞蛋白表达系统表达，该过程需要耗费大量昂贵的培养基且实验周期长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，解决生产成本高、生产周期长的问题，为免疫学快速诊断、制备单抗、开展解析蛋白结构研究等提供物质基础。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，包括如下步骤：
(1)构建COVID-19-N蛋白表达质粒；
(2)将COVID-19-N蛋白表达质粒转化；
(3)诱导培养表达COVID-19-N蛋白，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间，加入IPTG诱导培养；
(4)纯化COVID-19-N蛋白，操作包括：将诱导表达后的大肠杆菌培养液离心，收集沉淀物即菌体，重悬在重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用不同咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将纯化的COVID-19-N蛋白进行透析。
进一步地，所述步骤(3)详细过程是：取100μL菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为1mmol，30℃，200rpm，诱导6h。
进一步地，所述步骤(4)的详细过程是：
将诱导表达后的大肠杆菌培养液以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HClpH7.5,300mM NaCl，2mmDTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用20倍柱体积含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液。300mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白COVID-19-N蛋白，将纯化的COVID-19-N蛋白进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl。
进一步地，所述步骤(1)是：将编码人COVID-19-N蛋白的基因克隆到pET-28a载体中，构建表达质粒，制得COVID-19-N质粒冻干粉。
进一步地，所述步骤(2)详细过程是：将5μg COVID-19-N质粒冻干粉在12000rpm离心5min，加入30μL去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min；取2μl上清液转化到Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μL的LB液体培养基，37℃，150rpm，摇床培养1h，取30μL培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
利用大肠杆菌蛋白表达系统可在短时间内获得大量COVID-19-N蛋白，本发明的纯化方法可获得纯度高达98％以上、稳定性好的COVID-19-N蛋白；整个COVID-19-N蛋白表达和纯化过程耗费成本低、操作简单、可重复性高，可投入大量生产过程。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为COVID-19-N蛋白透析前的SDS-PAGE试验实验图；
图2为COVID-19-N蛋白透析后的SDS-PAGE试验实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
1、COVID-19-N蛋白表达质粒的构建
将编码人COVID-19-N蛋白的基因克隆到pET-28a载体中，以构建表达质粒，此项工作委托上海捷瑞生物工程有限公司完成，COVID-19-N蛋白大小为46kDa，编码人COVID-19-N蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示：
GGATCCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAAC TAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAACTCGAG
先构建好重组质粒，再将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中，涂板于含有50μg/ml抗生素Kan+的LB平板上培养，挑选菌落，质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆。验证成功后，构建表达质粒，最后得到COVID-19-N质粒冻干粉。
2、COVID-19-N蛋白表达质粒的转化
将5μgCOVID-19-N质粒冻干粉在12000rpm离心5min,加入30μL去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。取2μL上清液转化到Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)感受态菌株中,冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μL的LB液体培养基，37℃，150rpm，摇床培养1h，取30μL培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
3、COVID-19-N蛋白的诱导表达
取100μL菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为1mmol，30℃，200rpm，诱导6h。
4、COVID-19-N蛋白的纯化
将诱导表达后的大肠杆菌培养液以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HClpH7.5,300mM NaCl，2mmDTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中。高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀。选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化实验，经过数次实验，对蛋白纯化条件进行优化。镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5,300mMNaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡。再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用20倍柱体积含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液。需要说明的是，洗脱液就是以平衡柱子所用的平衡缓冲液加入相应浓度的咪唑而得到的。300mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白COVID-19-N蛋白，进行SDS-PAGE试验，结果如图1所示，将纯化的COVID-19-N蛋白进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl。透析结束后得到纯度为98％的COVID-19-N蛋白。随后进行SDS-PAGE试验，结果如图2所示。把图1与图2比较可知，透析后比透析前目的蛋白浓度显著提高。
本发明使用Pet-28a载体，利用大肠杆菌表达系统得到高产量、纯度高达98％以上的COVID-19-N蛋白，免疫原性高，稳定性好。该制备方法耗费成本低、操作简单，可重复性高，可投入大量生产。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 深圳晶蛋生物医药科技有限公司
江西晶美瑞生物医药有限公司
李健
张进
钟芳林
万双燕
<120> 一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人种(Homo)
<400> 1
ggatccatgt ctgataatgg accccaaaat cagcgaaatg caccccgcat tacgtttggt 60
ggaccctcag attcaactgg cagtaaccag aatggagaac gcagtggggc gcgatcaaaa 120
caacgtcggc cccaaggttt acccaataat actgcgtctt ggttcaccgc tctcactcaa 180
catggcaagg aagaccttaa attccctcga ggacaaggcg ttccaattaa caccaatagc 240
agtccagatg accaaattgg ctactaccga agagctacca gacgaattcg tggtggtgac 300
ggtaaaatga aagatctcag tccaagatgg tatttctact acctaggaac tgggccagaa 360
gctggacttc cctatggtgc taacaaagac ggcatcatat gggttgcaac tgagggagcc 420
ttgaatacac caaaagatca cattggcacc cgcaatcctg ctaacaatgc tgcaatcgtg 480
ctacaacttc ctcaaggaac aacattgcca aaaggcttct acgcagaagg gagcagaggc 540
ggcagtcaag cctcttctcg ttcctcatca cgtagtcgca acagttcaag aaattcaact 600
ccaggcagca gtaggggaac ttctcctgct agaatggctg gcaatggcgg tgatgctgct 660
cttgctttgc tgctgcttga cagattgaac cagcttgaga gcaaaatgtc tggtaaaggc 720
caacaacaac aaggccaaac tgtcactaag aaatctgctg ctgaggcttc taagaagcct 780
cggcaaaaac gtactgccac taaagcatac aatgtaacac aagctttcgg cagacgtggt 840
ccagaacaaa cccaaggaaa ttttggggac caggaactaa tcagacaagg aactgattac 900
aaacattggc cgcaaattgc acaatttgcc cccagcgctt cagcgttctt cggaatgtcg 960
cgcattggca tggaagtcac accttcggga acgtggttga cctacacagg tgccatcaaa 1020
ttggatgaca aagatccaaa tttcaaagat caagtcattt tgctgaataa gcatattgac 1080
gcatacaaaa cattcccacc aacagagcct aaaaaggaca aaaagaagaa ggctgatgaa 1140
actcaagcct taccgcagag acagaagaaa cagcaaactg tgactcttct tcctgctgca 1200
gatttggatg atttctccaa acaattgcaa caatccatga gcagtgctga ctcaactcag 1260
gcctaactcg ag 1272

Claims (5)

1.一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)构建COVID-19-N蛋白表达质粒；
(2)将COVID-19-N蛋白表达质粒转化；
(3)诱导培养表达COVID-19-N蛋白，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间，加入IPTG诱导培养；
(4)纯化COVID-19-N蛋白，操作包括：将诱导表达后的大肠杆菌培养液离心，收集沉淀物即菌体，重悬在重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用不同咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将纯化的COVID-19-N蛋白进行透析。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，其特征在于：
所述步骤(3)详细过程是：取100μL菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间；加入IPTG，使终浓度为1mmol，30℃，200rpm，诱导6h。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，其特征在于：
所述步骤(4)的详细过程是：
将诱导表达后的大肠杆菌培养液以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl，2mmDTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用20倍柱体积含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；300mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白COVID-19-N蛋白，将纯化的COVID-19-N蛋白进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，其特征在于：
所述步骤(1)是：将编码人COVID-19-N蛋白的基因克隆到pET-28a载体中，构建表达质粒，制得COVID-19-N质粒冻干粉。
5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒COVID-19-N蛋白表达和纯化的方法，其特征在于：
所述步骤(2)详细过程是：将5μg COVID-19-N质粒冻干粉在12000rpm离心5min，加入30μL去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min；取2μl上清液转化到Escherichia coli BL21Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μL的LB液体培养基，37℃，150rpm，摇床培养1h，取30μL培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
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