CN110777138A - 一种利用gem去除重组蛋白内毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，它涉及一种去除大肠杆菌表达重组蛋白中内毒素的方法，蛋白‑AcmA融合蛋白重组表达载体，诱导表达后利用GEM(革兰氏阳性基质)进行纯化固定化，然后利用Triton X‑114处理固定化蛋白以去除内毒素。该方法可以在低温(4℃)下进行内毒素的去除工作，避免温度改变影响蛋白活性，并简化去除内毒素操作。

Description

一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法
技术领域
本发明涉及一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法。
背景技术
蛋白可以作为酶用于催化，同时也可以作为药物用于疾病治疗。野生菌产天然蛋白存在产量低、纯化方式复杂的缺点。利用重组表达可以改善这些缺点。利用IPTG进行诱导可以实现过表达，极大的提高产量，同时通过添加标签可以简化纯化。
细菌内毒素(endotoxin)又称为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分之一。大肠杆菌重组表达中，在破碎细菌获得蛋白的同时细胞壁内的内毒素也大量释放到蛋白溶液中，内毒素的存在可以在动物或人体内引起强烈的炎症反应，如发热、凝血，甚至休克、死亡等。因此在重组大肠杆菌蛋白药物的纯化中，需要尽可能的去除内毒素。传统的方法是利用Triton X-114液相分离法去除内毒素，Triton X-114是一种聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂，能够通过液相分离的方法萃取内毒素分子从而使其去除。在蛋白溶液中加入1％的Triton X-114，冰上结合，然后37℃作用使Triton X-114与水相不互溶，再通过离心收集上层的水相，得到不含内毒素的蛋白溶液。该方法利用了37℃下Triton X-114与水不溶的特点，实现了两个液相分离。但是该方法中需要升温(37℃)降温(4℃)，反复升温降温可能会破坏蛋白活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，解决现有技术中需要升温和降温去除内毒素，反复升温降温可能会破坏蛋白活性的问题。
本发明一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，按照以下步骤进行：
1)构建L-天门冬酰胺酶-AcmA融合表达载体；
2)利用IPTG诱导表达；
3)制备GEM；
4)GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶-AcmA；
5)内毒素的去除。
在步骤1)中，利用以大肠杆菌AS 1.357基因组为模板，扩增得到L-天门冬酰胺酶的基因，连接到质粒pET28a-AcmA，得到重组表达质粒pET28a-LA-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。
在步骤2)中，划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。
在步骤3)中，利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤，得到GEM。
在步骤4)中，4000rpm离心收集诱导后的菌体，利用预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)洗涤去除培养基，将菌体重悬于预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，超声破碎细胞，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取上清与步骤3)制备的GEM混匀，磁力搅拌进行结合，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀。
在步骤5)中，利用1％的Triton X-114(4℃)重悬固定化重组L-天门冬酰胺酶-AcmA，冰上结合30分钟，8000rpm离心10分钟(4℃)，弃上清，重复洗涤四次。
有益效果：
本发明方法可以在低温下去除固定于GEM上的重组蛋白的内毒素，该方法具有简单易行、降低蛋白活性损失、低温操作的优点。
本发明方法带有AcmA的重组蛋白可以结合到GEM上，GEM属于固体，可以通过离心与液相分离，可以实现在低温下将目的蛋白从1％Triton X-114分离的作用，避免了反复改变温度，同时可以简化去除内毒素工作。本发明方法以重组L-天门冬酰胺酶为例，利用GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶，然后去除内毒素。
附图说明
图1重组L-天门冬酰胺酶重组表达；M：蛋白Marker；1、2：诱导前后全菌蛋白组成；3、4：诱导后超声破碎离心分离得到的上清和沉淀；
图2 GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶；M：蛋白Marker；1：上清；2：GEM；3：GEM纯化固定化上清中的L-天门冬酰胺酶；4：纯化固定化的残留的上清；
图3去除内毒素对酶活影响；a：四轮去除内毒素的SDS-PAGE；b：四轮去除内毒素对酶活影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：L-天门冬酰胺酶-AcmA的构建与表达
1)载体构建
利用以大肠杆菌AS 1.357基因组为模板，扩增得到L-天门冬酰胺酶的基因，连接到质粒pET28a-AcmA，得到重组表达质粒pET28a-LA-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。
2)诱导表达
划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。利用SDS-PAGE分析重组表达情况，结果如图1所示，诱导表达得到了目的蛋白，重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。
实施例2：GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶
1)GEM制备
利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤，得到GEM。
2)GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶-AcmA
4000rpm离心收集诱导后的菌体，利用预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)洗涤去除培养基，将菌体重悬于预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，超声破碎细胞，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取上清与步骤3)制备的GEM混匀，磁力搅拌进行结合，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀。利用SDS-PAGE分析纯化情况，结果如图2所示，GEM能够将绝大部分带有AcmA标签的重组蛋白进行结合，达到纯化的目的。
本实施例利用制备的GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶。
实施例3：内毒素去除
利用1％的Triton X-114(4℃)重悬固定化重组L-天门冬酰胺酶-AcmA，冰上结合30分钟，8000rpm离心10分钟(4℃)，弃上清，重复洗涤四次。利用SDS-PAGE进行分析，结果如图3a所示。测定四轮去除后的酶活，结果如图3b所示，经过四轮清除工作后，仍然保存超过80％的相对酶活。
本实施例利用1％的Triton X-114在低温条件下(4℃)进行内毒素去除工作，可以保障蛋白酶活。

Claims (6)

1.一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，其特征在于,包括以下步骤：
1)构建L-天门冬酰胺酶-AcmA融合表达载体；
2)利用IPTG诱导表达；
3)制备GEM；
4)GEM纯化固定化重组L-天门冬酰胺酶-AcmA；
5)内毒素的去除。
2.根据权利要求1所述的一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，其特征在于，所述步骤1)利用以大肠杆菌AS 1.357基因组为模板，扩增得到L-天门冬酰胺酶的基因，连接到质粒pET28a-AcmA，得到重组表达质粒pET28a-LA-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。
3.根据权利要求1所述的一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，其特征在于，所述步骤2)划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，其特征在于，所述步骤3)利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分钟，8000rpm离心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤，得到GEM。
5.根据权利要求1所述的一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，其特征在于，所述步骤4)4000rpm离心收集诱导后的菌体，利用预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)洗涤去除培养基，将菌体重悬于预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，超声破碎细胞，2秒超声破碎，4秒停顿，超声时间为20分钟，8000rmp离心20分钟分离，取上清与步骤3)制备的GEM混匀，磁力搅拌进行结合，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用预冷的50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀。
6.根据权利要求1所述的一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，其特征在于，所述步骤5)利用1％的Triton X-114(4℃)重悬固定化重组L-天门冬酰胺酶-AcmA，冰上结合30分钟，8000rpm离心10分钟(4℃)，弃上清，重复洗涤四次。
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