CN111154792A

CN111154792A - 一种隐孢子虫蛋白激酶660 c端蛋白的制备及其应用

Info

Publication number: CN111154792A
Application number: CN202010027841.7A
Authority: CN
Inventors: 冯耀宇; 张晨远; 李娜; 肖立华; 郭亚琼
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明公开了一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备及其应用，包括如下步骤：S1.以SEQ ID NO：1～2所示扩增引物PCR扩增反应得到Cp660C基因片段；S2.将Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；S3.将Cp660C重组质粒转入表达宿主菌，挑取阳性克隆菌；S4.将阳性克隆菌扩大培养至生长对数期，诱导表达；S5.诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，滤膜过滤；S6.取步骤过滤后上清液经Ni柱纯化，洗脱，收集目的蛋白。本发明方法能够得到高纯度、高抗原特异性的重组蛋白，所纯化得到的蛋白能够进一步用于隐孢子虫蛋白功能性分析研究。

Description

一种隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的体外重组蛋白的制备及其应用。

背景技术

隐孢子虫是一种人兽共患寄生原虫，在全世界流行，它的宿主范围广泛，包括野生动物、伴侣动物或者经济动物，甚至人类均可感染隐孢子虫。隐孢子虫病主要引起轻到重度腹泻和呕吐，尤其是在幼龄个体中引起厌食、水样腹泻、腹痛、呕吐、疲劳以及低烧等症状。隐孢子虫病病程因宿主机体免疫力而定，免疫良好机体发生自限性腹泻和持续性的胃肠道疾病，成为带虫宿主；而对于免疫缺陷病人如艾滋病人或免疫系统不完善的个体如婴幼儿，则会引起严重的腹泻，甚至引起死亡。

隐孢子虫可以感染几乎所有的脊椎动物。对于一岁以内的幼龄经济动物如牛、羊和猪，累计感染率接近100％，近年来，伴侣动物如猫、狗，野生动物如非人灵长类动物等的隐孢子虫感染率大幅提升。在70多个已知的虫种和基因型中，有超过20个能够对人类造成不同程度的感染。根据2015年世界卫生组织公布的数据，隐孢子虫病造成860万人患病，3759人死亡以及296156人残疾。在24种食源性寄生虫病原体中，隐孢子虫位列第五，在发展中国家儿童腹泻的病例中，隐孢子虫成为第二号病原。一方面是因为人们对于隐孢子虫的认识不够从而未能引起足够的重视，另一方面是现有的卫生条件不足以清除宿主范围广泛的隐孢子虫。

由于大规模爆发疾病，大多数发达国家以及部分发展中国家如中国将隐孢子虫作为一种法定传染病病原加以控制，使得隐孢子虫成为了我国现有水质标准中仅有的两个病原之一。

目前，由于人们对于隐孢子虫的入侵机制知之甚少，使得研发隐孢子虫病药物进程受阻。对于经济动物来说，卤夫酮乳酸盐(halofuginone lactate)是唯一注册的治疗家畜的有效药物，但这种药物的局限性在于，它需要连续给药7天，且只能治疗腹泻时间低于24小时的小牛。对于人类来说，硝唑尼特(Nitazoxanide)是美国FDA唯一批准用于治疗大于12个月的幼龄儿童的药物，但它对于HIV/AIDS病人来说没有治疗效果，即使是高剂量治疗。

与大多数顶复门原虫相似，隐孢子虫为了适应消化道内的厌氧环境，一些真核生物共有的细胞器，如核糖体、线粒体和叶绿体等获取营养物质和能量转换的结构逐渐退化，进而进化出一些独特的分泌型细胞器，如微线体、棒状体和致密颗粒，它们在虫子整个生活史中占据了举足轻重的地位。其中，微线体与棒状体位于虫体顶端，致密颗粒分布于虫体全身，就功能而言，微线体分泌的蛋白主要与宿主细胞的粘附有关，棒状体分泌蛋白与纳虫空泡形成过程有关，而致密颗粒分泌的蛋白则与入侵宿主细胞过程有关。

隐孢子虫全基因组测序的完成以及对基因功能的注释为我们研究隐孢子虫致病机理提供了新方向。我们发现，蛋白酶(protease)是隐孢子虫的蛋白家族中数量最多的成员，它在顶复门原虫的入侵和发育中起到了至关重要的作用，顶复门原虫具有保守的入侵机制，而隐孢子虫的入侵机制则更为保守。入侵期间，虫体细胞器蛋白的分泌、修饰、活化以及作用与宿主细胞膜均以蛋白酶密切相关。而在这其中，有一种虫种间以及虫种内均有高度多态性的蛋白酶，其主要功能结构域集中在蛋白C端，这不仅是潜在的种间遗传进化的标志，也是调控种内不同毒力的潜在蛋白。例如微小隐孢子虫蛋白酶660，研究表明，660 C端蛋白在不同虫种间的氨基酸序列相似度不到90％，且在同一虫种不同亚型之间存在着氨基酸的缺失与增添。因为没有纯化得到此类蛋白，因此对此功能尚未能够得到有效验证。由于此类蛋白酶分子量过大，且其功能尚未确定，体外表达过程中常出现微量表达甚至无法表达或表达过程中出现自切降解等问题，影响后续蛋白功能及酶学的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述制备方法在蛋白激酶660功能验证中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S1.以隐孢子虫基因组DNA为模板，SEQ ID NO：1～2所示序列为扩增引物，PCR扩增得到Cp660C基因片段；

S2.将S1所述将扩增得到的Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；

S3.将S2的Cp660C重组质粒转入表达宿主菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，挑取阳性克隆菌，保存；

S4.将S3挑取的阳性克隆菌扩大培养，当菌体生长至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件16℃，180rpm，诱导12h；

S5.取S4诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，以1:100比例添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤；

S6.取步骤S5中过滤后上清液经Ni柱纯化，洗脱，收集目的蛋白。

本发明利用SEQ ID NO：1～2所示序列为扩增引物，通过PCR扩增反应得到片段长度大小为1107bp的Cp660C基因片段；通过创造性的选择上述功能结构域片段进行表达的方式，提高了表达蛋白的产量的同时又不影响后续的功能验证；同时，本发明通过特定宿主菌的转导、低温诱导以及改良IPTG浓度和诱导时间的方式，提高了表达蛋白的可溶性；并在裂解菌体过程中添加一定比例蛋白酶抑制剂的方式，保护了表达蛋白的完整性；从而成功在体外纯化得到具有高纯度、高抗原特异性的蛋白激酶660 C端重组蛋白，即可用于蛋白的功能验证，无需获得完整的蛋白激酶660序列。

优选地，步骤S1所述PCR扩增反应体系为：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 5μL，5x Phusion HF buffer 10μL，ddH₂O 28.5μL，一共50μL。

优选地，步骤S1所述PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环；最后72℃延伸7min。

优选地，步骤S2所述原核表达质粒为pET-28a质粒。

优选地，步骤S5具体为4℃离心收集菌体，8000rpm离心10min，弃上清；用25mL PBS清洗菌体，反复清洗3～5次；每100mL菌液加10ml PBS重悬菌体，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂；超声裂解菌体，工作效率为45％，工作时长2s，暂停时长4s，共时长40～60min，过程在冰浴中进行；裂解后的菌液4℃离心，8000rpm，10min，收集上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤。

更优选地，所述蛋白酶抑制剂的添加比例为1:100。

优选地，步骤S6所述Ni柱在加入蛋白样品前先加入5倍柱体积无离子水将填料中的20％乙醇洗涤干净；再用5倍柱体积pH＝8.0结合缓冲液平衡Ni柱。

优选地，所述洗脱为将蛋白样品加入Ni柱中，使之与树脂混合均匀，冰上孵育20min；将样品反复上柱3次，样品与Ni柱结合完全后，依次用5倍柱体积的结合缓冲液、20mM咪唑溶液、40mM咪唑溶液、80mM咪唑溶液和100mM咪唑溶液进行充分洗脱杂蛋白，最后用5倍柱体积的200mM咪唑溶液收集目的蛋白。

本发明还请求保护上述任一所述的隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备方法在蛋白激酶660功能验证中的应用。本发明通过上述方法可以获得具有高纯度、高抗原特异性的重组蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备方法，通过选用功能结构域片段表达的方式，提高了表达蛋白的产量的同时又不影响后续的功能验证；通过特殊宿主菌的转导、低温诱导以及改良IPTG浓度和诱导时间的方式，提高了表达蛋白的可溶性；通过在裂解菌体过程中添加一定比例蛋白酶抑制剂的方式，保护了表达蛋白的完整性。

(2)本发明同时通过后续的蛋白酶纯化的方法解决了隐孢子虫蛋白酶在体外表达中易出现的蛋白无法挂柱及蛋白结构破坏等问题，能够得到高纯度、高抗原特异性的重组蛋白。所纯化得到的蛋白能够进一步用于功能性分析研究，为解决隐孢子虫蛋白功能领域的诸多问题奠定基础。

附图说明

图1为实施例1隐孢子虫蛋白激酶660 C基因片段扩增产物电泳图。

图2为实施例1重组质粒的扩增电泳图。

图3为实施例1诱导表达的蛋白电泳结果图。

图4为实施例1纯化后蛋白电泳结果图。

图5为对比例1隐孢子虫蛋白激酶660 C基因片段扩增产物电泳图。

图6为对比例1重组质粒的扩增电泳图。

图7为对比例1诱导表达的蛋白电泳结果图。

图8为对比例1隐孢子虫蛋白激酶660二级结构分析图。

图9为对比例1隐孢子虫蛋白激酶660功能结构域图。

图10为对比例2诱导表达的蛋白电泳结果图。

图11～图13对比例3诱导表达的蛋白电泳结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

一种隐孢子虫种间以及种内高度多态性蛋白酶660 C端蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1、Cp660C蛋白重组表达系统的构建

以隐孢子虫基因组DNA为模板，设计特异性扩增引物(SEQ ID NO：1～2)，

F：5’-CGCGGATCCAAGACTGGAGATTTGA-3’(SEQ ID NO：1)；

R：5’-CCGCTCGAGTTTAGGTGGAGGAGGT-3’(SEQ ID NO：2)；

PCR扩增反应体系为：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 5μL，5x Phusion HF buffer 10μL，ddH₂O 28.5μL，一共50μL。

PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环；最后72℃延伸7min。

通过PCR扩增得到片段长度大小为1107bp的Cp660C基因片段(SEQ ID NO：3)，扩增产物电泳图如图1所示。

将扩增得到的Cp660C基因片段与pET-28a质粒，经BamHI和XhoI双酶切，酶切产物经纯化后用T4连接酶进行连接，得到Cp660C重组质粒，命名为pET28a-Cp660C。将pET28a-Cp660C质粒转入表达菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中，经平板涂布，挑取单克隆，PCR电泳、PCR产物测序验证后确定重组质粒正确性(图2)，

然后进行菌种保存，命名为pET28a-Cp660C-BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL。

2、重组蛋白表达

将pET28a-Cp660C-BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL转接至液体培养基中进行放大培养：配置200mL的LB培养基，经高压灭菌冷却后加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，挑取pET28a-Cp660C-BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL单菌落进行过夜摇瓶培养，其后按2％接种量接入200mL新鲜的含卡那抗生素的LB培养基中，使菌体生长至对数生长期。

当菌体生长至OD600在0.6～0.8之间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件16℃，180rpm，诱导12h；诱导表达的蛋白电泳结果如图3所示，表明目的蛋白在预期大小处有表达，此外在预期大小位置上方有另一条清晰条带，经送基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测发现，二者具有相同的肽段，所以此蛋白为目的蛋白的二聚体，原因为：Cp660C蛋白的氨基酸序列中含有4个半胱氨酸，半胱氨酸容易形成二硫键，而二硫键能够将单体蛋白紧密的连接起来，因此形成了二聚体蛋白。

3、Cp660C蛋白的纯化

在4℃下离心收集pET28a-Cp660C-BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌体，8000rpm，10min，弃上清。用25ml PBS清洗菌体，反复清洗3～5次，然后重悬菌体(每100ml菌液加10mlPBS)，以1:100比例添加蛋白酶抑制剂。冰浴中超声裂解菌体，工作效率为45％，工作时长2s，暂停时长4s，共时长50min，溶液澄清透明呈微黄色。将裂解后的菌液在4℃，8000rpm，离心10min，收集上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤。

上柱洗脱，此过程均在冰上进行：

洗涤：往镍柱中加入5倍柱体积无离子水将填料中的20％乙醇洗涤干净；

平衡：5倍柱体积结合缓冲液(pH＝8.0)平衡镍柱；

洗脱：将样品加入镍柱中，使之与树脂混合均匀，冰上孵育20min；将样品反复上柱3次，样品与Ni柱结合完全后，依次用5倍柱体积的结合缓冲液、20mM咪唑溶液、40mM咪唑溶液、80mM咪唑溶液和100mM咪唑溶液进行充分洗脱杂蛋白，最后用5倍柱体积的200mM咪唑溶液收集目的蛋白。

维护镍柱：依次用5倍柱体积500mM咪唑溶液、无离子水、20％乙醇清洗柱子，最后用适量20％乙醇保存柱子。

SDS-PAGE：取20μl纯化后蛋白溶液与5μl 5×蛋白上样缓冲液混合均匀，100℃水浴5min，然后5000rpm离心5min。将样品加入到蛋白胶孔中，80v恒压电泳100min。

4、试验结果

SDS-PAGE结果如图4所示，表明纯化后的蛋白条带与预期的蛋白条带大小一致且无降解带出现。

对比例1

1、Cp660C蛋白重组表达系统的构建

以隐孢子虫基因组DNA为模板，设计特异性扩增引物(SEQ ID NO：4～5)，

F：5’-CCCGAGCTCTTTCTTCCGGTCAACA-3’(SEQ ID NO：4)；

R：5’-CCGCTCGAGCGTCAACTTTATGCTT-3’(SEQ ID NO：5)；

PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸140s，35个循环；最后72℃延伸7min，扩增产物电泳图如图5所示。

通过PCR扩增得到Cp660C基因片段(SEQ ID NO：6)

将扩增得到的Cp660C基因片段构建原核重组表达质粒，构建方法同实施例1，挑取单克隆，PCR电泳、PCR产物测序验证后确定重组质粒正确性(图6)，然后进行菌种保存，命名为pET28a-Cp660C-BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL。

2、重组蛋白表达

重组蛋白表达条件同实施例1；诱导表达的蛋白电泳结果如图7所示，目的蛋白的杂带较多，且表达量较低。

3、Cp660C蛋白的纯化

Cp660C蛋白的纯化条件同实施例1。

上述结果表明，引物(SEQ ID NO：1～2)能够很好地扩增目的片段并能成功表达大量的蛋白质。而引物(SEQ ID NO：4～5)引物扩增片段具有较多杂带，且回收量低，此外，由于蛋白分子量过大，蛋白表达量很低，不足以进行蛋白纯化实验。

这是因为扩增引物的合理设计与扩增片段的准确性和蛋白表达的含量相关，此外，蛋白二级结构分析(图8)以及功能结构域分析结果(图9)表明，蛋白C端为重要功能区，且截取片段不会破坏氨基酸序列结构的完整性。因此选择实施例1中所述c端的1107bp长度作为扩增片段。

对比例2

一种隐孢子虫种间以及种内高度多态性蛋白酶660 C端蛋白的制备方法，与实施例1基本相同，不同之处在于表达菌株不同，是将重组后的pET28a-Cp660C质粒转入表达菌株BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达生产蛋白。其诱导表达的蛋白电泳结果如图10所示，BL21(DE3)pLysS宿主菌表达660C蛋白时出现蛋白表达量较弱的情况，直接影响后期的蛋白纯化实验。这是因为同一种蛋白质的表达量因宿主菌的变化而有所差异，合适的宿主菌会增加异源蛋白的表达量，同时减弱背景蛋白表达。只有在实施例1所述表达菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中，660C蛋白才可以进行良好的表达，利于后续的蛋白纯化。

对比例3

一种隐孢子虫种间以及种内高度多态性蛋白酶660 C端蛋白的制备方法，与实施例1基本相同，不用之处在于蛋白诱导表达时条件不同，分别加入终浓度为0.1/0.5/1.0mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件分别为37/25/16℃，180rpm，诱导8/12/20h；诱导表达的蛋白电泳结果如图11～图13所示，在设置不同温度，改良IPTG浓度和诱导时间时，蛋白表达量出现明显的减少以及蛋白出现轻微的降解现象。只有在实施例1所述的诱导条件下，660C蛋白才可以进行良好的表达，利于后续的蛋白纯化。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备及其应用

<141> 2020-01-10

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<212> DNA

<213> 隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

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cgcggatcca agactggaga tttga 25

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ccgctcgagt ttaggtggag gaggt 25

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<211> 1107

<212> DNA

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<400> 3

aagactggag atttgacaaa aaatggttat atttgggcaa atatggctgg tactcctatt 60

ttcaaagata aaccaaaaat tgatctcgtt acggtaggtg aatcagtagg agtttttgtt 120

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ccgctcgagc gtcaacttta tgctt 25

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<212> DNA

<213> 隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

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aattctcttg attcctatta tttaaagttt tcacataaca atagcttatt aaaagttaaa 60

ccaaaaaaac atcttggaaa gtatttagct aaaatcaaaa aggtaattcc aacaaaaaaa 120

ccatctaagc catgttcatg ggaaacagtt ggtcctgcag ctcgtggttt aacatgcagt 180

ggaagtgttc acatgactac taggatggga aaagattcta cagtgaagaa aaatgaatta 240

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tggatggata atccaaagct tctcatcaaa actggtcaga aatctcatac aactaaaaaa 2460

tttacagaag ttcaaggact tggtacgccg ctatatcctg tagaaagtgg tgatgagatt 2520

accatctact caaaggtccc tggtatcttc agaattactt ctaaagatca gagacttgta 2580

caagaaggac aagccatcgg cgcattcgtt tattcattag gattagaata caatgccatg 2640

gtgtatgtta catcgccatg tactggaaaa atgacttatc cctcaagttc aatagaaaca 2700

atggatattt cagaaagttc tattggagga ttgaaaatat gttctgtatt atgtagttta 2760

gttgcaagaa ttgaacaagt cagttccaat gagcagcaat tatattttaa ctatgtttat 2820

tcttcttttg ggttagaagg ccaggaaaaa tgttacaagg ctacagctcg tgctggagta 2880

aaaattattt atactccaac catactctta tcttcttctg aatctttgaa tgtagaagct 2940

ggagatgaaa ttggattttt ggttcttgat gaaaatcgtt cttcacaagt cattatgaaa 3000

actccttgct ctggcgttat taaaggtcct gcatctctca agatgaaatc aggaagtaca 3060

tttgctgcag gcgatattat tttcaaagtt tactgtagct ctattagtac tcctgtaatt 3120

ggagatttgc ctttggcccc tcctttaagt gctttaagtg catctcctat ccagtattta 3180

cataatgatg ggtatgattt tgttattact tccaaccact gcaaaattag cttcaaaaat 3240

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cttagggtat tttgtggttc accttcagtc ccatctcaag ctatggaaat gactcctcca 3780

actgttcaac aactttctga agaagataga gatccaatta tgacaaaaaa tatgctcggg 3840

atatacacat tgtcttggcc gacgtataat ggtattgttc agtactctcc caactggatt 3900

gtttacacgc aaattgttct tcaggaagga acttcatttg gaacttttat ttacactgat 3960

gataatggaa agtctaaatc tgcaaatttg attgcttcct gtaatggaag gctggacaag 4020

agtgtcgctt ctaaagtaga tggaaaaatg gttaaagcag gggagagtgt tatttccaaa 4080

gtacactgcg taaatattcg ctatgttgat agctctttga gtgtatttga tgatgctagc 4140

gcaatttctt cccaattatc atctggaagt tcttcagggt catcttcatc agcaccacca 4200

ccaccaacac catcatcgcc ttcatcatca tcctcatcac cttcatctaa accccaaaaa 4260

ccttcaaaaa aacccgaaaa accaaaaaaa agcccaaagg cttcatctcc aaaagttaaa 4320

aagaaaaaag aggaacctga ttatacacaa ggtgattcag agagttattc gatggaagat 4380

gttaagaaaa ggctattaaa aaaaacaggc ttttctggct ctggaccgag aagtgatagt 4440

gccagtgctg ggagtggatc aaactcttca ccaccaccac caccaccacc accaccgcca 4500

ccgtcatcat catcttcacc gtcgccaccg cctcctccac ctccaccgcc accaccacca 4560

ccaccacctc caccaccgcc acctcctcca cctaaa 4596

Claims

1.一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以隐孢子虫基因组DNA为模板，SEQ ID NO：1～2所示序列为扩增引物，PCR扩增反应得到Cp660C基因片段；

S4.将S3挑取的阳性克隆菌扩大培养，当菌体生长至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，16℃，180rpm，诱导12h；

S5.取S4诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增反应体系为：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 5μL，5xPhusion HF buffer 10μL，ddH₂O 28.5μL，一共50μL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环；最后72℃延伸7min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述原核表达质粒为pET-28a质粒。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5具体为4℃离心收集菌体，8000rpm离心10min，弃上清；用25mL PBS清洗菌体，反复清洗3～5次；每100mL菌液加10mlPBS重悬菌体，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂；超声裂解菌体，工作效率为45％，工作时长2s，暂停时长4s，共时长40～60min，过程在冰浴中进行；裂解后的菌液4℃离心，8000rpm，10min，收集上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述Ni柱在加入蛋白样品前先加入5倍柱体积无离子水将填料中的20％乙醇洗涤干净；再用5倍柱体积pH＝8.0结合缓冲液平衡Ni柱。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱为将蛋白样品加入Ni柱中，使之与树脂混合均匀，冰上孵育20min；将样品反复上柱3次，样品与Ni柱结合完全后，依次用5倍柱体积的结合缓冲液、20mM咪唑溶液、40mM咪唑溶液、80mM咪唑溶液和100mM咪唑溶液进行充分洗脱杂蛋白，最后用5倍柱体积的200mM咪唑溶液收集目的蛋白。

8.权利要求1～7任一所述的隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法在蛋白激酶660功能验证中的应用。