CN110616227A - 一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用 - Google Patents

一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因，所述基因为黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因，其核苷酸序列为SEQ NO.2。本发明通过基因工程手段将人工合成的黄粉虫抗冻蛋白基因在大肠杆菌中成功地异源可溶性表达，获得了具有抗冻活性的抗冻蛋白，为科研及商业上应用抗冻蛋白提供了保障。

Description

一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌 株和应用
技术领域
本发明属于生物领域，尤其是一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用。
背景技术
抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一种可以保护机体在结冰或者亚结冰的条件下免受伤害的蛋白质，是长期生活在高山、极地等寒冷地区中的生物体为了抵抗低温冻害而分泌的一种可以阻止血液结冰的血清蛋白，最早是由DeVries在1969年于极地鱼类血淋巴中发现的。这种蛋白不仅可以在低温下抑制细胞内冰晶的增长，对动植物起到了很好的保护作用；而且还可以非依数性的降低溶液的冰点而保持溶液的熔点不变，使得溶液的冰点与熔点之间出现一个温度差值，这个差值被定义为热滞活性(thermalhysteresis activity，THA)，是体现抗冻蛋白活性大小的重要依据。抗冻蛋白以其独有的特殊功能和一些潜在的商业价值如食品行业上改变冰冻食品的特性，医学上器官移植时对细胞、组织、器官等的低温储藏以及冷冻手术上的应用等已经成功的引起了许多科研及商业人士的关注。
虽然抗冻蛋白在自然界中存在广泛，在鱼类、昆虫、植物、微藻类甚至是生活在南北两极的细菌体内都存在着，但是其绝对量非常少，很难满足科学研究及商业上的应用。为了解决抗冻蛋白产量不能满足需求的问题，一些研究者尝试着将编码抗冻蛋白的基因与不同的载体连接并在不同的的宿主菌中表达，但是其结果是抗冻蛋白大多以包涵体的形式存在。虽然对包涵体进行体外溶解及复性会获得抗冻蛋白，但是此过程会耗费大量的金钱以及浪费大量的时间，对于抗冻蛋白的研究及应用都存在很大的弊处，不利于抗冻蛋白的进一步发展。
昆虫抗冻蛋白被公认为是所有抗冻蛋白中具有超级活性的蛋白，但因其本身的复杂结构如具有大量的二硫键使得该蛋白的表达就成为了一项挑战。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用，本发明通过基因工程手段将人工合成的黄粉虫抗冻蛋白基因在大肠杆菌中成功地异源可溶性表达，获得了具有抗冻活性的抗冻蛋白，为科研及商业上应用抗冻蛋白提供了保障。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因，所述基因为黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因，其核苷酸序列为SEQ NO.2。
而且，所述黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因的核苷酸序列全长261bp，其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
一种利用如上所述的来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因构建的重组表达载体。
一种包含如上所述的重组表达载体的工程菌株。
一种如上所述的工程菌株的构建方法，步骤如下：
以敲除谷氧还蛋白还原酶基因gor和硫氧还蛋白还原酶基因trxB及发生突变的过氧化物氧化还原酶ahpC*的大肠杆菌为出发菌株，构建含有黄粉虫抗冻蛋白基因的重组大肠杆菌。
而且，具体步骤如下：
黄粉虫抗冻蛋白基因载体的制备：将长度为261bp的黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因插入到载体pET-DsbA中，形成表达载体pET-DsbA::TmAFP；
将表达载体pET-DsbA::TmAFP化转入出发菌株宿主菌E.coli Shuffle T7中，即获得黄粉虫抗冻蛋白工程菌株。
一种利用如上所述的工程菌株制备黄粉虫抗冻蛋白的方法，所述黄粉虫抗冻蛋白为使用黄粉虫抗冻蛋白工程菌发酵获得。
而且，具体步骤如下：
步骤一，将工程菌株由固体LB培养皿中接种到液体LB培养基中，在30℃的条件下培养，得到种子液；
步骤二，将上述种子液转接入液体LB培养基中，30℃培养其OD600为0.6时加入终浓度为0-10mM的IPTG诱导剂；
步骤三，将上述加过诱导剂的菌液转移至18–25℃培养箱中诱导培养18h；
步骤四，将上述菌液转入离心杯中，4℃离心，收集菌体；
步骤五，将上述收集到的菌体置于Tris-Cl缓冲液中悬浮，得到重悬后的菌体；
步骤六，用超声破碎仪破碎重悬后的菌体，即可得到破碎后的菌液；
步骤七，将上述破碎后的菌液在4℃的条件下离心，收集上清液，即得到黄粉虫抗冻蛋白粗酶液。
如上所述的抗冻蛋白AAD55256.1的基因在黄粉虫抗冻蛋白定向进化方面中的应用。
利用如上所述的抗冻蛋白AAD55256.1的基因在黄粉虫抗冻蛋白定向进化上的应用方法，步骤如下：
步骤一，对黄粉虫抗冻蛋白基因序列片段引入突变位点：将长度为261bp的黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因插入到载体pET-DsbA中，形成表达载体pET-DsbA::TmAFP；以表达载体pET-DsbA::TmAFP为模板，通过重叠延伸PCR反应扩增获得带有突变位点的基因TmAFPmut序列片段；
步骤二，构建黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变库：将所述基因TmAFPmut序列片段与载体pET-DsbA连接，将连接体系化转至E.coli Shuffle T7，经转化子验证获得黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变库；
步骤三，黄粉虫抗冻突变蛋白的获得：对突变库中的转化子进行诱导培养，离心获得菌体，加入细胞裂解缓冲液振荡，离心收集上清液，上清液即为突变抗冻蛋白粗酶液；
步骤四，筛选：将所述突变抗冻蛋白粗酶液使用微升渗透压计测定其活性，将活性提高倍数高的前20％的突变株挑选出来并进行重复培养，再次测定其活性，与第一次测定结果进行比较；
步骤五，纯化验证：将初筛和复筛活性测定结果一致的突变株进行扩大培养，纯化获得黄粉虫抗冻突变蛋白纯酶液，借助纳升渗透压计测定所述纯酶液的热值活性；
步骤六，测序：将验证正确的突变株培养后提取质粒，测序，获得其突变序列。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明基于抗冻蛋白在自然界存在广泛但其绝对量非常少，难以满足科研及商业上应用的现状，通过基因工程手段将人工合成的黄粉虫抗冻蛋白基因在大肠杆菌中成功地异源可溶性表达，获得了具有抗冻活性的抗冻蛋白，为科研及商业上应用抗冻蛋白提供了保障。
2、本发明成功地将定向进化技术应用到黄粉虫抗冻蛋白活性提高上，为获的更优质的抗冻蛋白提供了有效的技术手段。
3、本发明方法成功地将黄粉虫抗冻蛋白表达质粒pET-DsbA::TmAFP在大肠杆菌Shuffle T7中表达，且表达产物为可溶性的并具有生物活性。通过优化蛋白表达条件，获得了黄粉虫抗冻蛋白在E.coli Shuffle T7中表达的最佳表达条件。将定向进化技术运用到抗冻蛋白生物活性提高的方向上，最终成功的获得了一株活性提高的突变株，其热滞活性提高了50％。
附图说明
图1为本发明中TmAFP基因表达质粒的菌落PCR验证图，其中M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，以合成的黄粉虫抗冻蛋白基因为模板，1-3为菌落PCR扩增TmAFP基因，大小为261bp；
图2为本发明中对TmAFP基因表达质粒pET-DsbA::TmAFP的双酶切验证图，其中M为DNA Marker，1和2为BamH I和Hind III双酶切验证质粒；
图3为本发明中在探究诱导条件起始OD600获得的黄粉虫抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，M为蛋白marker的SDS-PAGE蛋白电泳图；0.2-1.5为不同OD600时加入诱导剂诱导获得的抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图；
图4为本发明中探究诱导条件诱导剂IPTG浓度获得的黄粉虫抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，M为蛋白marker的SDS-PAGE蛋白电泳图；0.1–10.0为不同终浓度IPTG诱导时获得的抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图；
图5为本发明中探究诱导条件诱导温度获得的黄粉虫抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，M为蛋白marker的SDS-PAGE蛋白电泳图；18、25、30和37分别为不同诱导温度诱导时获得的抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图；
图6为本发明中制备得到的黄粉虫抗冻蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，M为蛋白marker的SDS-PAGE蛋白电泳图；1为细胞重悬液超声破碎后混合液的SDS-PAGE蛋白电泳图；2为细胞重悬液超声破碎后上清液的SDS-PAGE蛋白电泳图；3和4为抗冻蛋白粗酶液流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；5、6和7为清洗缓冲液流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；8和9为洗脱缓冲液流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图7为本发明中对纯化获得的黄粉虫抗冻蛋白抗冻活性的测定结果图；
图8为本发明中运用定向进化技术获得的突变蛋白活性提高倍数图，其中，1为原始黄粉虫抗冻蛋白活性倍数；2-5为突变的抗冻蛋白活性提高倍数；
图9为本发明中对不同突变蛋白进行纯化得到的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，M为蛋白marker的SDS-PAGE蛋白电泳图；1为对照蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图；2为抗冻蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图；3-6为突变蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图；。
图10为本发明中运用定向进化技术获得的突变抗冻蛋白与原始抗冻蛋白进行活性比较的结果图，其中，NC为对照蛋白的活性测定曲线；PC为原始抗冻蛋白的活性测定曲线；P25C3、P26C4、P27B8以及P27F1为突变抗冻蛋白的活性测定曲线。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因，所述基因为黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因，其核苷酸序列为SEQ NO.2。
较优地，所述黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因的核苷酸序列全长261bp，其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
一种利用如上所述的来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因构建的重组表达载体。
一种包含如上所述的重组表达载体的工程菌株。
一种如上所述的工程菌株的构建方法，步骤如下：
以敲除谷氧还蛋白还原酶基因gor和硫氧还蛋白还原酶基因trxB及发生突变的过氧化物氧化还原酶ahpC*的大肠杆菌为出发菌株，构建含有黄粉虫抗冻蛋白基因的重组大肠杆菌。
较优地，具体步骤如下：
黄粉虫抗冻蛋白基因载体的制备：将长度为261bp的黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因插入到载体pET-DsbA中，形成表达载体pET-DsbA::TmAFP；
将表达载体pET-DsbA::TmAFP化转入出发菌株宿主菌E.coli Shuffle T7中，即获得黄粉虫抗冻蛋白工程菌株。
一种利用如上所述的工程菌株制备黄粉虫抗冻蛋白的方法，所述黄粉虫抗冻蛋白为使用黄粉虫抗冻蛋白工程菌发酵获得。
较优地，具体步骤如下：
步骤一，将工程菌株由固体LB培养皿中接种到液体LB培养基中，在30℃的条件下培养，得到种子液；
步骤二，将上述种子液转接入液体LB培养基中，30℃培养其OD600为0.6时加入终浓度为0-10mM的IPTG诱导剂；
步骤三，将上述加过诱导剂的菌液转移至18–25℃培养箱中诱导培养18h；
步骤四，将上述菌液转入离心杯中，4℃离心，收集菌体；
步骤五，将上述收集到的菌体置于Tris-Cl缓冲液中悬浮，得到重悬后的菌体；
步骤六，用超声破碎仪破碎重悬后的菌体，即可得到破碎后的菌液；
步骤七，将上述破碎后的菌液在4℃的条件下离心，收集上清液，即得到黄粉虫抗冻蛋白粗酶液。
较优地，在所述步骤五中，
优选的，所述诱导条件为在18℃的条件下，向培养基中加入终浓度为1mM IPTG诱导培养18h；所述Tris-Cl缓冲液的浓度为20mM，pH为8.0。
如上所述的抗冻蛋白AAD55256.1的基因在黄粉虫抗冻蛋白定向进化方面中的应用。
利用如上所述的抗冻蛋白AAD55256.1的基因在黄粉虫抗冻蛋白定向进化上的应用方法，步骤如下：
步骤一，对黄粉虫抗冻蛋白基因序列片段引入突变位点：将长度为261bp的黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因插入到载体pET-DsbA中，形成表达载体pET-DsbA::TmAFP；以表达载体pET-DsbA::TmAFP为模板，通过重叠延伸PCR反应扩增获得带有突变位点的基因TmAFPmut序列片段；
步骤二，构建黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变库：将所述基因TmAFPmut序列片段与载体pET-DsbA连接，将连接体系化转至E.coli Shuffle T7，经转化子验证获得黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变库；
步骤三，黄粉虫抗冻突变蛋白的获得：对突变库中的转化子进行诱导培养，离心获得菌体，加入细胞裂解缓冲液振荡，离心收集上清液，上清液即为突变抗冻蛋白粗酶液；
步骤四，筛选：将所述突变抗冻蛋白粗酶液使用微升渗透压计测定其活性，将活性提高倍数高的前20％的突变株挑选出来并进行重复培养，再次测定其活性，与第一次测定结果进行比较；
步骤五，纯化验证：将初筛和复筛活性测定结果一致的突变株进行扩大培养，纯化获得黄粉虫抗冻突变蛋白纯酶液，借助纳升渗透压计测定所述纯酶液的热值活性；
步骤六，测序：将验证正确的突变株培养后提取质粒，测序，获得其突变序列。
本发明中来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白(AAD55256.1)的氨基酸序列(SEQ NO.1)，该氨基酸序列全长112aa，其中前28个氨基酸为信号肽序列(本发明在优化合成核苷酸序列时将其删除)，该蛋白氨基酸序列中存在四个重复的模体(motif)，其序列为Thr-Cys-Thr-X-Ser-X-X-Cys-X-X-Ala-X(模体中X可以为任意的氨基酸)，这个重复的模体即为抗冻蛋白与冰晶结合的结合位点，为该蛋白的活性中心。
本发明中抗冻蛋白优化合成之后的核苷酸序列(删除了该蛋白的信号肽部分)，核苷酸序列如SEQ NO.2所示：该序列全长261bp，其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子，该黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因的核苷酸序列可用于构建重组表达载体。
本发明的相关制备及检测如下：
实施例1
一、黄粉虫抗冻蛋白表达质粒及黄粉虫抗冻蛋白工程菌的构建
构建过程按照如下步骤进行：
(1)根据在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上检索到的黄粉虫抗冻蛋白(AAD55256.1)序列并结合大肠杆菌易于表达的密码子，优化及合成了黄粉虫抗冻蛋白的核苷酸序列。
所述步骤(1)中黄粉虫抗冻蛋白(AAD55256.1)的氨基酸序列为序列表中的SEQNO.1，优化合成的核苷酸序列为序列表中的SEQ NO.2。
(2)将带有合成的TmAFP基因片段的质粒pUC57::TmAFP采用CaCl2转化法化转入E.coli XL-1b感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆培养后提取质粒。
(3)将从阳性克隆中提取得到的质粒利用双酶切体系，双酶切质粒pUC57::TmAFP和质粒pET-DsbA，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后分别回收黄粉虫抗冻蛋白基因片段及双酶切的质粒。
所述步骤(3)中双酶切体系所用的限制性内切酶分别为BamH I和Hind III，酶切反应条件为37℃孵育30min。
(4)将经琼脂糖凝胶回收的双酶切质粒及黄粉虫抗冻蛋白基因片段通过T4 DNA连接酶连接，并将连接产物通过CaCl2转化法化转入E.coli XL-1b感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆做菌落PCR验证，将验证正确的阳性克隆培养后提取重组表达质粒进行双酶切验证，并将质粒送去Axil Scientific公司测序，测序结果正确且无突变的质粒即为重组质粒pET-DsbA::TmAFP。
所述步骤(4)中菌落PCR验证结果见图1；双酶切验证结果见图2，其中菌落PCR中以菌体为模板扩增的片段大小与阳性对照片段大小一致，说明大肠杆菌细胞中确实存在化转的质粒，将菌落PCR验证正确的大肠杆菌培养提取质粒，对质粒进行BamHI和HindIII双酶切，酶切获得的两个片段大小与预期一致，说明黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因的表达载体构建成功。双酶切体系所用的限制性内切酶分别为BamH I和Hind III，酶切反应条件为37℃孵育30min。
(5)将验证正确的黄粉虫抗冻蛋白表达质粒pET-DsbA::TmAFP采用CaCl2化学转化法化转入E.coli Shuffle T7感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，转化子即为黄粉虫抗冻蛋白工程菌。
以上所述LB培养基组成成分为：
胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸出物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％(W/T)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至60℃左右时加入氨苄霉素至终浓度100μg/mL。
二、抗冻蛋白的表达
(1)从含有黄粉虫抗冻蛋白工程菌株的平板上挑取一个单菌落，接入含有氨苄霉素抗性(100μg/mL)的试管中，37℃、200rpm培养12h。
(2)按照1％(v/v)的接种量将过夜培养的种子液转接到含有氨苄霉素抗性(100μg/mL)的250mL三角瓶中(每瓶分装50mL LB液体培养基)，30℃、200rpm培养至菌液OD600为0.6-0.8之间。
(3)向三角瓶中加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，并在18℃、200rpm诱导培养18h(诱导条件的筛选：
加入IPTG起始OD600的选择：按照1％(v/v)的接种量将过夜培养的种子液分别转接入含有氨苄霉素抗性(100μg/mL)的六支50mL无菌离心管中(每管分装10mL LB液体培养基)，30℃、200rpm培养菌液至不同的OD600加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，18℃、200rpm诱导培养18h，离心收集菌体进行超声破碎，收集上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳测试，测试图结果见图3。结果显示在不同的OD600下加入诱导剂蛋白可溶性表达量相差不大，本发明较优地选择在OD600为0.6时加入诱导剂。
所述不同的OD600分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5。
诱导剂浓度的选择：按照1％(v/v)的接种量将过夜培养的种子液分别转接入含有氨苄霉素抗性(100μg/mL)的九支50mL无菌离心管中(每管分装10mL LB液体培养基)，30℃、200rpm培养菌液OD600为0.6，加入不同终浓度的IPTG诱导剂，18℃、200rpm诱导培养18h，离心收集菌体进行超声破碎，收集上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳测试，测试图结果见图4。结果显示不同终浓度的IPTG诱导剂对蛋白可溶性表达相差不大，本发明较优地选择的IPTG诱导剂终浓度为1mM。
所述终浓度的IPTG分别为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM和10.0mM。
诱导温度的选择：按照1％(v/v)的接种量将过夜培养的种子液分别转接入含有氨苄霉素抗性(100μg/mL)的四支50mL无菌离心管中(每管分装10mL LB液体培养基)，30℃、200rpm培养菌液OD600为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在不同的诱导温度下诱导18h，离心收集菌体进行超声破碎，收集上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳测试，测试图结果见图5。结果显示在诱导温度为18℃时诱导效果较好，本发明较优地选择的诱导温度为18℃。
所述不同的诱导温度分别为18℃、25℃、30℃和37℃。
综合三个因素的研究，诱导条件为在将菌液培养至OD600为0.6时加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在18℃下诱导培养18h。)
(4)诱导结束后，将菌液转入离心杯中，4℃、12000rpm离心10min收集菌体沉淀。
(5)将收集到的菌体在Tris-Cl中重悬，并且用超生破碎仪破碎重悬菌液。
所述超生破碎仪在破碎重悬菌液时的参数为：TIMER，10min；PULSER，5s/10s；AMPL，25％。
(6)将破碎之后的悬液在4℃，12000rpm离心20min收集上清液，获得黄粉虫抗冻蛋白粗酶液。
三、目的蛋白的纯化
利用亲合层析原理，采用Ni柱纯化含有6个组氨酸的融合蛋白。纯化步骤如下：
(1)取出5ml Ni-NTA树脂加入到纯化柱中。
(2)加入5倍树脂体积的去离子水，洗去树脂中的乙醇。
(3)加入4倍树脂体积的Binding Buffer缓冲液。
(4)加入黄粉虫抗冻蛋白粗酶液，使粗蛋白液自然滴落，收集流穿液。
(5)加入3倍树脂体积的Washing Buffer 1缓冲液，收集流穿液。
(6)加入3倍树脂体积的Washing Buffer 2缓冲液，收集流穿液。
(7)加入1倍树脂体积的Elution Buffer缓冲液，收集滴落的洗脱液。
蛋白纯化后将细胞重选破碎液以及收集到的流穿液进行SDS-PAGE检测，检测结果如图6所示。由图中1及2可知此E.coli Shuffle T7诱导表达的蛋白几乎全部以可溶性的形式表达，由图中3及4可知细胞破碎液上清液中的目的蛋白几乎全部结合到纯化柱上，由图中5-7可知清洗缓冲液并没有将纯化柱上结合的目的蛋白洗下，由图中8及9可知目的蛋白中仍然掺杂着少量的其他蛋白，仍可以对清洗缓冲液进行探索，目的蛋白中的其它蛋白除净。
四、蛋白活性的测定
抗冻蛋白活性的测定与其他蛋白质活性的测定存在很大差异，这是因为抗冻蛋白活性的测定方法中基本都有涉及“低温”过程，到目前为止测定抗冻蛋白的方法主要有两大类，其中一类围绕着热滞活性开展实验测定，另外一类则是围绕抗冻蛋白在低温下对细胞、组织等保护作用的测定。本发明中采用的是围绕热滞活性开展的实验，具体步骤如下：
(1)将经过SDS-PAGE检测的纯化蛋白加入 Ultra filter中。
(2)将 Ultra filter放入离心机中，于4℃，5000g离心直至离心管中剩余大约200μl的纯化蛋白时停止离心。
(3)弃掉收集管中的废液并将离心管放回收集管中，加入12ml 100mM NH4HCO3溶液，于4℃，5000g离心直至离心管中剩余大约200μl的纯化蛋白时停止离心。
(4)测定收集到的纯化蛋白浓度并将其梯度稀释，使用3250Single-SampleOsmometer测定其活性。结果见图7。由不同浓度蛋白活性测定结果图可知，目的蛋白随着蛋白浓度的增加其所具有的生物活性也呈现出增高的趋势，而对照蛋白随着蛋白浓度的增加其所具有的生物活性并没有呈现明显的变化，其测定值与所用缓冲液的测定值基本相同，说明了对照蛋白不具有目的蛋白所具有的抗冻活性，也同时说明了增加除目的蛋白之外的其它蛋白并不能改变活性测定值。
实施例2
定向进化技术在黄粉虫抗冻蛋白中的应用：
一、黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变文库的构建
为扩增带有单密码子突变位点的TmAFP基因序列，设计两对引物通过重叠延伸PCR扩增得到带有单密码子突变位点的TmAFP基因序列片段，经BamH I和Hind III双酶切回收后与同样内切酶处理的质粒片段pET-DsbA通过T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物采用化学转化法化转入新鲜的E.coli Shuffle T7感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，随机挑取8个克隆培养提取质粒送至Axil Scientific基因公司测序确认突变文库构建是否成功。
所述突变文库构建成功的判定依据为随机测序的8个质粒突变位置发生在同一位置，即实验前设计处且LB培养皿中转化子数量要超过100个。
本发明共构建了六个不同位置的单密码子突变文库，其序列如下(5’-3’)：
N31：
1F：CCGGAATTCTCCATGGGAGGGTGCACCGGTGG
1R：GCTTTAACGCAGTGCTGAGAMNNCGTGCAGGTAA
2F：TCTCAGCACTGCGTTAAAGC
2R：CCCAAGCTTGGATCCTTAGTGACCCGGAC
Q33：
1F：CCGGAATTCTCCATGGGAGGGTGCACCGGTGG
1R：GTGGTTGCTTTAACGCAGTGMNNAGAGTTCGTG
2F：CACTGCGTTAAAGCAACCAC
2R：CCCAAGCTTGGATCCTTAGTGACCCGGAC
H34：
1F：CCGGAATTCTCCATGGGAGGGTGCACCGGTGG
1R：CAGGTGGTTGCTTTAACGCAMNNCTGAGAGTTCG
2F：TGCGTTAAAGCAACCACCTG
2R：CCCAAGCTTGGATCCTTAGTGACCCGGAC
V36：
1F：CCGGAATTCTCCATGGGAGGGTGCACCGGTGG
1R：CCGGTGCAGGTGGTTGCTTTMNNGCAGTGCTGAG
2F：AAAGCAACCACCTGCACCGG
2R：CCCAAGCTTGGATCCTTAGTGACCCGGAC
K37：
1F：CCGGAATTCTCCATGGGAGGGTGCACCGGTGG
1R：GAACCGGTGCAGGTGGTTGCMNNAACGCAGTGCT
2F：GCAACCACCTGCACCGGTTC
2R：CCCAAGCTTGGATCCTTAGTGACCCGGAC
T39：
1F：CCGGAATTCTCCATGGGAGGGTGCACCGGTGG
1R：CAATCGGTAGAACCGGTGCAGGTMNNTGCTTTAACGCA
2F：ACCTGCACCGGTTCTACCGATTG
2R：CCCAAGCTTGGATCCTTAGTGACCCGGAC。
二、突变蛋白的表达及筛选
将成功构建的突变库中的转化子转接到浅的96孔培养皿中，30℃、85％湿度、200rpm培养16-18h；之后将过夜培养的菌液转接到深的96孔培养皿中，30℃、85％湿度、300rpm培养3h，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，再将培养参数调整为18℃、75％湿度、300rpm继续诱导培养26-28h；培养结束后将培养皿于4℃、4700rpm离心20min，弃掉上清液，向菌体沉淀中加入细胞裂解液，振荡孵育20min，加入Tris-Cl混合均匀，4℃、4700rpm离心20min，吸取上清，使用3250Single-Sample Osmometer筛选活性提高的突变蛋白，活性提高倍数见图8，其中，活性提高倍数的计算方法为：
选取四株活性提高的菌株进行扩大培养，分别对其进行纯化(图9)、浓缩及不同浓度下蛋白活性测定(图10)，测定结果显示获得了一株活性提高的突变蛋白，在相同蛋白浓度下(1.2mg/mL)测得的Osmolality值突变蛋白相比于原蛋白活性提高了8.4％；借助纳升渗透压计测定突变蛋白与原蛋白(4.0mg/mL)的热滞活性，结果显示突变蛋白相比于原蛋白活性提高了50％。
本发明成功地将黄粉虫抗冻蛋白在大肠杆菌中异源可溶性表达，且表达产物具有生物活性，同时运用定向进化技术成功的获得了生物活性提高的突变抗冻蛋白，不仅为解决抗冻蛋白产量不能满足科研及商业上的应用提供了有效的手段，而且还为探索更加优质的抗冻蛋白提供了技术支持。
序列表：
SEQ NO.1黄粉虫抗冻蛋白的氨基酸序列112aa(包含其信号肽部分，前28个氨基酸为其信号肽)：
MGFKTCGFSKKWLVTAVIVMCLCTECYCQCTGGADCTSCTAACTGCGNCPNAVTCTNSQHCVKATTCTGSTDCNTAVTCTNSKDCFEAQTCTDSTNCYKATACTNSTGCPGH
SEQ NO.2优化合成之后的黄粉虫抗冻蛋白基因核苷酸序列及启动子和终止子261bp：
ATGGGACAGTGCACCGGTGGTGCTGATTGCACCTCTTGCACCGCTGCTTGTACCGGTTGCGGTAACTGCCCGAACGCTGTTACCTGCACGAACTCTCAGCACTGCGTTAAAGCAACCACCTGCACCGGTTCTACCGATTGTAACACCGCAGTTACCTGTACCAACTCTAAAGATTGCTTCGAAGCTCAGACCTGTACCGATTCTACCAACTGTTATAAAGCTACCGCTTGCACCAACTCTACCGGTTGTCCGGGTCACTAA
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 黄粉虫抗冻蛋白的氨基酸序列(Unknown)
<400> 1
Met Gly Phe Lys Thr Cys Gly Phe Ser Lys Lys Trp Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Val Ile Val Met Cys Leu Cys Thr Glu Cys Tyr Cys Gln Cys Thr Gly
20 25 30
Gly Ala Asp Cys Thr Ser Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Asn
35 40 45
Cys Pro Asn Ala Val Thr Cys Thr Asn Ser Gln His Cys Val Lys Ala
50 55 60
Thr Thr Cys Thr Gly Ser Thr Asp Cys Asn Thr Ala Val Thr Cys Thr
65 70 75 80
Asn Ser Lys Asp Cys Phe Glu Ala Gln Thr Cys Thr Asp Ser Thr Asn
85 90 95
Cys Tyr Lys Ala Thr Ala Cys Thr Asn Ser Thr Gly Cys Pro Gly His
100 105 110
<210> 2
<211> 261
<212> DNA/RNA
<213> 黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因(Unknown)
<400> 2
atgggacagt gcaccggtgg tgctgattgc acctcttgca ccgctgcttg taccggttgc 60
ggtaactgcc cgaacgctgt tacctgcacg aactctcagc actgcgttaa agcaaccacc 120
tgcaccggtt ctaccgattg taacaccgca gttacctgta ccaactctaa agattgcttc 180
gaagctcaga cctgtaccga ttctaccaac tgttataaag ctaccgcttg caccaactct 240
accggttgtc cgggtcacta a 261
<210> 3
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> N31 1F(Unknown)
<400> 3
ccggaattct ccatgggagg gtgcaccggt gg 32
<210> 4
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> N31 1R(Unknown)
<400> 4
gctttaacgc agtgctgaga mnncgtgcag gtaa 34
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> N31 2F(Unknown)
<400> 5
tctcagcact gcgttaaagc 20
<210> 6
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> N31 2R(Unknown)
<400> 6
cccaagcttg gatccttagt gacccggac 29
<210> 7
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> Q33 1F(Unknown)
<400> 7
ccggaattct ccatgggagg gtgcaccggt gg 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> Q33 1R(Unknown)
<400> 8
gtggttgctt taacgcagtg mnnagagttc gtg 33
<210> 9
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Q33 2F(Unknown)
<400> 9
cactgcgtta aagcaaccac 20
<210> 10
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> Q33 2R(Unknown)
<400> 10
cccaagcttg gatccttagt gacccggac 29
<210> 11
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> H34 1F(Unknown)
<400> 11
ccggaattct ccatgggagg gtgcaccggt gg 32
<210> 12
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> H34 1R(Unknown)
<400> 12
caggtggttg ctttaacgca mnnctgagag ttcg 34
<210> 13
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> H34 2F(Unknown)
<400> 13
tgcgttaaag caaccacctg 20
<210> 14
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> H34 2R(Unknown)
<400> 14
cccaagcttg gatccttagt gacccggac 29
<210> 15
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> V36 1F(Unknown)
<400> 15
ccggaattct ccatgggagg gtgcaccggt gg 32
<210> 16
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> V36 1R(Unknown)
<400> 16
ccggtgcagg tggttgcttt mnngcagtgc tgag 34
<210> 17
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> V36 2F(Unknown)
<400> 17
aaagcaacca cctgcaccgg 20
<210> 18
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> V36 2R(Unknown)
<400> 18
cccaagcttg gatccttagt gacccggac 29
<210> 19
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> K37 1F(Unknown)
<400> 19
ccggaattct ccatgggagg gtgcaccggt gg 32
<210> 20
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> K37 1R(Unknown)
<400> 20
gaaccggtgc aggtggttgc mnnaacgcag tgct 34
<210> 21
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> K37 2F(Unknown)
<400> 21
gcaaccacct gcaccggttc 20
<210> 22
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> K37 2R(Unknown)
<400> 22
cccaagcttg gatccttagt gacccggac 29
<210> 23
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> T39 1F(Unknown)
<400> 23
ccggaattct ccatgggagg gtgcaccggt gg 32
<210> 24
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> T39 1R(Unknown)
<400> 24
caatcggtag aaccggtgca ggtmnntgct ttaacgca 38
<210> 25
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> T39 2F(Unknown)
<400> 25
acctgcaccg gttctaccga ttg 23
<210> 26
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> T39 2R(Unknown)
<400> 26
cccaagcttg gatccttagt gacccggac 29

Claims (10)

1.一种来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因，其特征在于：所述基因为黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因，其核苷酸序列为SEQ NO.2。
2.根据权利要求1所述的来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因，其特征在于：所述黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因的核苷酸序列全长261bp，其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
3.一种利用如权利要求1或2所述的来源于黄粉虫(Tenebrio molitor)的抗冻蛋白AAD55256.1的基因构建的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的工程菌株。
5.一种如权利要求4所述的工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：
以敲除谷氧还蛋白还原酶基因gor和硫氧还蛋白还原酶基因trxB及发生突变的过氧化物氧化还原酶ahpC*的大肠杆菌为出发菌株，构建含有黄粉虫抗冻蛋白基因的重组大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
黄粉虫抗冻蛋白基因载体的制备：将长度为261bp的黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因插入到载体pET-DsbA中，形成表达载体pET-DsbA::TmAFP；
将表达载体pET-DsbA::TmAFP化转入出发菌株宿主菌E.coli Shuffle T7中，即获得黄粉虫抗冻蛋白工程菌株。
7.一种利用如权利要求4所述的工程菌株制备黄粉虫抗冻蛋白的方法，其特征在于：所述黄粉虫抗冻蛋白为使用黄粉虫抗冻蛋白工程菌发酵获得。
8.根据权利要求7所述的制备黄粉虫抗冻蛋白的方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一，将工程菌株由固体LB培养皿中接种到液体LB培养基中，在30℃的条件下培养，得到种子液；
步骤二，将上述种子液转接入液体LB培养基中，30℃培养其OD600为0.6时加入终浓度为0-10mM的IPTG诱导剂；
步骤三，将上述加过诱导剂的菌液转移至18–25℃培养箱中诱导培养18h；
步骤四，将上述菌液转入离心杯中，4℃离心，收集菌体；
步骤五，将上述收集到的菌体置于Tris-Cl缓冲液中悬浮，得到重悬后的菌体；
步骤六，用超声破碎仪破碎重悬后的菌体，即可得到破碎后的菌液；
步骤七，将上述破碎后的菌液在4℃的条件下离心，收集上清液，即得到黄粉虫抗冻蛋白粗酶液。
9.如权利要求1所述的抗冻蛋白AAD55256.1的基因在黄粉虫抗冻蛋白定向进化方面中的应用。
10.利用如权利要求1所述的抗冻蛋白AAD55256.1的基因在黄粉虫抗冻蛋白定向进化上的应用方法，其特征在于：步骤如下：
步骤一，对黄粉虫抗冻蛋白基因序列片段引入突变位点：将长度为261bp的黄粉虫抗冻蛋白TmAFP基因插入到载体pET-DsbA中，形成表达载体pET-DsbA::TmAFP；以表达载体pET-DsbA::TmAFP为模板，通过重叠延伸PCR反应扩增获得带有突变位点的基因TmAFPmut序列片段；
步骤二，构建黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变库：将所述基因TmAFPmut序列片段与载体pET-DsbA连接，将连接体系化转至E.coli Shuffle T7，经转化子验证获得黄粉虫抗冻蛋白单密码子突变库；
步骤三，黄粉虫抗冻突变蛋白的获得：对突变库中的转化子进行诱导培养，离心获得菌体，加入细胞裂解缓冲液振荡，离心收集上清液，上清液即为突变抗冻蛋白粗酶液；
步骤四，筛选：将所述突变抗冻蛋白粗酶液使用微升渗透压计测定其活性，将活性提高倍数高的前20％的突变株挑选出来并进行重复培养，再次测定其活性，与第一次测定结果进行比较；
步骤五，纯化验证：将初筛和复筛活性测定结果一致的突变株进行扩大培养，纯化获得黄粉虫抗冻突变蛋白纯酶液，借助纳升渗透压计测定所述纯酶液的热值活性；
步骤六，测序：将验证正确的突变株培养后提取质粒，测序，获得其突变序列。
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