CN112457413B

CN112457413B - 一种利用sumo融合表达抗菌肽的方法

Info

Publication number: CN112457413B
Application number: CN202011446406.4A
Authority: CN
Inventors: 刘晓东; 刘旭; 董旭峰; 王述柏; 秦志华
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112457413A

Abstract

本发明提供一种利用SUMO融合表达抗菌肽的方法，即将类泛素蛋白修饰分子SUMO与抗菌肽制成融合蛋白，从而更有效的重组表达抗菌肽。所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明采用sumo融合表达方法，在大肠杆菌中表达具有较强抑菌活性的抗菌肽LLv。通过与sumo融合，降低了对宿主菌的毒性，提高了折叠率和表达产量，并成功做到了可溶性表达。

Description

一种利用SUMO融合表达抗菌肽的方法

技术领域

本发明属于生物制品制备应用技术领域，具体涉及一种利用SUMO融合表达抗菌肽的方法。

背景技术

抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物肽(antimicrobial peptides)。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。

近年来耐药菌株及多重耐药菌株的不断增加，临床抗感染药治疗已经陷入耐药危机之中。为了应对耐药菌感染，人类在不断研究和开发新型抗菌药物，而抗菌肽有望成为抗感染、抗肿瘤的良好药物，使人类摆脱耐药菌危机和找到治疗肿瘤的新途径，并将会给临床药物学领域带来革命性的飞跃。

但抗菌肽基因工程表达目前面临两个问题，一是抗菌肽的杀菌对宿主细菌具有毒性，不利于细菌的正常生长；二是抗菌肽因分子量小和阳离子特性容易受到细胞中的蛋白酶的攻击而被降解。

发明内容

本发明利用SUMO融合表达抗菌肽的方法，即将类泛素蛋白修饰分子SUMO(smallubiquitin-like modifier，SUMO)与抗菌肽制成融合蛋白，从而更有效的重组表达抗菌肽，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种融合蛋白，是将类泛素蛋白修饰分子SUMO与抗菌肽偶联制成的融合蛋白；其中所述的抗菌肽包含有：

1)氨基酸序列为LLGDFFKKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVWKTEK(SEQ ID NO:1)；

2)在1)中的序列上取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有1)中功能的多肽；

编码所述的抗菌肽的核酸片段，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

CTGCTGGGTGATTTCTTCAAAAAGAGCAAAGAAAAGATTGGTAAAGAGTTTAAGCGTATCGTCCAACGCATCAAGGACTTCCTGCGCAACCTGGTTTGGAAAACCGAAAAA；

本发明另一个方面还提供用于表达上述融合蛋白的重组表达载体。

本发明再一个方面还提供一种用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的抗菌肽的方法，所述的方法是在宿主菌中表达上述的融合蛋白；回收纯化后制备的所述的宿主菌，作为实施例的一种记载，为大肠杆菌。

所述的方法，其中在宿主菌中表达，选用0.5Mm/L浓度的IPTG进行诱导。

本发明采用sumo融合表达方法，在大肠杆菌中表达具有较强抑菌活性的抗菌肽LLv。通过与sumo融合，降低了对宿主菌的毒性，提高了折叠率和表达产量，并成功做到了可溶性表达。

附图说明

图1：正常大肠杆菌的电镜扫描图；

图2：抗菌肽LLv处理的大肠杆菌电镜扫描图；

图3：抗菌肽LLv的酸碱稳定性图；

图4：抗菌提LLV基因扩增结果图；

图5:不同IPTG浓度和诱导时间对大肠杆菌表达融合蛋白SUMO-R18-LLV的影响图，其中M:蛋白marker；1-3：分别为0.5、1.0、2.0mM/L IPTG诱导；4-7：分别诱导2h、4h、8h和过夜；8：未诱导；

图6：Western-Blot鉴定目的蛋白表达电泳图，其中M:蛋白分子量标准1-3：BL21/LLVIPTG诱导；

图7：SUMO-R18-LLV表达的可溶性分析图；

图8：SUMO-R18-LLV的分离纯化图，其中M:蛋白marker、1：样品、2：样品流出液、3：洗脱液。

具体实施方式

在筛选获得了一种新型的抗菌肽的基础上，为了解决抗菌肽因分子量小和阳离子特性容易受到表达宿主细胞中的蛋白酶的攻击而被降解的问题，本发明将所筛选的抗菌肽与类泛素蛋白修饰分子SUMO偶联制成融合蛋白；在大肠杆菌中重组表达融合蛋白SUMO-LLv，同时优化了融合蛋白SUMO-LLv的表达条件，分析了融合蛋白SUMO-LLv表达的可溶性，并分离纯化了融合蛋白SUMO-LLv。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：抗菌肽的设计和筛选

本发明以抗菌肽LL-37为出发多肽，通过增加疏水残基和带正电荷的氨基酸的方法，设计新的抗菌肽LLv。与LL-37相比，LLv增加了稳定性，延长了α-螺旋结构。改造后的抗菌肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：LLGDFFKKSKEK IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVWKTEK。

通过增加疏水残基和带正电荷的氨基酸，与LL-37相比，新的抗菌肽LLv增加了热稳定性。抗菌肽LLv在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性。沸水浴40min后抑菌活性无明显的变化，121℃高压21min不能破坏抗菌肽LLv的结构和抑菌活性。

实施例2：抗菌肽LLv的理化性质分析抗菌试验

一、采用稀释法抗菌试验来检测抗菌肽LLv的抗菌性能，具体步骤如下：

1)菌液制备，将实验菌(大肠杆菌ATCC25922、禽源大肠杆菌O1、O2、巴氏杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923)接种到MH肉汤，置震荡器培养箱，37℃孵育12-18h，使细菌处于对数生长期。再用无菌生理盐水稀释菌液到所要的细菌数。

2)微量稀释法测定

取无菌96聚苯乙烯微孔板试管，将过滤除菌的层析纯化的抗菌肽溶液依次加入到MH肉汤培养基中，使第1孔至第10孔的终浓度分别276μg/ml,138μg/ml,68μg/ml,34μg/ml,17μg/ml,8.5μg/ml,4.2μg/ml,2.1μg/ml,1.05μg/ml,0.52μg/ml；对照组：青霉素第1孔至第10孔的终浓度分别是：192μg/ml,96μg/ml,48μg/ml,24μg/ml,12μg/ml,6μg/ml,3μg/ml,1.5μg/ml,0.75μg/ml,0.375μg/ml；链霉素的第1孔至第12孔的终浓度分别是：200μg/ml，100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12.5μg/ml,6.25μg/ml,3.1μg/ml,1.5μg/ml,0.75μg/ml,0.375μg/ml。各种抗菌药分别每孔20μg，最后两孔不加药物，一孔为细菌生长对照组，另一只加培养基30μg作空白对照孔，然后每孔加入MH肉汤菌液30μg浓度为1×10⁵左右，细菌最终接种量3×10³个/ml，于37℃培养过夜。

结果表明根据检测孔和对照孔中细菌的生长特性，进行比较判定，以无肉眼可见细菌生长的最低抗菌肽浓度，青霉素或链霉素浓度为测试菌的MIC。为使结果清晰显示，可在每孔加入0.5％氯化三苯四氮唑(TTC)5μl，37℃孵育1-3h，有细菌生长者呈红色，无细菌生长者不变色，更有助于试验结果的判定。

其中MIC判定标准如下：

①与对照孔相比，能显著抑制细菌生长的最高稀释度为终点，该孔的抗菌药物的含量为该抗菌物对某细菌的MIC。+

②在MIC孔及前后各取培养液10ul，转种HM平板，37℃孵育箱培养24h，观察细菌生长情况。在MIC孔应无细菌生长或有个别细菌生长(≤空白对照孔的10％)；在MIC孔左边，即较低稀释倍数孔应该没有细菌生长；在MIC孔右边较高稀释倍数孔，应有细菌生长。

结果表明抗菌肽LLv有明显的广谱抗菌活性，对革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌、球菌均有抗菌活性。LLv对6种临床分离菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration，MIC)在0.5μg/ml-5.8μg/ml之间(表1)。

表1：抗菌肽、青霉素和链霉素对试验细菌的MIC

注LLv：抗菌肽，P青霉素，S：链霉素“/”表示没有抗菌活性

实施例3：抗菌肽LLv处理过的细菌的扫描电镜检查

将2μg/ml浓度的抗菌肽LLv分别与大肠杆菌ATCC25922，37℃培养60min，然后分别收集菌液，离心3000r/min，10min，三次，弃去上清夜，用0.06mol/L的磷酸盐缓冲液(PH7.2)漂洗3次，保留沉淀，加2.5％戊二醛制成细菌悬浮液，4℃固定4h，离心经3000r/min，每次10min，三次。正常细菌对照组样品的制备的详细方法同抗菌肽组。最后用PBS使细菌悬浮散开，制成悬液。然后让细菌自由下沉，干燥，并在真空下溅射喷金。最后通过扫描电镜观察细菌结构，工作电压10KV。

结果大肠杆菌对照组的细菌呈短小棒状，外观饱满，表面光滑，菌体完整，未见细胞膜或细胞壁的损伤(图1)。

将抗菌肽LLv处理过的大肠杆菌，扫描电镜观察细菌结构，可见细菌形态结构发生改变，细菌表面变得粗糙、皱缩、严重变形，或胞壁残缺或火柴头状；或呈哑钤状；还可见细菌的细胞膜有损伤和穿孔，甚至细菌完全裂解(图2)。

实施例4：抗菌肽LLv的其它理化性质

一、抗菌肽LLv的热稳定性

将抗菌肽LLv分别于121℃高压21min，沸水浴5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、1h、2h、3h，再进行抑菌试验，检测其对大肠杆菌抗性的变化。

结果表明抗菌肽LLv沸水浴40min后抑菌活性无明显的变化，1h后抑菌活性变弱(MIC：20μg/ml)，3h后仍具有活性；121℃高压21min后抑菌活性稍微变弱(MIC：30μg/ml)。由此可见，LLv具有很强的耐高温活性，121℃高压21min不能破坏抗菌肽LLv的结构和抑菌活性。

二、抗菌肽LLv在不同pH值缓冲液中的稳定性

配制pH1-12的PBS缓冲液，取50μL抗菌肽上清，分别加入等量的不同pH值缓冲液，以不加抗菌肽的不同pH值缓冲液为对照，以大肠杆菌为受试菌，做抑菌实验，绘制变化曲线。

如图3所示，抗菌肽LLv在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性，pH5.0～6.0时活性最好大。

综上，本发明所提供的抗菌肽具有更好的热稳定性，可应用于高温条件下；例如饲料的高温造粒过程来制备饲料。

实施例2：制备融合蛋白抗菌肽

一、LLv基因序列的设计与合成

合成LLv的基因核酸序列(SEQ ID NO:2)，并在两端加上保护性碱基和SacⅠ、XhoⅠ酶切位点。

二、重组质粒表达载体Psumo-LLv的构建

1、提取pSUMO质粒DNA

1)在含卡那霉素的培养基中接种含pSUMO质粒的BL21(DE3)菌株，于37℃摇床充分振荡培养过夜。

2)取5mL过夜培养的菌液，10000g离心1min收集菌体，把培养基倒干。

3)向菌体沉淀中加入250μL SolutionⅠ，振荡或吸打至菌体彻底悬浮。

4)加入250μL SolutionⅡ，轻轻颠倒离心管3次，充分混匀。

5)加入350μL SolutionⅢ，马上轻轻颠倒离心管3次，混匀。

6)10000g离心10min，将上清液全部小心转移到吸附柱，离心10000g 1min。

7)向吸附柱中加入500μL Wash Buffer(70％的乙醇)，10000g离心1min。倒掉收集管中的溶液，把吸附柱放到同一个收集管中。

8)重复步骤7)一次。

9)把吸附柱和收集管放入离心机，13000g离心2min。

10)在吸附膜中央加入40μL Elution Buffer，室温静置1-2min，13000g离心1min。置于-20℃保存。

2、PCR扩增抗菌肽LLv基因片段

提取质粒pUC57-LLv(由上海生工合成)，以其为模板，应用PCR扩增目的基因。25μLPCR扩增体系。配好反应体系后，用移液枪充分混匀，然后微离心将管壁上的溶液沉于管底，最后进行PCR反应。

PCR反应条件：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)重复步骤(2)-(4)共30次；()72℃延伸5min；(7)4℃保存PCR产物。

PCR结束后，配置1％的琼脂糖凝胶，取10μL PCR产物跑电泳，凝胶成像仪观察记录电泳结果，确认条带无误，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收LLV基因片段。

3、双酶切体系

提取质粒pSUMO，用限制内切酶SacⅠ、XhoⅠ双酶切质粒pSUMO和回收PCR产物LLv基因片段。

4、连接体系

回收双酶切产物后，将目的基因LLV与质粒pSUMO按照下面体系进行连接：

T4 Buffer 1μL、T4 DNA连接酶0.5μL、LLv基因片段6μl、双酶切质粒pSUMO 2.5μL；

配好体系后，用移液枪充分混匀，然后将离心管壁的溶液沉于管底，16℃连接过夜。

通过PCR技术从含LLV基因的pUC57质粒中扩增出目的基因(图4)。使用SmaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶同时酶切PCR产物和pSUMO质粒，然后回收双酶切片段，做连接反应，连接产物转化感受态细胞，将初步鉴定为阳性克隆的单菌落摇菌，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序，最终确定重组表达质粒pSUMO-R18-LLV构建成功。

三、重组表达质粒pSUMO-R18-LLV转化感受态细胞

1)从-80℃冰箱取1管感受态细胞，于冰上融化；将上述l0uL连接体系加入100uL感受态中冰浴45min；

2)42℃水浴90s；

3)快速移至冰水浴中放置5min，加入1ml无抗性LB液体培养基，37℃，200rpm/min摇床复苏培养l h；

4)取部分菌液涂布于LB平板(含50ug/mL氨苄青霉素)；

5)37℃培养半小时后倒置培养皿继续培养12h。

6)pSUMO-R18-LLv质粒测序鉴定:菌液PCR初步筛选获得阳性克隆，然后将单个菌落接种于LB(50μg/m L卡那霉素)液体培养基中，培养至OD600值为0.5左右，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序；确定为正确的阳性重组质粒。

1、不同IPTG浓度对大肠表达融合蛋白SUMO-R18-LLV的影响

(1)将鉴定为阳性的重组质粒pSUMO-R18-LLV转化E.coli BL21感受态细胞，在平板上挑取单个菌落置于5mL LB液体培养基中，在37℃，200rpm/min培养12h后，将含重组质粒pSUMO-R18-LLV的E.coli BL21新鲜单克隆接种于5mL LB(50μg/mL卡那霉素)液体培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜；

(2)按1:100的转接量将过夜培养的菌液接种于50mL新鲜LB(50μg/m L卡那霉素)液体培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养。当OD600达到0.6左右时加IPTG至终浓度为0，0.5，1.0，2.0mM/L，在37℃诱导4小时后各取样1mL，进行SDS-PAGE电泳分析。

2、不同IPTG诱导时间对大肠表达融合蛋白SUMO-R18-LLV的影响

(2)按1:100的转接量将过夜培养的菌液接种于50m L新鲜LB(50μg/m L卡那霉素)液体培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养。在培养至OD600达到0.6左右时，加IPTG

至终浓度0.5mM/L，在30℃条件下诱导，分别于2h、4h、8h、过夜处取样1m L，进行SDS-PAGE电泳分析。

如图5中泳道1、2、3所示，不同IPTG浓度对大肠杆菌没有明显的影响。但是由于IPTG成本较高，选用0.5Mm/L浓度的IPTG。

如图5中泳道4、5、6、7不同诱导时间对大肠杆菌表达融合蛋白SUMO-R18-LLV无明显影响。

3、Western-blot鉴定

(1)对2中的发酵产物首先进行SDS-PAGE电泳；

(2)电泳结束后，将凝胶用专用切割刀合适大小，将凝胶转入到转膜缓冲液中浸泡30min，裁剪两张大小相同的滤纸和一张与凝胶大小相同的PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸泡10-20s，再用灭菌蒸馏水漂洗1min，最后转入转膜缓冲液中作用15min；

(3)按照负极-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-正极的顺序组装，排出气泡。使用半干转膜仪在15v电压下转印20min。

(4)转印结束后，将PVDF膜漂洗5次，每次3min，5％BSA封闭液中过夜；

(5)次日，将PVDF膜桐PBST漂洗5次，每次3min，以鼠抗HIS标签多克隆抗体为一抗(1:1000)室温摇床孵育2h

(6)弃去一抗，将PVDF膜漂洗5次，每次3min，加入HRP标记鼠抗IgG为二抗(1:1000)室温孵育2h；

(7)将PVDF膜桐PBST漂洗5次，每次3min；

(8)用DAB染色液染色。

经Western-blot鉴定，将转印好的PVDF膜经一抗二抗孵育，染色后在约ku处明显可见特异性反应条带。这表明表达出了LLV蛋白(图6)，同时证明了表达产物具有良好的反应原性。

4、融合蛋白SUMO-R18-LLV表达的可溶性分析

(1)将含重组质粒pSUMO-R18-LLV的E.coli BL21新鲜单克隆接种于5mL LB(50μg/mL卡那霉素)液体培养基中，37℃，200rpm/min过夜培养；

(2)按1:100的接种量将过夜培养的菌液接种于50mL新鲜LB(50μg/mL卡那霉素)液体培养基中，37℃，200rpm/min条件下培养。在培养至OD600达到0.6左右时，加IPTG至终浓度为0.5mM/L，在30℃条件下诱导3小时。

(3)将样品10000g离心10min，将菌体重悬8mLPBS中，超声破碎后，10000g离心10min，上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析。

在诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，诱导温度为37℃，诱导3小时后收集菌液，离心收集菌体，加入PBS缓冲液重悬菌体，冰浴超声破菌，离心后分别取上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达的可溶性和不可溶性。SDS-PAGE电泳结果如图7所示，检测结果显示在上清和包涵体中均有蛋白表达。

5、融合蛋白SUMO-R18-LLV的分离纯化

(1)将Ni柱树脂充分摇匀，加入直径为1.5cm的层析柱中，至终体积约为2mL；/*-

(2)用5倍柱体积的去离子水清洗；

(3)用8倍柱体积的Binding Buffer(20mMTris，500mMNaCl，10mM咪唑，pH8.0)平衡；

(4)加入需纯化的样品，控制其流速为0.5mL/min，收集样品流出液，SDS-PAGE分析；

(5)用10倍柱体积的Wash Buffer(20mMTris，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)清洗，至紫外吸收值稳定，收集清洗液，SDS-PAGE分析；

(6)用5倍柱体积的Elution Buffer(20mM Tris，500m M Na Cl，250mM咪唑，pH8.0)洗脱，收集洗脱液,SDS-PAGE分析后，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，其余样品用PBS于4℃过夜透析，透析液冷冻干燥后存于-80℃超低温冰箱。

(7)透析后的融合蛋白加入SUMO蛋白酶I和终浓度2mmol/L的DTT,4℃切割过夜；去除SUMO的产物再经过His标签蛋白纯化预装柱纯化，收集洗脱峰，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析。

在诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，诱导温度为37℃，诱导3小时后收集菌液，离心收集菌体。在大肠杆菌中融合蛋白SUMO-R18-LLV主要以可溶性表达的形式存在，因此通过非变性条件制备样品。经Ni柱亲和层析纯化后，分别取样品、样品流出液、清洗液以及洗脱液用SDS-PAGE电泳分析(图8)，电泳结果显示获得了LLV蛋白。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种利用SUMO融合表达抗菌肽的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Lys Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

20 25 30

Trp Lys Thr Glu Lys

35

<210> 2

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgctgggtg atttcttcaa aaagagcaaa gaaaagattg gtaaagagtt taagcgtatc 60

gtccaacgca tcaaggactt cctgcgcaac ctggtttgga aaaccgaaaa a 111

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是将类泛素蛋白修饰分子SUMO与抗菌肽偶联制成的融合蛋白；其中所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于重组表达权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的抗菌肽的方法，其特征在于，所述的方法是在宿主菌中重组表达权利要求1所述的融合蛋白；回收纯化后来制备抗菌肽。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法，是使用0.5mM浓度的IPTG进行诱导。