CN112480230B - 一种具有更好抗热功能的抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗菌肽，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所提供的抗菌肽用于制备抗菌制品。本发明以LL‑37为模板，通过增加疏水残基和带正电荷的氨基酸+789改造获得了新型的抗菌肽LLv。与LL‑37相比，本发明的抗菌肽LLv增加了稳定性，延长了α‑螺旋结构。抗菌肽LLv在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性。沸水浴40min后抑菌活性无明显的变化，121℃高压21min不能破坏抗菌肽LLv的结构和抑菌活性。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种具有更好抗热功能的抗菌肽及其应用。
背景技术
抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物肽(antimicrobial peptides)。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。
近年来耐药菌株及多重耐药菌株的不断增加，临床抗感染药治疗已经陷入耐药危机之中。为了应对耐药菌感染，人类在不断研究和开发新型抗菌药物，而抗菌肽有望成为抗感染、抗肿瘤的良好药物，使人类摆脱耐药菌危机和找到治疗肿瘤的新途径，并将会给临床药物学领域带来革命性的飞跃。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌肽，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的抗菌肽，其包含有：
1)氨基酸序列为LLGDFFKKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVWKTEK(SEQ ID NO:1)；
2)在1)中的序列上取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有1)中功能的多肽；
其本发明所提供的抗菌肽用于制备抗菌制品；
本发明的抗菌肽还用于制备饲料添加剂或抗菌剂。
本发明以LL-37为模板，通过增加疏水残基和带正电荷的氨基酸改造获得了新型的抗菌肽LLv。与LL-37相比，本发明的抗菌肽LLv增加了稳定性，延长了α-螺旋结构。抗菌肽LLv在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性。沸水浴40min后抑菌活性无明显的变化，121℃高压21min不能破坏抗菌肽LLv的结构和抑菌活性。
附图说明
图1：正常大肠杆菌的电镜扫描图；
图2：抗菌肽LLv处理的大肠杆菌电镜扫描图；
图3：抗菌肽LLv的酸碱稳定性图。
具体实施方式
本发明实施例中使用了琼脂粉、LB平板、PMSF、MH(Mueller-Hnton)平板、MH(Mueller-Hnton)肉汤、酵母浸出膏、Tryptone、青霉素、链霉素、头孢唑啉、复合磺胺、呋喃妥因、妥布霉素、头孢唑啉、头孢他啶、利福平、环丙沙星、氧氟沙星、痢特灵、阿齐霉素、红霉素、四环素；上述的材料都可以使用常用的分子生物学试剂来进行替换。
其中MH(Mueller-Hnton)肉汤培养基的一种组成如下：
补充蒸馏水至1000ml，120℃高压灭菌15min。
MH(Mueller-Hnton)平板的一种组成如下：
MH肉汤 1000ml
琼脂粉 12g
溶解后，120℃高压灭菌 15min
冷却至80℃左右倒平板，培养基厚度约为1mm。
LB(Luria Bertein)平板的一种组成如下：
冷却至80℃左右倒平板，培养基厚约为1mm。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：抗菌肽的设计和筛选
本发明以抗菌肽LL-37为出发多肽，通过增加疏水残基和带正电荷的氨基酸的方法，设计新的抗菌肽LLv。与LL-37相比，LLv增加了稳定性，延长了α-螺旋结构。改造后的抗菌肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：LLGDFFKKSKEK IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVWKTEK。
通过增加疏水残基和带正电荷的氨基酸，与LL-37相比，新的抗菌肽LLv增加了热稳定性。抗菌肽LLv在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性。沸水浴40min后抑菌活性无明显的变化，121℃高压21min不能破坏抗菌肽LLv的结构和抑菌活性。
实施例2：抗菌肽LLv的理化性质分析抗菌试验
一、采用稀释法抗菌试验来检测抗菌肽LLv的抗菌性能，具体步骤如下：
1)菌液制备，将实验菌(大肠杆菌ATCC25922、禽源大肠杆菌O1、O2、巴氏杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923)接种到MH肉汤，置震荡器培养箱，37℃孵育12-18h，使细菌处于对数生长期。再用无菌生理盐水稀释菌液到所要的细菌数。
2)微量稀释法测定
取无菌96聚苯乙烯微孔板试管，将过滤除菌的层析纯化的抗菌肽溶液依次加入到MH肉汤培养基中，使第1孔至第10孔的终浓度分别276μg/ml,138μg/ml,68μg/ml,34μg/ml,17μg/ml,8.5μg/ml,4.2μg/ml,2.1μg/ml,1.05μg/ml,0.52μg/ml；对照组：青霉素第1孔至第10孔的终浓度分别是：192μg/ml,96μg/ml,48μg/ml,24μg/ml,12μg/ml,6μg/ml,3μg/ml,1.5μg/ml,0.75μg/ml,0.375μg/ml；链霉素的第1孔至第12孔的终浓度分别是：200μg/ml，100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12.5μg/ml,6.25μg/ml,3.1μg/ml,1.5μg/ml,0.75μg/ml,0.375μg/ml。各种抗菌药分别每孔20μg，最后两孔不加药物，一孔为细菌生长对照组，另一只加培养基30μg作空白对照孔，然后每孔加入MH肉汤菌液30μg浓度为1×105左右，细菌最终接种量3×103个/ml，于37℃培养过夜。
结果表明根据检测孔和对照孔中细菌的生长特性，进行比较判定，以无肉眼可见细菌生长的最低抗菌肽浓度，青霉素或链霉素浓度为测试菌的MIC。为使结果清晰显示，可在每孔加入0.5％氯化三苯四氮唑(TTC)5μl，37℃孵育1-3h，有细菌生长者呈红色，无细菌生长者不变色，更有助于试验结果的判定。
其中MIC判定标准如下：
①与对照孔相比，能显著抑制细菌生长的最高稀释度为终点，该孔的抗菌药物的含量为该抗菌物对某细菌的MIC。+
②在MIC孔及前后各取培养液10ul，转种HM平板，37℃孵育箱培养24h，观察细菌生长情况。在MIC孔应无细菌生长或有个别细菌生长(≤空白对照孔的10％)；在MIC孔左边，即较低稀释倍数孔应该没有细菌生长；在MIC孔右边较高稀释倍数孔，应有细菌生长。
结果表明抗菌肽LLv有明显的广谱抗菌活性，对革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌、球菌均有抗菌活性。LLv对6种临床分离菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration，MIC)在0.5μg/ml-5.8μg/ml之间(表1)。
表1：抗菌肽、青霉素和链霉素对试验细菌的MIC
注LLv：抗菌肽，P青霉素，S：链霉素“/”表示没有抗菌活性
实施例3：抗菌肽LLv处理过的细菌的扫描电镜检查
将2μg/ml浓度的抗菌肽LLv分别与大肠杆菌ATCC25922，37℃培养60min，然后分别收集菌液，离心3000r/min，10min，三次，弃去上清夜，用0.06mol/L的磷酸盐缓冲液(PH7.2)漂洗3次，保留沉淀，加2.5％戊二醛制成细菌悬浮液，4℃固定4h，离心经3000r/min，每次10min，三次。正常细菌对照组样品的制备的详细方法同抗菌肽组。最后用PBS使细菌悬浮散开，制成悬液。然后让细菌自由下沉，干燥，并在真空下溅射喷金。最后通过扫描电镜观察细菌结构，工作电压10KV。
结果大肠杆菌对照组的细菌呈短小棒状，外观饱满，表面光滑，菌体完整，未见细胞膜或细胞壁的损伤(图1)。
将抗菌肽LLv处理过的大肠杆菌，扫描电镜观察细菌结构，可见细菌形态结构发生改变，细菌表面变得粗糙、皱缩、严重变形，或胞壁残缺或火柴头状；或呈哑钤状；还可见细菌的细胞膜有损伤和穿孔，甚至细菌完全裂解(图2)。
实施例4：抗菌肽LLv的其它理化性质
一、抗菌肽LLv的热稳定性
将抗菌肽LLv分别于121℃高压21min，沸水浴5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、1h、2h、3h，再进行抑菌试验，检测其对大肠杆菌抗性的变化。
结果表明抗菌肽LLv沸水浴40min后抑菌活性无明显的变化，1h后抑菌活性变弱(MIC：20μg/ml)，3h后仍具有活性；121℃高压21min后抑菌活性稍微变弱(MIC：30μg/ml)。由此可见，LLv具有很强的耐高温活性，121℃高压21min不能破坏抗菌肽LLv的结构和抑菌活性。
二、抗菌肽LLv在不同pH值缓冲液中的稳定性
配制pH1-12的PBS缓冲液，取50μL抗菌肽上清，分别加入等量的不同pH值缓冲液，以不加抗菌肽的不同pH值缓冲液为对照，以大肠杆菌为受试菌，做抑菌实验，绘制变化曲线。
如图3所示，抗菌肽LLv在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性，pH5.0～6.0时活性最好大。
综上，本发明所提供的抗菌肽具有更好的热稳定性，可应用于高温条件下；例如饲料的高温造粒过程来制备饲料。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种具有更好抗热功能的抗菌肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Lys Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Trp Lys Thr Glu Lys
35
Claims (6)
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段编码权利要求1所述的抗菌肽。
3.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体中插入了权利要求2所述的核酸片段。
4.权利要求1所述的抗菌肽在制备抗菌制品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗菌制品为饲料添加剂或抗菌剂。
6.一种饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加中包含有权利要求1所述的抗菌肽。
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