CN113185598B - 一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽及其制备方法和应用。抗菌肽F1‑2，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明以人髓化分样蛋白MD‑2的119‑132片段为基础片段，利用精氨酸定点突变技术，构建出靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1‑2。本发明的抗菌肽F1‑2，对革兰氏阴性菌的抗菌能力极强，并且可以在较低的浓度完全清除革兰氏阴性菌。在混合微生物群落中，抗菌肽F1‑2对革兰氏阴性菌具有极强的选择性，可以特异性地杀灭革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌影响较小，并且，本发明的F1‑2生物相容性良好。本发明还公开了抗菌肽F1‑2在制备治疗革兰氏阴性菌引发的感染性疾病药物中的应用。

Description

一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体设计一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
随着抗生素的大量使用，全世界研究人员日益关注细菌耐药性的问题。抗菌肽具有广谱的抗菌能力，使细菌对其不易产生南药性，但这种特性也使得抗菌肽针对无论是病原菌还是益生菌均具有抗菌能力。现有的研究表明，人体中的微生物群落演替与宿主的生命活动息息相关。不仅如此，由于没有具有特异杀菌能力的生物探针，很难分析出特定的微生物在群落中发挥的功能。因此，设计出具有靶向抗菌能力的抗菌肽对寻找抗生素替代物和研究微生物群落的特异性生物探针具有十分重要的意义。现有的人髓化分样蛋白MD-2的119-132片段对革兰氏阴性菌的抗菌能力较弱。
发明内容
基于以上不足之处，本发明提供一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽，该抗菌肽是一种能够专门杀灭革兰氏阴性菌的靶向抗菌肽。
本发明所采用的技术如下：一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1-2，其序列如SEQID No.1所示。
进一步的，本发明还公开一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1-2的制备方法，步骤如下：
(1)选取人的髓化分样蛋白MD-2的119-132片段，采用定点氨基酸突变方法，利用精氨酸替代第二位置的丝氨酸、第七位置的赖氨酸；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽F1-2；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽F1-2的制备。
进一步的，本发明还公开一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1-2在制备治疗革兰氏阴性菌引发的感染性疾病药物中的应用。
进一步的，如上所述的应用，其中革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
本发明的有益效果及优点：本发明的F1-2，对革兰氏阴性菌的抗菌能力极强，并且可以在较低的浓度完全清除革兰氏阴性菌。在混合微生物群落中，F1-2对革兰氏阴性菌具有极强的选择性，可以特异性地杀灭革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌影响较小。并且，本发明的F1-2生物相容性良好。综上所述，本发明的F1-2具有成为特异性抗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物，并且有能力成为特异性靶向革兰氏阴性菌多肽分子探针的能力。
附图说明
图1是F1-2和人源MD-2的119-132片段在单细菌体系中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生存率的影响对比图；
图2是F1-2和人源MD-2的119-132片段在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌混合培养体系中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生存率的影响对比图；
图3是抗菌肽F1-2细胞毒性图；
图4是抗菌肽F1-2溶血活性图；
具体实施方式
下面举例对本发明做进一步的说明：
实施例1
将人源MD-2的119-132片段，采用定点氨基酸突变技术，利用精氨酸替代第二位置的丝氨酸、第七位置的赖氨酸。F1-2的序列及理化参数如表1所示。
表1F1-2的序列及理化参数
Figure BDA0003012973070000021
实施例2
1.最小抑菌浓度检测
将肽配置成为2.56mM储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2、3所示。
表2F1-2对革兰氏阴性菌的抗菌活性
Figure BDA0003012973070000031
表3F1-2对革兰氏阳性菌的抗菌活性
Figure BDA0003012973070000032
实施例2的结果表明，MD-2的119-132片段对于大肠杆菌的最小抑菌浓度为8-16μM，然而本发明的F1-2多肽，相比较于MD-2的119-132片段，抗革兰氏阴性菌的能力提升4-8倍，最小抑菌浓度为2-4μM。除此之外，F1-2和MD-2的119-132片段对革兰氏阳性菌均没有抗菌能力。
实施例3
1.单细菌培养体系中F1-2的抗菌活性
将肽配置成为2.56mM储存液备用。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测大肠杆菌菌液或金黄色葡萄球菌菌液(～105个/mL)于各孔中。设置阳性对照，含有菌液而不含有抗菌肽。37℃恒温培养1h，吸取50μL悬浊液，用生理盐水适当稀释后涂布于MHA琼脂板上，培养24小时后计数。结果如图1所示。
结果表明，本发明的F1-2多肽在1μM处理时，便可以完全清除单细菌体系中的大肠杆菌，而MD-2的119-132片段在32μM时，才可完全清除。因此，相比较于MD-2的119-132片段，本发明的F1-2多肽极大幅度提升了抗大肠杆菌的能力。对于革兰氏阳性菌，F1-2和MD-2的119-132片段的抗菌能力均较弱。
2.混合细菌培养体系中F1-2的抗菌活性
将肽配置成为2.56mM储存液备用。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后添加等体积大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合菌液(～105个/mL)于各孔中。设置阳性对照，含有菌液而不含有抗菌肽。37℃恒温培养1h，吸取50μL悬浊液，用生理盐水适当稀释后涂布于MHA琼脂板上，培养24小时后计数。结果如图2所示。
结果表明，在混合培养体系中，本发明的F1-2显示出优于MD-2119-132片段的选择性，在1μM可以完全清除混合微生物群落中的大肠杆菌，并且对金黄色葡萄球菌几乎无影响。MD-2的119-132片段在1μM时，表现出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有选择性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数抑制能力相同。
实施例4
抗菌肽F1-2的细胞毒性可以通过噻唑蓝(MTT)比色法进行检测，主要方法如下：在96孔板中每孔加入1.0-2.0×104个小鼠RAW264.7细胞，然后用抗菌肽进行处理，抗菌肽的浓度从1-128μM变化。在37℃下，培养18-24h，然后再与MTT(50μl,0.5mg/ml)培育4小时，然后再1,000×g条件下离心5分钟。上清弃去。随后，用150μl的二甲基亚砜去溶解孔底的甲瓒，细胞毒性可以通过酶标仪在570nm的吸光值进行检测。结果如图3所示
抗菌肽F1-2溶血活性的检查方法如下：将1mL新鲜血液与9mL生理盐水混合，在1,000×g条件下离心5分钟，弃去上清。与不同浓度(1-64μM)孵育1小时，1,000×g条件下离心5分钟，取上清液至，通过酶标仪在570nm的吸光值进行检测。结果如图4所示
结果表明，本发明的F1-2多肽在64μM处理小鼠细胞后，小鼠细胞仍具有很高的活力，并且对红细胞也没有破坏作用，表明其较好的生物相容性。
综上实施例1、2、3和4的结果所述，相比较于MD-2的119-132片段，F1-2表现出高于8倍的抗革兰氏阴性菌的抗菌能力，并且对革兰氏阳性菌的抗菌能力较弱。在混合体系中，F1-2比MD-2的119-132片段表现出了对革兰氏阴性菌的更强选择性；并且，F1-2的细胞毒性与溶血活性极低，表明了其较好的生物相容性，表明其作为特异性抗革兰氏阴性菌感染抗菌药物的能力。综上所述，该发明的F1-2具备很大的应用潜力。
<110> 东北农业大学
<120> 一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽及其制备方法和应用
<140> 2021103810265
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Arg Phe Lys Gly Ile Arg Phe Ser Lys Gly Lys Tyr Lys-NH2
1 5 10

Claims (4)

1.一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1-2，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1-2的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)选取人的髓化分样蛋白MD-2的119-132片段，采用定点氨基酸突变方法，利用精氨酸替代第二位置的丝氨酸、第七位置的赖氨酸；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽F1-2；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽F1-2的制备。
3.根据权利要求1所述的一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽F1-2在制备治疗革兰氏阴性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
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