CN112661832B

CN112661832B - 一种高稳定性抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN112661832B
Application number: CN202110099427.1A
Authority: CN
Inventors: 马曦; 谭鹏; 张钰成; 唐琪
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-01-25
Also published as: CN112661832A

Abstract

本发明涉及基因工程及生物制剂技术领域，具体公开了一种高稳定性抗菌肽及其应用。本发明的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的抗菌肽，合成方法简单，序列中氨基酸全部为天然氨基酸，成本低廉，并且肽序列在模拟体内盐离子环境中以及模拟胰蛋白酶糜蛋白酶环境中具有高稳定性。在中性pH下该抗菌肽展现出广谱抗菌活性，对大肠杆菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌株展现出抑制作用。且在酸性pH条件下，其活性进一步增强。同时，该抗菌肽具有较低的溶血活性，具备良好的生物相容性。

Description

一种高稳定性抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及生物制剂技术领域，具体地说，涉及一种高稳定性抗菌肽及其应用。

背景技术

自青霉素被发现后，抗生素挽救了无数人的生命，使人类平均寿命延长了24年。抗生素在畜牧业中能够提高动物生产性能，具有促生长作用。然而，抗生素的频繁滥用，会影响动物机体的免疫力，并且会诱导抗生素敏感菌株开始产生耐药性。动物体内的抗生素残留会借助各种介质传递给人类，导致人体内产生耐药菌，严重危害人类健康。因此，抗生素替代物的开发成为研究热点。

抗菌肽作为解决耐药细菌感染的药物已经被研究多年。然而，抗菌肽在临床应用上存在着稳定性不足的障碍。目前已经有研究提出了多种方式提高抗菌肽的稳定性，例如：非天然氨基酸替换，利用半胱氨酸之间的二硫键形成环肽等。然而，这些修饰的肽只能通过化学合成的方式获得，大大提高了肽的生产成本，昂贵的价格阻碍了肽的进一步应用。

在过去的研究中，研究人员往往只考虑了一种介质下的稳定性，而抗菌肽进入体内时应用环境复杂，通常会遭受蛋白酶和各种盐的综合作用，使抗菌肽失活。因此，在本发明中，综合考虑了抗菌肽的盐稳定性和蛋白酶稳定性，旨在设计一种能够耐受复杂环境的高稳定性抗菌肽。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，发明的目的是提供一种在酶、酸性条件和盐离子存在下对细菌仍有较好杀灭作用的肽。

为了实现本发明的发明目的，本发明的技术方案如下：

一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明首先分析了动物体内常见蛋白酶的酶切位点。胰蛋白酶优先切割阳离子氨基酸，包括精氨酸和赖氨酸。糜蛋白酶优先切割疏水性氨基酸，而阳离子氨基酸和疏水性氨基酸都是抗菌肽发挥活性必不可少的。另外，动物体内存在的盐离子也会影响抗菌肽的抗菌活性，带有正电荷的盐离子会竞争性的与菌膜表面的带有负电荷成分相结合，从而拮抗抗菌肽的作用。因此，本发明力图通过合理规划氨基酸排列顺序的方式，来实现规避酶切位点的作用，提高肽的蛋白酶稳定性，并利用支链氨基酸亮氨酸来提高肽的盐离子稳定性。

具体地，本发明的疏水性氨基酸选择亮氨酸，其位于本发明抗菌肽序列中，能与细菌菌膜相互作用，使菌膜破裂，并通过其大体积侧链，与膜界面的亲和力更强，使得肽能更深地渗透到膜中，对菌膜产生更大的破坏性。其后放置脯氨酸，在本发明中实现了防止肽被糜蛋白酶水解的效果，其前放置组氨酸保证了序列的基础阳离子性，对此组合重复7次，既保证了肽链具备充足的疏水性，又不影响该肽整体效果的发挥。然后使用精氨酸对序列进行系统两端修饰，两端各放置两个精氨酸，并在其后放置脯氨酸，既提高了肽在中性pH环境下的抗菌性，又使得该肽整体具有更强的菌膜穿透能力，并实现了防止精氨酸被胰蛋白酶酶解的效果。最后，在肽链C末端酰胺化，进一步提高肽的稳定性。经肽的抗菌活性测试，发现该肽具备广谱抗菌活性，并且在酸性条件下抗菌活性会进一步增强。并且肽具备非常强的抗酶解能力，在2mg/mL蛋白酶处理后仍然保持原有的抗菌活性。另外，肽溶血活性很低，表明其具备临床应用潜力。

本发明的肽的氨基酸序列具体为：Arg Pro Arg Pro His Leu Pro His Leu ProHis Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro Arg Pro Arg Pro。分子量为3462.11。

本发明还提供：

上述抗菌肽或生物材料在制备抗细菌制剂中的应用。

其中，所述的制剂为药物或保健品。

所述的制剂可应用于存在生理盐、蛋白酶或酸性的条件下。

上述抗菌肽在制备消毒剂、清洁剂或防腐剂中的应用。

所述的消毒剂、清洁剂或防腐剂可应用于存在生理盐、蛋白酶或酸性的条件下。

一种产品，所述产品为药物、保健品、消毒剂、清洁剂或防腐剂，其包含上述抗菌肽。

所述产品可应用于存在生理盐、蛋白酶或酸性的条件下。

本发明的肽可应用于盐离子或酶存在的复杂生理环境中，并对细菌感染性疾病起到治疗效果。

本发明的有益效果至少在于：

本发明的抗菌肽，合成方法简单，序列中氨基酸全部为天然氨基酸，成本低廉，并且肽序列在模拟体内盐离子环境中以及模拟胰蛋白酶糜蛋白酶环境中具有高稳定性。对得到的序列进行抗菌活性测试，发现在中性pH下该抗菌肽展现出广谱抗菌活性，对大肠杆菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌株展现出抑制作用。且该肽(RP29)随着pH值的下降，净电荷量逐渐提升，因此，在酸性pH条件下，肽RP29的活性进一步增强。同时，肽RP29具有较低的溶血活性，表明肽RP29具备良好的生物相容性，具备较强的临床应用潜力。

附图说明

图1为本发明高稳定性抗菌肽结构示意图。

图2为本发明高稳定性抗菌肽螺旋轮示意图。

图3为本发明高稳定性抗菌肽高效液相色谱图。图中最高峰出峰时间为11.393分钟。

图4为本发明高稳定性抗菌肽质谱图。

图5为本发明高稳定性抗菌肽的溶血活性结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1固相化学合成法合成本发明抗菌肽

本实施例采用固相化学合成法合成本发明的抗菌肽(参见SEQ ID NO.1所示)，肽结构示意图如图1所示，螺旋轮示意图如图2所示。

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图4抗菌肽质谱图所示)与理论分子量3462.11基本一致，抗菌肽的纯度大于95％(参见图3抗菌肽高效液相色谱图，色谱柱为Kromasil C18-5(4.6×250mm，220nm，10μL)，使用非线性梯度的水/乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流速为1.0mL/min)。

实施例2肽的抗菌活性的测定

利用微量稀释法测定实施例1制备得到的肽(RP29)对细菌的最小抑菌浓度。用含有0.01％乙酸的0.2％胎牛血清白蛋白作为稀释液加入96孔板中，使用倍比稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液，使每个孔中的溶液体积为50μL。然后分别添加50μL的待测菌液(～10⁵CFU/mL)于各孔中，培养基为MHB(pH＝7.4或6.5)。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。于37℃恒温培养18h，然后用酶标仪在492nm处测定光吸收值，以数值大于0.1为菌株生长的判定标准，确定肽对细菌的最小抑菌浓度。试验设定两个平行，重复三次。结果见表1和表2。在表1和表2中，E.coli 25922，S.aureus 1882，S.aureus 6538，S.epidermidis 49134，S.typhimurium SL1344,C.amalonaticus 51459购自北京百欧博伟生物技术有限公司，E.coli K88，E.coli K99来源于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

表1抗菌肽RP29在pH 7.4条件下对细菌的抑菌活性(μM)

表2抗菌肽RP29在pH 6.5条件下对细菌的抑菌活性(μM)

由表1和表2可以看出，由于正电荷氨基酸精氨酸的存在，肽RP29在中性pH环境下表现出广谱抗菌活性，本实施例进一步评估了肽RP29在pH 6.5条件下的抑菌活性。RP29中所含的组氨酸随着pH的降低其电荷量逐渐提高，增强了肽与菌膜之间的静电作用，故肽的活性进一步提高。

实施例3肽的溶血活性的测定

取1mL新鲜猪血红细胞，用PBS稀释10倍备用。用PBS作为稀释液加入96孔板中，使用倍比稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽(实施例1制备得到的肽RP29)溶液，使每个孔中的溶液体积为50μL。将50μL红细胞悬浮液加入含有肽的孔中，用0.1％曲拉通处理的红细胞悬浮液作为阳性对照，未处理的红细胞悬浮液作为阴性对照。随后将96孔板放入37℃培养箱中孵育1h。以1000g离心力离心5min，从96孔板每个孔中吸取50μL上清液，将其转移至新的96孔板中，然后用酶标仪在570nm处测定光吸收值，试验设定两个平行，重复三次。结果见图5。用以下公式计算溶血率：

溶血率(％)＝[(样品OD570-阴性对照OD570)/(阳性对照OD570-阴性对照OD570)]×100％

由图5所示，使用128μM浓度肽RP29处理猪红细胞后，并未出现明显的溶血现象，表明肽RP29毒性较小，具备一定的临床应用潜力。

实施例4肽的蛋白酶稳定性测定

将2mg/mL的不同蛋白酶与浓度为2560μM的实施例1制备得到的肽RP29在37℃条件下混合孵育1h，然后采用如上所述的微量稀释法测定肽对大肠杆菌25922的最低抑菌浓度。试验设定两个平行，重复三次。结果见表3。

表3抗菌肽RP29的蛋白酶稳定性(μM)

由表3可以看出，肽RP29在经过2mg/mL的胰蛋白酶和糜蛋白酶处理后，肽RP29保留了原本的抗菌活性，表明肽RP29具有高蛋白酶稳定性。

实施例5肽RP29的盐离子稳定性测定

分别在150mM NaCl,4.5mM KCl,6μM NH₄Cl,8μM ZnCl₂,1mM MgCl₂和4μM FeCl₃存在下测定实施例1制备得到的肽RP29的抗菌活性，具体操作方法同实施例4。试验设定两个平行，重复三次。结果见表4。

表4肽RP29的盐离子稳定性(μM)

由表4可以看出，在生理盐浓度下，肽活性并未完全丧失，保留了一定的抗菌活性，表明肽在生理条件下具有一定的稳定性。

综合以上结果显示，肽RP29在中性和酸性条件下都具备抗菌活性，并且具备高蛋白酶耐受力和高盐离子稳定性，溶血活性低，具有广泛的应用潜力。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种高稳定性抗菌肽及其应用

<130> KHP201118827.0

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Pro Arg Pro His Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro

1 5 10 15

His Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro Arg Pro Arg Pro

20 25

Claims

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述抗菌肽在制备抗细菌制剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制剂为药物或保健品。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的制剂应用于存在生理盐、蛋白酶或酸性的条件下。

5.权利要求1所述抗菌肽在制备消毒剂、清洁剂或防腐剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的消毒剂、清洁剂或防腐剂应用于存在生理盐、蛋白酶或酸性的条件下。

7.一种产品，所述产品为药物、保健品、消毒剂、清洁剂或防腐剂，其特征在于，包含权利要求1所述抗菌肽。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品应用于存在生理盐、蛋白酶或酸性的条件下。