CN111454334A

CN111454334A - 一种抗酶解的抗菌肽ii4ii及制备方法和应用

Info

Publication number: CN111454334A
Application number: CN202010234824.0A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 朱永杰; 邵长轩
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111454334B

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种抗酶解的抗菌肽II4II及其制备方法和应用。抗菌肽II4II的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。制备方法：以胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的特异性酶切位点和抗菌肽的基本特征为基础，对序列中的氨基酸进行合理排列，选择Ile作为疏水性氨基酸，得出抗菌肽II4II。该抗菌肽II4II在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的胃肠道感染疾病药物中的应用。本发明的抗菌肽II4II对多种细菌具有较强的抑制作用，而且溶血活性较低，治疗指数达到80.63，而且具有较强的抗酶解能力，在胰蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶处理后抑菌活性保持不变，具有成为抗生素替代品的应用潜力。

Description

一种抗酶解的抗菌肽II4II及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解的抗菌肽II4II及制备方法和应用。

背景技术

在过去的90多年里，抗生素在医学、食品、畜牧等行业有着广泛的应用。但是，抗生素的滥用加速了耐药性的发展，给全球公共卫生带来极大威胁。因此，寻找抗生素的替代品已成为当务之急。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)广泛存在于自然界生物体内，具有抗细菌、抗真菌、抗炎等多种生物活性，是宿主免疫系统的重要组成部分。AMPs独特的非特异性膜破坏机制很难使细菌产生耐药性，因此，AMPs被认为是最有前途的抗生素替代品。

然而，极大多数AMPs的临床应用受到稳定性差的限制，容易被蛋白酶容降解使其降低甚至失去生物学活性，其中内源性的蛋白酶，尤其是胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶被认为是对AMPs最大的威胁。根据蛋白水解的特异性，胰蛋白酶优先裂解阳离子氨基酸(Arg和Lys)C端侧的肽键。而糜蛋白酶和胃蛋白酶优先裂解疏水性氨基酸(Phe、Trp、Tyr和Leu)的C端侧的肽键，而阳离子氨基酸和疏水性氨基酸是抗菌肽发挥活性的关键。近年来，为了提高AMPs的稳定性，人们提出了许多化学修饰策略，包括多聚肽、环化以及使用氨基酸类似物或非天然氨基酸。尽管这些复杂的化学修饰在一定程度上提高了AMPs的稳定性，但由此产生的高毒性和高昂的生产成本进一步阻碍了AMPs的临床应用前景。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种抗酶解的抗菌肽II4II及制备方法和应用，解决了容易被蛋白酶容降解使其降低甚至失去生物学活性的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种抗酶解的抗菌肽II4II，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：如上所述的一种抗酶解的抗菌肽II4II，制备方法特点如下：

(1)选择高阳离子度的Arg作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷，为了避免胰蛋白酶对Arg的裂解，分别在Arg的N端侧和C端侧放置Cys和Lys，以阻断胰蛋白酶对Arg的裂解，同时，Pro被放置在Lys的C端侧，以阻断胰蛋白酶对Lys的裂解；

(2)为了避免糜蛋白酶和胃蛋白酶的裂解，选择脂肪族侧链较长的Ile作为疏水性氨基酸，放置在Pro的C端侧和Cys的N端侧，以提供必要的疏水性；

(3)在序列单元的N末端和C末端各放置两个Ile，增强疏水性，以进一步提高活性；得出抗酶解抗菌肽模板为：XX(XCRKPX)nXX-NH₂，当X＝I，n＝4时，抗菌肽命名为II4II，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

如上所述的一种抗酶解的抗菌肽II4II在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的胃肠道感染疾病药物中的应用。

本发明具有如下优点及有益效果：通过本方法制备的抗酶解抗菌肽实验技术路线简单，在不使用昂贵的非天然氨基酸和复杂的化学修饰的情况下合理排列序列中天然氨基酸的位置避免酶切位点，提高了其抗酶解能力；对制备的抗菌肽进行抑菌活性、溶血活性和抗酶解能力测定，发现II4II对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌等多种细菌都有较强的抑制作用，对红细胞几乎没有溶血，而且在胰蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶中有较强的抗酶解能力，具有较高的应用价值，治疗指数达到80.63，具有成为抗生素替代品的应用潜力。

附图说明

图1抗菌肽II4II的反相高效液相色谱图；

图2抗菌肽II4II的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗酶解抗菌肽的设计

(1)选择高阳离子度的Arg作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷。为了避免胰蛋白酶对Arg的裂解，分别在Arg的N端侧和C端侧放置Cys和Lys，以阻断胰蛋白酶对Arg的裂解。同时，Pro被放置在Lys的C端侧，以阻断胰蛋白酶对Lys的裂解。

(2)为了避免糜蛋白酶和胃蛋白酶的裂解，选择脂肪族侧链较长的Ile作为疏水性氨基酸，放置在Pro的C端侧和Cys的N端侧，以提供必要的疏水性。

(3)在序列单元的N末端和C末端各放置两个Ile，增强疏水性，以进一步提高活性。

由此设计出抗酶解抗菌肽模板为：XX(XCRKPX)nXX-NH₂，其中X为疏水性氨基酸，n为重复单元数，当X＝I，n＝4时，抗菌肽命名为II4II。

抗菌肽II4II的氨基酸序列如下：

表1肽的氨基酸序列

实施例2

固相化学合成法合成抗菌肽

1.抗菌肽的合成通过多肽合成仪从C端到N端逐一进行。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2.在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，然后将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、H₂O和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3.使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4.抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1所示)与表1中的理论分子量基本一致，且抗菌肽的纯度大于95％(如图2所示)。

实施例3

抗菌肽的生物学活性测定

1.抑菌活性的测定：采用标准微肉汤稀释法测定肽的最小抑菌浓度(MIC)。将对数期的细菌稀释至10⁵CFU/ml。将50μl不同浓度的肽(肽的终浓度为1-128μM)和同等体积的细菌悬液添加到96孔板各孔中，同时设置阴性对照(仅培养基)和阳性对照(细菌和培养基)，然后将96孔板置于37℃恒温培养箱18～20小时。用酶标仪在492nm(OD₄₉₂)处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，II4II对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较高的抑菌活性。

2.溶血活性的测定：收集新鲜的人红细胞悬浮液，并用PBS(pH＝7.4)稀释10倍。将50μl不同浓度的肽(肽的终浓度为1-128μM)和同等体积的红细胞悬浮液置于96孔板各孔中，用0.1％Triton X-100处理的人红细胞悬浮液用作阳性对照，未处理的人红细胞悬浮液用作阴性对照，将96孔板置于37℃恒温培养箱1小时。然后离心(1000g,5min,4℃)后从混合物中收集50μl上清液，并转移至新的96孔板中，用酶标仪在570nm(OD₅₇₀)处测定吸光度值。溶血率使用下列公式计算：

溶血率(％)＝[(样品OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)]×100％最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性及治疗指数

抗酶解抗菌肽II4II在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到80.63。

实施例4

抗菌肽抗酶解能力的测定

为了检测肽的抗酶解能力，分别用不同浓度(0.5、1、2mg/ml)的胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶与肽混合，在37℃下孵育1小时，用未经过蛋白酶处理的肽作为对照，然后用测定最小抑菌浓度的方法(如实施例3步骤所述)测定最小抑菌浓度。

表4蛋白酶处理后的II4II对E.coli 25922的最小抑菌浓度(μM)

通过表4可以看出，胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶对II4II的抑菌活性没有发生变化，说明II4II具有较强的抗酶解能力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种抗酶解的抗菌肽II4II及制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Ile Ile Cys Arg Lys Pro Ile Ile Cys Arg Lys Pro Ile Ile Cys

1 5 10 15

Arg Lys Pro Ile Ile Cys Arg Lys Pro Ile Ile Ile

20 25

Claims

1.一种抗酶解的抗菌肽II4II，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗酶解的抗菌肽II4II，其特征在于，制备方法如下：

(1)选择高阳离子度的Arg作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷，分别在Arg的N端侧和C端侧放置Cys和Lys，同时，Pro被放置在Lys的C端侧；

(2)选择Ile作为疏水性氨基酸，放置在Pro的C端侧和Cys的N端侧；

(3)在序列单元的N末端和C末端各放置两个Ile，得出抗酶解抗菌肽模板为：XX(XCRKPX)nXX-NH₂，当X＝I，n＝4时，抗菌肽命名为II4II，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种抗酶解的抗菌肽II4II在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的胃肠道感染疾病药物中的应用。