CN116554266A - 靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽及其制备方法和应用。其氨基酸序列为：Nap‑DNal‑Nal‑Har‑Har‑NH2，其中，Nap为1‑萘乙酸，DNal为D型1‑萘基丙氨酸，Nal为1‑萘基丙氨酸，Har为高精氨酸，多肽结构采取类表面活性剂模式以降低细胞毒性。本发明还公开了该靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap‑Har在制备治疗由革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。本发明的抗菌肽Nap‑Har对革兰氏阳性病原菌具有较强的抑制作用，而且溶血活性较低，治疗指数达到57.02，具有较强的抗蛋白酶能力，在蛋白酶处理后抑菌活性保持不变，具有成为抗生素替代品的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽及制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是由动植物机体内或微生物分泌的一系列小肽，因其独特的膜穿透机制使细菌的耐药趋势显著降低，因此被誉为抗生素最有力的替代品。然而天然AMPs的细胞毒性较高、生理环境下的稳定性差且具备的广谱抗菌活性会不分青红皂白的杀死益生菌仍然是制约其应用于饲料添加剂的重要因素。因此，广谱抗菌肽的分子改良的重点是缩小抗菌谱，增加对某一种菌类的针对性，以“对症下药”的方式完成药物开发应用。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har，通过结合多肽系统与纳米自组装系统来杀灭革兰氏阳性菌，进一步完善抗菌肽的应用潜力。
本发明所采用的技术方案如下：一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har，其氨基酸序列为：Nap-DNal-Nal-Har-Har-NH2，其中，Nap为1-萘乙酸，DNal为D型1-萘基丙氨酸，Nal为1-萘基丙氨酸，Har为高精氨酸，其C端采用-NH2酰胺化，其结构式为式(I)所示：
如上所述的一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har，其组装条件如下：浓度为4-256μM，37℃培养箱中孵育24小时。
本发明的另一目的是提供一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har的制备方法，如下：1-萘乙酸(Nap)被选择作为疏水基团提供疏水作用力，1-萘基丙氨酸(Nal)被选择作为疏水氨基酸与1-萘乙酸(Nap)组成疏水区域，D型1-萘基丙氨酸(DNal)被放在1-萘乙酸(Nap)之后，并与1-萘基丙氨酸(Nal)处于同一平面，用于促进多肽的自组装；选择高精氨酸(Har)提供正电荷满足多肽的基本条件；选择非天然氨基酸：高精氨酸(Har)和1-萘基丙氨酸(Nal)以避免蛋白酶的水解；使用固相化学合成法进行多肽的合成，再经过体外抑菌活性检测、溶血活性检测、蛋白酶稳定性检测，最后命名为纳米抗菌肽Nap-Har。
本发明的另一目的是提供一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har在制备治疗由革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。
本发明具有如下优点及有益效果：对本发明制备的纳米抗菌肽进行抑菌活性、溶血活性、蛋白酶稳定性测定，发现对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用，而对革兰氏阴性菌无明显的抑制作用，对红细胞几乎没有溶血，而且在蛋白酶条件测试下具有较强的抵抗力，具有较高的应用价值，对革兰氏阳性菌的治疗指数达到57.02，具有成为抗生素替代品的应用潜力。
附图说明
图1为纳米抗菌肽Nap-Har的反相高效液相色谱图；
图2为纳米抗菌肽Nap-Har的质谱图。
图3为纳米抗菌肽Nap-Har的纳米形貌图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
靶向纳米抗菌肽的设计
1-萘乙酸(Nap)被选择作为疏水基团提供疏水作用力，1-萘基丙氨酸(Nal)被选择作为疏水氨基酸与1-萘乙酸(Nap)组成疏水区域，D型1-萘基丙氨酸(DNal)被放在1-萘乙酸(Nap)之后，与1-萘基丙氨酸(Nal)处于同一平面，有利于促进多肽自组装；选择高精氨酸(Har)提供正电荷满足抗菌肽的基本条件；选择非天然氨基酸：高精氨酸(Har)和1-萘基丙氨酸(Nal)以避免蛋白酶的水解；多肽结构采取类表面活性剂模式以降低细胞毒性。得到的多肽Nap-Har的氨基酸序列如下：
表1肽的氨基酸序列
实施例2
固相化学合成法合成抗菌肽
a.树脂溶胀：多肽合成从C末端到N末端依次合成，称Fmoc-Har-OH-Wang树脂倒入反应柱中浸泡30分钟，抽干。
b.脱保护：树脂经过浸泡30分钟，抽掉反应液后脱保护，用哌啶进行脱保护反应30分钟。c.称料：在脱保护后30分钟内，根据所做的多肽剂量，算出每步需要的氨基酸，缩合剂，NMM的反应的量，然后进行称量下一步氨基酸。
d.脱保护洗涤：脱保护15分钟后，抽掉哌啶然后用DMF洗5遍，洗完5遍检测脱保护颜色，并记录。
e投料：洗完脱保护，检测完，按照顺序，依次加入称量好的料，然后加入少许反应液，然后加入碱和NMM。调气均匀，用DCM冲掉反应柱内壁上黏住的树脂，然后记录反应时间，反应30分钟。
f.反应后洗涤：抽干反应柱的溶液，加入适量DMF洗涤，氮气吹鼓2分钟，抽干，重复操作3次。
g.检测：反应三十分钟后，抽掉反应液，用DMF洗3遍后检测，检查是否反应完全。
h.合成完毕后的洗涤和干燥：上述多肽，抽干，反应柱中被加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓吹2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓吹2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割。
切割：将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量配好的切割液(1g/10ml)，放置于恒温摇床中25℃恒温振荡2小时。
过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入100ml的离心管内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品。
洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次，
干燥：将以洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量，待纯化。
纯化：使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，加入反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析(如图1所示)，抗菌肽的纯度大于95％(如图2所示)。
实施例3
抗菌肽的生物学活性测定
1.抑菌活性的测定：采用标准微肉汤稀释法测定肽的最小抑菌浓度(MIC)。将对数期的细菌稀释至105CFU/mL。将50μL不同浓度的肽(肽的终浓度为1-128μM)和同等体积的细菌悬液添加到96孔板样孔中，同时以仅为培养基的孔作为阴性对照和细菌与培养基的孔作为阳性对照，然后将96孔板置于37℃恒温培养箱18～20小时。用酶标仪在OD值为492nm处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性(μM)
通过表2可以看出，Nap-Har对于常见革兰氏阳性菌表现出较高的抑菌活性，而对革兰氏阴性菌无抗菌活性。
2.溶血活性的测定：收集新鲜的人红细胞悬浮液，并用无菌PBS(pH 7.4)稀释10倍。将50μL不同浓度的多肽(肽的终浓度为1-256μM)和同等体积的红细胞悬浮液置于96孔板各孔中，阳性对照为使用0.1％ Triton X-100处理后的人红细胞悬浮液，阴性对照为未处理的人红细胞悬浮液。将96孔板置于37℃恒温培养箱孵育1小时。然后在4℃温度下离心5分钟(1000g)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔板中，用酶标仪在OD值为570nm处测定吸光度值。溶血率使用下列公式计算：
溶血率(％)＝[(样品OD570—阴性对照OD570)/(阳性对照OD570—阴性对照OD570)]×100％最小溶血浓度是抗菌肽引起15％溶血率时的浓度。检测结果见表3。
表3抗菌肽溶血活性及治疗指数
靶向革兰氏阳性菌纳米抗菌肽Nap-Har在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到57.02。
实施例4
纳米抗菌肽蛋白酶稳定性的测定
为了检测肽的抗蛋白酶的能力，使用8mg/mL的胃、胰、糜蛋白酶与肽(2.56mM)等体积混合，在37℃条件下孵育1小时，用未经过蛋白酶处理的肽作为对照，然后用测定最小抑菌浓度的方法(如实施例3步骤所述)测定最小抑菌浓度。
表4蛋白酶处理后的Nap-Har对S.aureus 29213的最小抑菌浓度(μM)
通过表4可以看出，三种蛋白酶对S.aureus 29213的抑菌活性没有发生变化，说明Nap-Har具有较强的蛋白酶稳定性。
实施例5
抗菌肽的纳米表征
1.纳米形貌分析：为了分析Nap-Har的纳米形貌，将2.56mM纳米抗菌肽Nap-Har在去离子水中分别稀释至4、32和256μM浓度，37℃培养箱中孵育24小时。将样品沉积在包碳网上，采取日立h-7800TEM(Hitachi,Japan)在100KV下用1％磷钨酸负染色15秒观察。检测结果见图3。纳米抗菌肽Nap-Har在4μM形成细窄的纤维样，浓度达到32μM时形成的纳米纤维厚度和长度增大，当浓度进一步提高到256μM时，纳米抗菌肽Nap-Har转变为更加紧密的纳米纤维团聚体。
Claims (4)
1.一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har，其特征在于，其氨基酸序列为：Nap-DNal-Nal-Har-Har-NH2，其中，Nap为1-萘乙酸，DNal为D型1-萘基丙氨酸，Nal为1-萘基丙氨酸，Har为高精氨酸，其C端采用-NH2酰胺化，其结构式为式(I)所示：
2.根据权利要求1所述的一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har，其特征在于,其组装条件如下：浓度为4-256μM，37℃培养箱中孵育24小时。
3.根据权利要求1所述的一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har的制备方法，其特征在于，方法如下：1-萘乙酸(Nap)被选择作为疏水基团提供疏水作用力，1-萘基丙氨酸(Nal)被选择作为疏水氨基酸与1-萘乙酸(Nap)组成疏水区域，D型1-萘基丙氨酸(DNal)被放在1-萘乙酸(Nap)之后，并与1-萘基丙氨酸(Nal)处于同一平面，用于促进多肽的自组装；选择高精氨酸(Har)提供正电荷满足多肽的基本条件；选择非天然氨基酸：高精氨酸(Har)和1-萘基丙氨酸(Nal)以避免蛋白酶的水解；使用固相化学合成法进行多肽的合成，再经过体外抑菌活性检测、溶血活性检测、蛋白酶稳定性检测，最后命名为纳米抗菌肽Nap-Har。
4.根据权利要求1所述的一种靶向杀灭革兰氏阳性菌的纳米抗菌肽Nap-Har在制备治疗由革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。
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