CN116284237A - 一种高效的纳米抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高效的纳米抗菌肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高效的纳米抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物技术领域，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明选择精氨酸提供正电荷、选择苯丙氨酸和色氨酸提供疏水性；选择苯丙氨酸以构建分子间π‑π键提供疏水力驱动多肽自组装；中心选择色氨酸拉链稳定整体分子内结构，末端酰胺化与水分子形成氢键，精氨酸在2、3、8和9号位与色氨酸形成阳离子‑π键推动分子自组装进程；采用中心对称结构以降低肽分子的细胞毒性。纳米抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌的感染性疾病的药物中的应用。本发明的抗菌肽对病原菌具有广谱抑制作用，而且溶血活性较低，治疗指数达到50.79，具有较强的生理环境下的稳定性。

Description

一种高效的纳米抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的纳米抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
在过去的90多年里，抗生素在医学、食品、畜牧等行业有着广泛的应用。但是，抗生素的滥用加速了耐药性的发展，给全球公共卫生带来极大威胁。超级细菌的产生迫使寻找抗生素的替代品已成为当务之急。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)广泛存在于自然界生物体内，具有抗细菌、抗真菌、抗炎等多种生物活性，是宿主免疫系统的重要组成部分。AMPs独特的非特异性膜破坏机制很难使细菌产生耐药性，因此，AMPs被认为是最有前途的抗生素替代品。
然而单体抗菌肽分子在生理环境下易受影响，例如在盐离子和模拟血清中失去抗菌活性，此外细胞毒性大的问题依然制约着单体抗菌肽分子的临床潜力。因此，单体分子改良的重点是在有限的成本下增强其生理稳定性及提高生物相容性。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种高效的纳米抗菌肽FRRFW，该纳米抗菌肽在盐离子和血清中抗菌活性高且性能稳定。
本发明所采用的技术方案如下：一种高效的纳米抗菌肽FRRFW，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其C端采用-NH2酰胺化。
进一步的，其分子式如式(Ⅰ)所示，
Figure BDA0004121629720000011
进一步的，其自组装条件为：浓度为10.40-256uM，室温孵育24小时。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种高效的纳米抗菌肽FRRFW的制备方法，如下：(1)选择精氨酸提供正电荷、选择苯丙氨酸和色氨酸提供疏水性；
(2)选择苯丙氨酸以构建分子间π-π键提供疏水力驱动多肽自组装；中心选择色氨酸拉链稳定整体分子内结构，末端酰胺化与水分子形成氢键进一步使肽段稳定，此外精氨酸在2、3、8和9号位与色氨酸形成阳离子-π键推动分子自组装进程；最后采用中心对称结构以降低肽分子的细胞毒性；
(3)用固相化学合成法合成该多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，再经过抑菌活性的测定、溶血活性的测定及生理条件下的稳定性测定，最终命名为抗菌肽FRRFW。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种高效的纳米抗菌肽FRRFW在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌的感染性疾病的药物中的应用。
本发明具有如下优点及有益效果：通过本方法制备的高效纳米抗菌肽实验技术路线简单；对制备的纳米抗菌肽进行纳米表征、抑菌活性、溶血活性、生理盐及血清稳定性测定，发现抗菌肽FRRFW对病原菌具有较强的抑制作用，对红细胞几乎没有溶血，治疗指数达到50.79，而且在生理条件测试下具有较强的抵抗力，具有较高的应用价值，具有高效的杀菌活性、良好的生物相容性和稳定性，具有成为抗生素替代品的应用潜力。
附图说明
图1纳米抗菌肽FRRFW的反相高效液相色谱图；
图2纳米抗菌肽FRRFW的质谱图；
图3纳米抗菌肽的荧光光谱图；
图4纳米抗菌肽的临界聚集浓度测定图；
图5纳米抗菌肽的纳米形貌图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
纳米抗菌肽的设计
(1)选择精氨酸提供正电荷、选择苯丙氨酸和色氨酸提供疏水性以满足抗菌肽的基本特征；(2)选择苯丙氨酸以构建分子间π-π键提供疏水力驱动多肽自组装；中心选择色氨酸拉链稳定整体分子内结构，末端酰胺化与水分子形成氢键进一步使肽段稳定；精氨酸在2、3、8和9号位与色氨酸形成阳离子-π键推动分子自组装进程；最后采用中心对称结构以降低肽分子的细胞毒性。
(3)得出纳米抗菌肽模板为：FRRFWWFRRF-NH2，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，命名为抗菌肽FRRFW。
纳米抗菌肽FRRFW的氨基酸序列如下：
Figure BDA0004121629720000031
表1肽的氨基酸序列
Figure BDA0004121629720000032
实施例2
固相化学合成法合成抗菌肽
序列：N端-A1A2A3……An-C端
a.树脂溶胀：称Fmoc-Phe-Resin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干。
b.脱保护：向反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干。
c.称料：在脱保护30分钟内，根据所做的量，算出每步需要的氨基酸，缩合剂，NMM的反应的量，然后进行称量下一步氨基酸Fmoc-An-1。
d.脱保护洗涤：向反应柱中加入适量DMF，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次。
e投料：洗完脱保护，检测完，按照每条肽的顺序，依次加入称量好的料，然后加入少许反应液，然后加入碱,NMM。调气均匀，用DCM冲掉反应柱内壁上黏住的树脂，然后记录反应时间，反应30分钟。
f.反应后洗涤：将反应柱中的溶液抽干，加入适量DMF洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次。
g.检测：取适量(10-20颗)树脂于小试管中，加入A，B，C液各两滴。放入干式加热器中加热3分钟(110摄氏度)。取出后若溶液显蓝色，树脂有杂色不透明，则反应没有完全，需要重新再反应一次；若溶液颜色微黄，树脂无色透明则为反应完全，可以连接下一个氨基酸，具体步骤重复以上b-f这五个步骤，直到连完最后一个氨基酸。
h.合成完毕后的洗涤和干燥：上述多肽，抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割。
切割：将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量配好的切割液(1g/10ml)，放置于恒温摇床中25℃恒温振荡2小时。
过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入100ml的离心管内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品。
洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次，
干燥：将以洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量，待纯化。
纯化：使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，加入反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析(如图1所示)，抗菌肽的纯度大于95％(如图2所示)。
实施例3
纳米抗菌肽的生物学活性测定
1.抑菌活性的测定：采用标准微肉汤稀释法测定肽的最小抑菌浓度(MIC)。将对数期的细菌稀释至105CFU/ml。将50μL不同浓度的肽(肽的终浓度为1-128μM)和同等体积的细菌悬液添加到96孔板各孔中，同时设置阴性对照(仅培养基)和阳性对照(细菌和培养基)，然后将96孔板置于37℃恒温培养箱18～20小时。用酶标仪在492nm(OD492)处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性(μM)
Figure BDA0004121629720000041
通过表2可以看出，FRRFW对于常见的病原菌表现出较高的抑菌活性。
2.溶血活性的测定：收集新鲜的人红细胞悬浮液，并用PBS(pH＝7.4)稀释10倍。将50μL不同浓度的肽(肽的终浓度为1-512μM)和同等体积的红细胞悬浮液置于96孔板各孔中，用0.1％ Triton X-100处理的人红细胞悬浮液用作阳性对照，未处理的人红细胞悬浮液用作阴性对照，将96孔板置于37℃恒温培养箱1小时。然后离心(1000g,5min,4℃)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔板中，用酶标仪在570nm(OD570)处测定吸光度值。溶血率使用下列公式计算：
溶血率(％)＝[(样品OD570—阴性对照OD570)/(阳性对照OD570—阴性对照OD570)]×100％最小溶血浓度是抗菌肽引起15％溶血率时的浓度。检测结果见表3。
表3纳米抗菌肽溶血活性及治疗指数
Figure BDA0004121629720000051
纳米抗菌肽FRRFW在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到50.79。
实施例4
抗菌肽的纳米表征
1.临界聚集浓度测定：为了检测抗菌肽形成纳米结构的能力，首先使用1-苯胺-8-萘磺酸(ANS)荧光探针测定了临界聚集浓度(CAC)。将1μL ANS(1mM，溶解于DMF中)加入不同浓度的多肽(溶解于去离子水中)，37℃孵育15min。将混合样品转移到96孔板上，使用F-4500荧光分光光度计(日立，日本)，激发波长为369nm，荧光光谱从440nm监测到550nm。随后使用Origin软件计算多肽的CAC值。检测结果见图3-4。
随着浓度的上升，纳米抗菌肽FRRFW在检测范围内荧光强度逐渐上升，表明溶液中存在纳米大分子，初步判定了纳米结构的形成，随后使用Origin软件拟合分析FRRFW的CAC值为10.40uM。
2.形貌分析：为了进一步分析抗菌肽的纳米形貌，将肽(2.56mM)在去离子水中稀释至4-256μM浓度，室温孵育24小时。将样品沉积在包碳网上，用日立h-7800TEM(Hitachi,Japan)在100KV下用1％磷钨酸负染色30秒观察。检测结果见图5。
纳米抗菌肽FRRFW在4μM形成松散的纳米片状，浓度达到CAC值转变为纳米线状，当浓度进一步提高到256μM时，多肽转变为更加紧密的球状胶束和囊泡结构。
纳米抗菌肽生理稳定性的测定
为了检测肽在生理条件下的稳定性，这些试验使用大肠杆菌ATCC 25922作为革兰氏阴性细菌模型。在盐稳定性试验中，将盐粉溶解在0.2％ BSA溶液中后，评估肽的MIC值的折叠变化。最终盐浓度为:NaCl,150mM；KCl,4.5mM；NH4Cl,6mM；CaCl2,2mM；ZnCl2,8mM；和MgCl2,1mM,FeCl3,4mM。用于血清敏感性测定，等体积的FRRFW与25％、50％和100％血清与0.2％ BSA溶解孵育。
表4生理条件下的FRRFW对大肠杆菌ATCC 25922的最小抑菌浓度(μM)
Figure BDA0004121629720000061
通过表4可以看出，只有在50％浓度血清和NaCl和CaCl2对FRRFW的抑菌活性略有影响，且MIC的变化在4倍之内，说明抗菌短肽FRRFW具有较强的盐离子稳定性和血清稳定性。

Claims (5)

1.一种高效的纳米抗菌肽FRRFW，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端采用-NH2酰胺化。
2.根据权利要求1所述的一种高效的纳米抗菌肽FRRFW，其特征在于，分子式如式(Ⅰ)所示，
Figure FDA0004121629710000011
3.根据权利要求1所述的一种高效的纳米抗菌肽FRRFW，其特征在于，其自组装条件为：浓度为10.40-256uM，室温孵育24小时。
4.根据权利要求1所述的一种高效的纳米抗菌肽FRRFW的制备方法，其特征在于，制备方法如下：
(1)选择精氨酸提供正电荷、选择苯丙氨酸和色氨酸提供疏水性；
(2)选择苯丙氨酸以构建分子间π-π键提供疏水力驱动多肽自组装；中心选择色氨酸拉链稳定整体分子内结构，末端酰胺化与水分子形成氢键进一步使肽段稳定；精氨酸在2、3、8和9号位与色氨酸形成阳离子-π键推动分子自组装进程；最后采用中心对称结构以降低肽分子的细胞毒性；
(3)用固相化学合成法合成该多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，再经过抑菌活性的测定、溶血活性的测定及生理条件下的稳定性测定，最终命名为抗菌肽FRRFW。
5.根据权利要求1所述的一种高效的纳米抗菌肽FRRFW在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌的感染性疾病的药物中的应用。
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