CN110066320B - 抗多重耐药菌环肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗多重耐药菌环肽，其特征在于，氨基酸序列为以下四种中的任意一种：CPeptide‑A、CPeptide‑B、CPeptide‑C、CPeptide‑D所述抗菌环肽为上述任意一种氨基酸序列的首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到。本发明提供的四种新的人工设计阳离子的抗菌肽，这些抗菌肽可采用Fmoc固相化学法合成获得，可操作性强，成本低。这些阳离子抗菌肽对多重耐药鲍曼不动杆菌具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，且对动、植物细胞无任何毒害作用。

Description

抗多重耐药菌环肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗多重耐药菌环肽及其制备方法和应用，涉及环肽领域。

背景技术

抗生素的使用已超过70年，但是由于抗生素的滥用，使得许多细菌对抗生素产生了耐药性，如万古霉素耐药性肠溶细菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐氨苄青霉素等大肠杆菌等。各种耐药菌的产生甚至是超级细菌的出现，使得细菌感染性疾病成为了人们急需解决的问题，由于多重耐药细菌的反复出现，病原体对传统抗生素具有抗药性，而新抗生素的研究和发现过程相对缓慢。因此，开发新的，高效和安全的抗菌药物是非常必要的。

抗菌肽是一种多肽物质，它的作用是抵抗外源性病原体侵入体内，主要是破坏靶细胞的细胞膜，然后产生多种细菌。抗菌肽具有广泛的抗菌谱和快速的灭菌速度。除了它的抑制和杀菌功能外，它还能抵抗真菌，病毒，寄生虫和原生动物。以及在天然免疫中发挥非常重要的作用。抗菌肽有很多作用机制，不同的抗菌肽具有不同的作用机制。目前，没有统一的声明。有许多模型可以解释抗菌肽和膜的过程，如桶板模型，毯模型和环孔模型。与传统抗生素相比，抗菌肽具有许多优点，如良好的热性能稳定性好，抗菌谱广，杀菌率高，还能抑制和杀死一些真菌，寄生虫，病毒等。因此，针对滥用抗生素引起的问题，抗菌肽无疑已成为解决它的良药，有望成为一种高效低毒的新型抗菌药物。因此，其结构的转换和修改也变得非常重要。

为了从多肽中找到抗微生物肽，人们最初通过进行实验来研究多肽，并通过观察它们是否具有抗微生物活性来鉴定它们。以这种方式，尽管可以准确地确定多肽是否具有抗微生物作用。然而，实验过程繁琐，需要很长时间，需要大量资金，并且不能预测抗菌肽的活性。随着高通量蛋白质组学的发展，蛋白质和多肽序列的数量迅速增加。很难从大量肽样品中鉴定出有效的抗菌肽，并通过实验预测其抗菌活性。因此，我们需要找到其他方法来鉴定和预测有效的抗菌肽。随着生物信息学的不断发展，计算方法被用于筛选和活性预测，这种方法有效地解决了实验方法的各种缺点。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗多重耐药菌环肽，本发明还提供该种抗菌环肽的制备方法及其应用，抗菌活性强、成本相对较低、溶血毒性较低。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种抗多重耐药菌环肽，其特征在于，氨基酸序列为以下四种中的任意一种：

CPeptide-A：R-R-W-W-R(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)

CPeptide-B:R-R-W-W-R-F(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)

CPeptide-C:R-W-W-R-F(Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)

CPeptide-D:R-R-W-W-R-W(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp)；

所述抗菌环肽为上述任意一种氨基酸序列的首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到。

结构式为：

CPeptide-A

CPeptide-B

CPeptide-C

CPeptide-D

本发明是在对天然抗菌肽的序列结构分析的基础上设计的阳离子抗菌肽，以牛乳铁蛋白LfcinB6_4-9(RRWQWR)为设计模板,对RRWQWR进行适当的改变优化，运用生物信息学和经典的三维构效关系分析方法设计出4条直链肽，分别是“RRWWR”“RRWWRF”,“RWWRF”,“RRWWRW”,前期实验研究发现其具有较好的抗菌活性，为得到抗菌效果更好，稳定性更强，毒性更低的抗菌肽，依据环肽的优良特性，将这四条直链肽首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环合成环肽。与模板肽LfcinB6_4-9(RRWQWR)相比，CPeptide-A的溶血毒性较对照肽显著降低。

优选：氨基酸序列为：CPeptide-A：R-R-W-W-R(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)。抗菌效果显著高于其它三种抗菌环肽，溶血毒性最低。

所述的抗多重耐药菌环肽的制备方法，其特征在于：采用Fmoc固相多肽合成方法，以二氯树脂为载体，先合成全保护线性肽，然后利用切割试剂裂解，得到全保护线性肽，然后在液相中环化得到全保护环肽，最后用三氟乙酸去保护后经醚沉淀得环肽粗品。

上述方案中：缩合剂采用DIC/Cl-HOBt。

上述方案中：采用HPLC梯度洗脱对粗肽进行分离纯化。

上述抗多重耐药菌环肽在抗菌中的应用。

上述抗多重耐药菌环肽在抗多重耐药鲍曼不动杆菌中的应用。

有益效果：本发明提供的四种新的人工设计阳离子的抗菌肽，这些抗菌肽可采用Fmoc固相化学法合成获得，可操作性强，成本低。这些阳离子抗菌肽对多重耐药鲍曼不动杆菌具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，且对动、植物细胞无任何毒害作用。

附图说明

图1是抗菌肽CPeptide-A的质谱图。

图2是抗菌肽CPeptide-B的质谱图。

图3是抗菌肽CPeptide-C的质谱图。

图4是抗菌肽CPeptide-D的质谱图。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图，对本发明作进一步说明：

目标产物CPeptide-A，CPeptide-B，CPeptide-C，CPeptide-D，对照抗菌肽LfcinB6_4-9的固相合成

按照标准的Fmoc固相程序人工合成抗菌肽：

CPeptide-A：R-R-W-W-R(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)，

CPeptide-B:R-R-W-W-R-F(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)，

CPeptide-C:R-W-W-R-F(Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)，

CPeptide-D:R-R-W-W-R-W(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp。

合成的产物经过反相液相色谱(Vydac 218TP1022柱2.2*25cm)纯化，采用乙腈/水体系洗脱，然后质谱分析确定制备的CPeptide-A多肽序列为：R-R-W-W-R(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)，CPeptide-B多肽序列为:R-R-W-W-R-F(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)，CPeptide-C多肽序列为:R-W-W-R-F(Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)，CPeptide-D多肽序列为:R-R-W-W-R-W(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp)。

实施例1抗菌肽CPeptide-A:R-R-W-W-R(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)的合成

采用Fmoc固相多肽合成方法，以二氯树脂2-CTC树脂为载体，先合成全保护线性肽，利用切割试剂裂解得到全保护线性肽，然后在液相中环化得到全保护环肽，最后用三氟乙酸去保护后经醚沉淀得环肽初品。

具体操作步骤为：

(1)树脂活化

称取树脂1g用10ml的DCM(二氯甲烷)室温溶胀30min。

(2)第一个氨基酸与树脂偶联

称取树脂取代值总量3eq的保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH加入到DCM溶液中，再加入树脂取代值总量9eq的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行溶解，将溶解后的澄清溶液加入到溶胀后的树脂中偶联反应3h，排出废液，DMF(二甲基甲酰胺)洗涤3次。

(3)偶联第二个氨基酸

A.脱Fmoc保护基：加入5ml体积比为20％的PPD(六氢吡啶)/DMF试剂到装有步骤(2)反应管中反应5min，排出反应液后再次加入5ml 20％的PPD/DMF溶液反应25min。

B.脱保护后洗涤：用DMF液洗涤8次，每次洗涤时间3min，每次用量5ml。洗涤结束后取少量树脂用溴酚蓝溶液进行显色检测，树脂应呈深色。

C.偶联Fmoc-AA-OH：称取3eq待偶联的保护氨基酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)和3eq的Cl-HOBt，加入DMF 4ml溶解，溶解毕再加入3eq的DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)振荡混合1-2min，将溶液加入反应管与脱保护后的树脂在室温反应1.5h；

D.偶联后洗涤：用DMF洗涤树脂5次，每次洗涤时间3min，每次用量5ml。洗涤结束后取少量树脂用溴酚蓝溶液进行显色检测，树脂应近乎无色。

(4)重复偶联氨基酸

按照第(3)步的氨基酸偶联方式依次偶联完所有的保护氨基酸(Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH)，偶联完成后并按(3A)步脱除最后一个保护氨基酸的Fmoc保护基，然后用DMF洗涤4次后用DCM洗涤5次，真空减压抽干。

(5)树脂裂解获全保护线性肽

将树脂用其重量5倍体积的TFA(三氟乙酸)/DCM(体积比为2％左右)溶液进行3-5次裂解，每次时间3分钟。裂解液立即用浓度为10％的NaHCO₃溶液调到中性。合并多次裂解液，真空减压浓缩，析出固体，过滤，水洗。固体真空减压干燥后得全保护线性肽。

(6)全保护线性肽环合

将全保护线性肽用THF(四氢呋喃)或DCM溶解，若溶解性不好可加入少许DMF助溶。控制最终全保护肽浓度为5mg/ml以下。加入缩合剂DIC/Cl-HOBt(体积比1:1)进行反应，液相监控反应进程。反应结束后，蒸除溶剂，加水析出固体。固体水洗后烘干得全保护环肽。

(7)环肽脱保护得粗品

将全保护环肽用按体积比为95％TFA/H₂O进行室温裂解2h，加入甲基叔丁基醚析出粗品，洗涤、烘干后送检。

(8)环肽粗品精制

粗品肽用30-50mL的浓度为50％的乙腈溶液溶解，可以超声2min助溶，用滤膜过滤溶解液。

洗脱条件为：0min，乙腈：水的体积比5％:95％到40min，乙腈：水75％:25％，流速1ml/min，柱子为Vydac 218TP1022柱2.2×25cm，收集从检测器出来的样品，旋转蒸发去除溶剂，得到环肽。

(9)环肽结构鉴定

制备的抗菌肽CPeptide-A经过质谱分析，在质谱中显示的分子量分别为840.45，由多肽序列计算出的理论值为840.99,证明制备的多肽即为设计的CPeptide-A。

实施例2抗菌肽CPeptide-B:R-R-W-W-R-F(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)合成参照实施案例1，其中第(4)步氨基酸偶联依次为(Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe(Pbf)-OH)。

制备的抗菌肽CPeptide-B经过质谱分析，在质谱中显示的分子量分别为987.90，由多肽序列计算出的理论值为988.167,证明制备的多肽即为设计的CPeptide-B。

实施例3抗菌肽CPeptide-C:R-W-W-R-F(Arg-Trp-Trp-Arg-Phe)合成

参照实施案例1，其中第(3)步偶联氨基酸为Fmoc-Trp(Pbf)-OH，第(4)偶联氨基酸依次为(Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe(Pbf)-OH)。

制备的抗菌肽CPeptide-C经过质谱分析，在质谱中显示的分子量分别为831.80，由多肽序列计算出的理论值为831.979。证明制备的多肽即为设计的CPeptide-C抗菌肽。

实施例4 CPeptide-D:R-R-W-W-R-W(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp)合成

参照实施案例1，其中第(4)偶联氨基酸依次为(Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Trp(Pbf)-OH)。

制备的抗菌肽CPeptide-D经过质谱分析，在质谱中显示的分子量为1026.8，由多肽序列计算出的理论值为1027.22。证明制备的多肽即为设计的CPeptide-D抗菌肽。

实施例5阳离子抗菌肽的杀菌活性检测

以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。

采用琼脂打孔法对阳离子抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用阳离子的抗菌肽LfcinB6_4-9RRWQWR作为对照，以评价本发明中核心序列CPeptide-A，CPeptide-B，CPeptide-C，CPeptide-D的杀菌活性。

按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：

菌种复苏：接种耐药鲍曼不动杆菌于NA营养琼脂培养基中划线，放于恒温培养箱进行培养，温度为37℃，培养时间为16-20小时，可以使得细菌生长状态达到对数期。

菌种培养：待细菌生长状态达到对数期，我们可以挑取单个的菌落放置于100mlMHB培养基进行培养，培养温度同样为细菌的生长最适温度37℃，摇床转速为160转，摇床培养(16-20h)。

菌悬液制备：细菌的浓度测定一般通过麦氏比浊管进行测定，麦氏比浊管浊度在0.5麦氏浊度左右，此时细菌菌落数约为1.5×10⁸cfu/ml，然后再按1:1000稀释成10⁵-10⁶cfu/ml的菌悬液。

抗菌实验：将稀释好的菌悬液分别按0.1ml/平板的量均匀涂于25ml NA培养基。待菌液凝固后，打孔直径5mm。阳性对照加50ul 1mg/ml亚胺培南；阴性对照，加50ul去离子水；其他孔分别加50ul 1mg/ml抗菌肽溶液。于37℃恒温培养箱进行细菌培养，16h后测量细菌的抑菌圈大小，从而可以初步确定细菌的抑菌活性大小，进行三组平行实验。

表1 1mg/ml抗菌肽对不同细菌的抗菌活性的测定比较

"+"代表5mm。

上表中+号越多，说明杀菌能力越强。从上表看出本发明的阳离子抗菌肽杀菌能力明显且优于对照抗菌肽，尤其是抗菌肽CPeptide-A的抗菌效果显著高于其他抗菌肽。

实施例6阳离子抗菌肽的抑菌活性检测

以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。

对阳离子抗菌肽进行最低抑菌能力的测定，并用阳离子的抗菌肽LfcinB6_{4- 9}RRWQWR作为对照，以评价本发明中核心序列CPeptide-A，CPeptide-B，CPeptide-C，CPeptide-D的抑菌能力。

按以下步骤进行测定抗菌肽的抑菌活性：

收集对数期生长的细菌，在4℃、8000转/分钟离心2min，用生理盐水清洗3遍，加入新鲜的肉汤培养基，使菌悬液浓度为2.0×10⁵CFU/mL。在96孔细胞培养板的实验孔中加入50uL的菌悬液(四周孔中加100uL PBS)，再加入50uL不同浓度的肽溶液(亚胺培南溶液)，使横排各孔中肽溶液(亚胺培南溶液)的终浓度(ug/mL)分别为：512、256、128、64、32、16、4。等体积的PBS缓冲液为生长对照组，每组设置三个平行组，加盖细胞培养板后，放置在37℃的生化培养箱内培养12h，通过全自动酶标测定每个孔内细菌生长情况(OD600nm)。最低抑菌浓度MIC(Minimum Inhibitory Concentrations)定义为细菌生长被完全抑制孔的肽浓度。

表2四种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较

表中的最低抑菌浓度值越小，说明该抗菌环肽的抗菌能力越强。从上表可以看出，与对照肽相比，本发明的四种抗菌环肽具有较低的最低抑菌浓度，且MIC比LfcinB6_4-9均要小很多，说明本发明的阳离子抗菌环肽的抗菌能力远远强于对照的抗菌肽。

实施例7体外溶血活性检测

检测抗菌肽在正常细胞中的细胞毒性是其能够在临床上得到使用的必要措施，阳离子抗菌肽发挥的抗菌功效是介于其正电性可与细胞膜中的带有负电荷的磷脂酰甘油以及心磷脂发生静电吸引，从而破坏细菌细胞膜的结构而抗菌。但是由于真核细胞的细胞膜里有磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇等，它们均带负电荷，可能会造成抗菌肽和真核细胞细胞膜发生结合而造成细胞毒性。因此需要检测多肽的溶血毒性，实验表明，在高浓度下抗菌肽溶血率依然非常低，证实本发明抗菌肽的溶血毒性极小。

本实施例用于检测阳离子抗菌肽对绵羊血红细胞溶血率，并用阳离子的抗菌肽LfcinB6_4-9RRWQWR作为对照。使用的血样取于脱纤维绵羊血。

阳离子抗菌肽的溶血率的检测步骤是：

选取绵羊血细胞，4℃,3000转/分钟离心10min，弃上清，用生理盐水清洗下层红细胞3次后，重悬为3％的红细胞悬液。加100uL不同浓度的肽溶液于EP管中，各管中肽溶液的终浓度(ug/mL)分别为：256、128、64、32、16、4，加100uL的红细胞悬液。每组设置三个平行组。阴性对照组加入等体积的生理盐水，阳性对照组加入100uL的0.1％Triton-X100。将反应液置生化培养箱内37℃培养0.5h，取出，3000转/分钟离心10min，吸取100uL的上清液转移至96孔板，用酶标仪测570nm波长的吸光度。实验重复三次，所得数据取平均值。

溶血率＝[(OD_试验孔-OD_阴性孔)/(OD_阳性孔-OD_阴性孔)]×100％

检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性检测结果

抗菌肽的溶血率值越小说明抗菌肽的毒性越低。从表中可以看出，与对照肽相比，抗菌肽CPeptide-A的溶血毒性较小，而其它三种抗菌肽的溶血毒性在256和128ug/mL的高浓度下较大，但是基于其良好的抗菌活性，仍然有着一定的研究价值。

本发明不局限于上述实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 重庆理工大学

<120>抗多重耐药菌环肽及其制备方法和应用

<130>

<160>4

<210> 1

<211>5

<212> PRT

<213>人工合成

<220>

<223>CPeptide-A

<400> 1

Arg-Arg-Trp-Trp-Arg

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213>人工合成

<220>

<223>CPeptide-B

<400> 2

Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe

1 5 6

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213>人工合成

<220>

<223>CPeptide-C

<400> 3

Arg-Trp-Trp-Arg-Phe

1 5

210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213>人工合成

<220>

<223>CPeptide-C

<400> 4

Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp

1 5 6

Claims (2)

1.一种抗菌环肽在制备抗多重耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用，所述环肽为由抗菌肽经过首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的下列环肽中的一种：

CPeptide-A

CPeptide-B

2.一种抗菌环肽在制备抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌药物中的应用，该抗菌环肽的结构式为：

CPeptide-C

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