CN115746094B - 抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌肽及其制备方法和应用，其氨基酸序列为：11pep:V‑W‑R‑K‑W‑R‑R‑F‑W‑K‑R‑NH2(Val‑Trp‑Arg‑Lys‑Trp‑Arg‑Arg‑Phe‑Trp‑Lys‑Arg‑NH2)；或与11pep的序列相反的D型氨基酸D‑11pep:R(D)‑K(D)‑W(D)‑F(D)‑R(D)‑R(D)‑W(D)‑K(D)‑R(D)‑W(D)‑V(D)‑NH2(Arg‑Lys‑Trp‑Phe‑Arg‑Arg‑Trp‑Lys‑Arg‑Trp‑Val‑NH2)。其细胞毒性和溶血毒性低，可操作性强、成本低，可有效运用于人或动物感染性疾病的预防和治疗，及食品保鲜防腐中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用，涉及多肽领域。
背景技术
耐药菌感染是全球关注的公共健康问题。特别是6种超级细菌(ESKAPE：屎肠球菌、金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌属细菌)。由于抗生素滥用超级细菌已对碳青霉烯类和第四代头孢等一线临床抗生素产生了耐药性。抗生素的开发主要依赖于现有抗生素结构的改造，而新颖骨架结构的抗生素的发现与开发愈发困难，已很难应对日趋严重的耐药菌感染问题。
抗菌肽(AMP)是一类带有正电性，具有双亲性结构特征的小分子量天然多肽，是高等生物自然免疫的重要组成部分。抗菌肽具有抗菌、抗病毒、免疫调节等多种生物功能，其结构多样、抗菌谱广、杀菌快速、作用机制广泛、潜在耐药性低等，是抗耐药菌感染最具发展潜力的候选结构。
外膜蛋白在细胞质中合成后经内膜转运至细胞周质，经信号肽酶酶切后形成未折叠外膜蛋白，由分子伴侣运送至β-桶状蛋白组装机器(Bam)，再由Bam正确折叠为“β-桶状”并插入至外膜，而未折叠外膜蛋白在细胞周质中积累会产生毒性。Bam是由β-桶状蛋白(BamA)和4个脂蛋白(BamB-E)组成的复合物，其中，BamA和BamD是必需的保守蛋白，BamD负责接收非折叠外膜蛋白，BamA在BamD协助下完成β-桶状外膜蛋白的折叠。抑制BamA、BamD和分子伴侣(如SurA)均可导致非折叠外膜蛋白的积累，进而对细菌产生毒性。BamA不仅是所有革兰氏阴性外膜生物合成所必需的蛋白，而且在各种病原菌以及粘菌素耐药菌中均稳定表达，是抗菌肽发现与结构优化的理想靶标。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗菌肽，本发明还提供该种抗菌环肽的制备方法及其应用，具有良好的热稳定性，以及对多种蛋白酶、还原剂等有较好的稳定性，毒性低。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列为：
11pep:V-W-R-K-W-R-R-F-W-K-R-NH2(Val-Trp-Arg-Lys-Trp-Arg-Arg
-Phe-Trp-Lys-Arg-NH2)；
或与11pep的序列相反的D型氨基酸D-11pep:R(D)-K(D)-W(D)-F(D)-R(D)-R(D)-W(D)-K(D)-R(D)-W(D)-V(D)-NH2(Arg-Lys-Trp-Phe-Arg-Arg-Trp-Lys-Arg-Trp-Val-NH2)
所述抗菌肽在防腐保鲜剂中的应用。
所述抗菌肽在抗多药耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)、耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，以及标准菌株鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肺炎克雷伯杆菌(ATCC700603)、屎肠球菌(ATCC19434)、大肠埃希菌(ATCC25922)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)中的应用。
本发明针对细菌外膜蛋白BamA虚拟组合设计筛选APD3数据库，得到了结合能最高的10条多肽(AP02937、AP02664、AP02776、AP02951、AP02933、AP00141、AP02856、AP00431、AP01550、AP02857)，以上述多肽为模板，结合多肽序列特征优化设计了抗菌肽11pep。为了提高L-型线性抗菌肽的抗菌活性和稳定性，将11pep的序列设计成了序列相反的D型氨基酸得到了D-11pep。
本发明设计改造天然抗菌肽而得到的11pep以及D-11pep，引入非天然的氨基酸可以提高耐受酶降解的能力，引入D型氨基酸减低抗菌肽被蛋白酶降解，并且经过D型氨基酸修饰后的该肽细胞选择性增强。解决了天然AMP稳定性差、毒性较大、容易产生耐药等问题，极具发展潜力和临床应用价值。另外，此抗菌肽具有良好的热稳定性、以及对多种蛋白酶、还原剂等有较好的稳定性，毒性低，是食品生产中优良的保鲜和防腐添加剂。
所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：通过固相合成法合成制备多肽，选用4-甲苯氢胺树脂作为树脂载体，在合成过程中，首先将树脂溶胀后脱保护基，与首个氨基酸C端上的羧基进行反应，第一个氨基酸连接在树脂载体上后，对其进行脱水缩合，然后根据所设计肽的氨基酸序列依次进行操作，将剩下的氨基酸依次连接上，待所有合成程序完成后，将树脂载体上的多肽切割下来，合成肽采用高效液相色谱进行精制、分离和纯化得到。
有益效果：本发明提供的抗菌肽，这些抗菌肽可采用Fmoc固相化学法合成获得，可操作性强，成本低。具有良好的抗菌活性，制备难度低，且细胞毒性和溶血毒性低，是食品生产中优良的保鲜和防腐添加剂。
附图说明
图1是抗菌肽11pep与靶蛋白BamA结合示意图。
图2是抗菌肽11pep的质谱图。
图3是抗菌肽D-11pep的质谱图。
图4是抗菌肽11pep的时间-杀菌曲线。
图5是抗菌肽D-11pep的时间-杀菌曲线。
图6是抗菌肽11pep的溶血毒性。
图7是抗菌肽D-11pep的溶血毒性。
图8是抗菌肽11pep的细胞活性。
图9是抗菌肽D-11pep的细胞活性。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图，对本发明作进一步说明：
实施例1
抗菌肽的设计：大多数抗菌肽的结构为α-螺旋，这种类型的肽同时具有亲水性和疏水性。大量研究表明，α-螺旋抗菌肽主要通过破坏细菌细胞膜从而达到杀菌效果。针对细菌外膜蛋白BamA虚拟组合设计筛选APD3数据库，得到了结合能最高的10条多肽(AP02937、AP02664、AP02776、AP02951、AP02933、AP00141、AP02856、AP00431、AP01550、AP02857)，以上述多肽为模板，结合多肽序列特征，例如两亲性结构、带有正电荷等，优化设计了抗菌肽11pep。BamA蛋白与抗菌肽的结合位点如图1所示。
抗菌肽的改造：基于抗菌肽的α螺旋结构是发挥生物活性的关键，若是单个或定点引入D型氨基酸，将会破坏其螺旋结构导致抗菌活性降低，所以将11pep的序列设计成了序列相反的D型氨基酸序列得到了D-11pep，序列为
11pep:V-W-R-K-W-R-R-F-W-K-R-NH2(Val-Trp-Arg-Lys-Trp-Arg-Arg-Phe-Trp-Lys-Arg-NH2)
D-11pep:R(D)-K(D)-W(D)-F(D)-R(D)-R(D)-W(D)-K(D)-R(D)-W(D)-V(D)-NH2(Arg-Lys-Trp-Phe-Arg-Arg-Trp-Lys-Arg-Trp-Val-NH2)
抗菌肽的合成
目标产物11pep，D-11pep按照标准的Fmoc固相程序人工合成抗菌肽。
合成的产物经过高纯硅胶色谱柱(SHIMADZU Inertsil ODS-SP)纯化，采用
A相：0.1％三氟乙酸水溶液
B相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液
1、树脂的活化及预处理
准确称取0.47g的MBHA树脂(0.43mmol/g)置于多肽固相合成仪中，DCM溶液溶胀30min后，经茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明树脂正常。
2、肽链的合成
上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去；将Fmoc-Val-OH(212mg)、HOBT(1-羟基苯并三唑81mg)、HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯228mg)、DIEA(二异丙基乙胺0.2mL)于5-10mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Val-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Trp(Boc)-OH(212mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(239mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(281mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(212mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(390mg)、Fmoc-Phe-OH(376mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(212mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(212mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(238mg)，HOBT、HBTU和DIEA用量同上。将上述得到的肽链，用含有体积分数1％TFA(三氟乙酸)的DCM(二氯甲烷)溶液脱去保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去。
3、多肽切割
将上述步骤得到的肽链以TFA、三异丙基硅烷和水体积比9.5:0.25:0.25的混合溶液为切割试剂进行切割，经冰乙醚和水萃取后，冷冻干燥，得到粗肽冻干粉。
4、纯化
将上述冷冻干燥得到的粗肽冻干粉经高纯硅胶色谱柱(SHIMADZU Inertsil ODS-SP)分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，经质谱鉴定得分子量为1703.08，质谱图见图2、图3。纯化条件为：流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，洗脱。
实验例1
抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)的抗菌活性测试
标准菌种：鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肺炎克雷伯杆菌(ATCC700603)、屎肠球菌(ATCC19434)、大肠埃希菌(ATCC25922)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)。
耐药菌株：抗多药耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)、耐碳青霉烯类大肠杆菌(CRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。活性测试方法简叙如下：
将复苏的菌液通过划线法接种于LB固体培养基上，于37℃过夜。然后将平板上的菌落用生理盐水稀释至108CFU/mL，再用MHB培养基稀释至105CFU/mL。添加100μl含有不同抗菌肽浓度的菌液(256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL)至96孔板中，在37℃孵育24h后用酶标仪测定各孔在600nm处的吸光度。(阳性对照必须为药物而不是水，所以要就不要提)测定MIC之后，吸出未有菌液生长的孔中的液体涂布于LB固体培养基中，37℃过夜，未有细菌生长的最低浓度即为最小杀菌浓度。实验重复三次。
表1抗菌肽11pep及D-11pep的抗菌活性
结果如表1所示，抗菌肽11pep及D-11pep对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌均有很强的抗菌活性。
实验例2抗菌肽的时间-杀菌曲线测试
将复苏的菌液通过划线法接种于LB固体培养基上，于37℃过夜。然后将平板上的菌落用生理盐水稀释至108CFU/mL，再用LB培养基稀释至105CFU/mL。将抗菌肽与菌液混合得到含有1/2MIC、1MIC、2MIC抗菌肽浓度的混合液。每2h测定一次OD600，共测定12h。
结果如图4、图5所示，可以看出，抗菌肽11pep为浓度依赖性，而D-11pep为时间依赖性。且1MIC均可以在12h内达到杀菌线。
实验例3抗菌肽的稳定性测试
1、酶稳定性
将连续稀释的抗菌肽溶液与胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K混合，使酶的终浓度为1mg/ml，在37℃水浴1h，再用60℃水浴灭活蛋白酶，按照上述例2方法测抗菌肽对耐碳青霉烯类大肠杆菌(CRE)的MIC方法，其中对照组是未被处理的抗菌肽，实验重复3次。
表2酶稳定性
1)盐稳定性
将连续稀释的抗菌肽与不同的盐离子溶液(150mM NaCl、6mM NH4Cl、2.5mM CaCl2、1mM MgCl2、4mM FeCl3、2.5mM BaCl2)混合，在37℃水浴30min，按照上述例2方法测抗菌肽对耐碳青霉烯类大肠杆菌(CRE)的MIC方法，其中对照组是未被处理的抗菌肽，实验重复3次。
表3盐稳定性
2)热稳定性
将抗菌肽分别置于0℃冰水混合物、37℃、100℃水浴30min，按照上述方法测抗菌肽对耐碳青霉烯类大肠杆菌(CRE)的MIC方法，其中对照组是未被处理的抗菌肽，实验重复3次。
表4热稳定性
3)pH值稳定性
将抗菌肽分别在pH是4、6、8、10的条件下处理30min，按照上述材料2测抗菌肽对耐碳青霉烯类大肠杆菌(CRE)的MIC方法，其中对照组是未被处理的抗菌肽，实验重复3次。
表5 pH稳定性
以上结果说明抗菌肽11pep与D-11pep具有蛋白酶、盐离子、pH值和温度稳定性，在食品保鲜、饲料添加等方面具有重要意义。
实验例4抗菌肽的体外溶血活性测试
选取无菌绵羊血细胞，4℃，3000r/min，离心10min，弃上清，用生理盐水重悬，以上操作重复三次，最后重悬为3％的红细胞悬液。加100μL不同浓度的肽溶液于EP管中，各管中肽溶液的终浓度(μg/mL)分别为：256、128、64、32、16、8、4，加100μL的红细胞悬液。每组设置三个平行组。阴性对照组加入等体积的PBS，阳性对照组加入100μL的0.1％Triton-X100。将反应液置生化培养箱内37℃培养0.5h，取出，3000转/分钟离心10min，吸取100μL的上清液转移至96孔板，用酶标仪测570nm波长的吸光度。实验重复三次，所得数据取平均值。
溶血活性＝(OD样本-ODPBS）/（ODT-ODPBS)×100％
其中OD样本为实验组数据，ODPBS为阴性对照数据，ODT为阳性对照0.1％Triton-X100数据。
图6、图7为溶血毒性实验结果，我们可以看到两个抗菌肽的细胞毒性都非常低，说明线性结构的抗菌肽是非常安全的，有极高的成药性。
实验例5抗菌肽的毒性测试
采用MTT法测定，使用MTT细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒
(E606334-0500，上海生工生物工程有限公司)，评估抗菌肽对细胞的毒性作用。细胞株使用人正常肺上皮细胞(BEAS-2B细胞ATCC CRL-9609)。将从液氮罐取出的BEAS-2B细胞放37℃水中融化，接种于含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的5mL的DMEM细胞培养液中，放置于恒温37℃、5％CO2的培养箱内，当细胞密度达到80％以上，将培养液弃掉，然后用无菌PBS缓冲液清洗2次，加入1mL的0.2％的胰酶进行消化，当在倒置显微镜下观察到细胞变圆且间隙变大，立即弃去胰酶，加入1mL的完全培养基中和胰酶，弃掉后再加入4mL含有胎牛血清的完全培养基，慢慢吹打混匀，制成单个细胞悬液。经过细胞计数统计，向96孔板内加入90μL细胞悬液，使终浓度是2×104个/孔。
将多肽稀释成不同浓度(终浓度梯度如MIC测定一样)，加入到已加入细胞悬液的96孔板中。第10孔为阳性对照：加入100μL单细胞悬液；第11孔为阴性对照：加入100μL细胞培养液，放置于恒温37℃、5％CO2培养箱。培养6h后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT试剂，再放入培养箱孵育4h后取出，利用酶标仪在OD＝450nm处检测吸光值。此实验重复3次。
细胞活性＝(ODt-OD培养液)/(ODo-OD培养液)×100％
其中ODt为实验组数据，OD培养液为阴性对照数据，ODc为对照组数据。
结果如图8、图9所示。与对照组相比，抗菌肽11pep与D-11pep的细胞活性均保持在60％以上，且在MIC范围内均未显示出明显的细胞毒性，可说明本发明提供的抗菌肽对细胞无毒，且对细胞增殖及细胞活性无消极作用，不会对正常细胞产生毒性威胁，进而可以作为生物抗菌肽深入研究和开发。
本发明不局限于上述实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列为：
11pep:V-W-R-K-W-R-R-F-W-K-R-NH2；
或与11pep的序列相反的D型氨基酸D-11pep:R(D)-K(D)-W(D)-F(D)-R(D)-R(D)-W(D)-K(D)-R(D)-W(D)-V(D)-NH2，其中-NH2表示肽序列的氮端。
2.权利要求1所述抗菌肽在防腐保鲜剂中的应用。
3.权利要求1所述抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用，所述细菌为抗多药耐药鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌、耐碳青霉烯类大肠埃希菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
4.根据权利要求3所述抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用，其特征在于：所述细菌为标准菌株鲍曼不动杆菌ATCC19606、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、肺炎克雷伯杆菌ATCC700603、屎肠球菌ATCC19434、大肠埃希菌ATCC25922以及阴沟肠杆菌ATCC13047。
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| CN115746094A (zh) | 2023-03-07 |
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