CN117024552A - 小分子抗菌多肽、制备方法及其用途 - Google Patents

小分子抗菌多肽、制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗菌药物技术领域，特别涉及小分子抗菌多肽、制备方法及其用途。本发明提供的抗菌肽相较于其他大多数衍生多肽以及现有报道中公开的抗菌多肽具有更强的抑菌活性。使用已知具有耐药性的多种菌株开展杀菌活性评价，结果显示，本发明提供的抗菌肽对耐药菌株具有广谱抑菌活性，抑菌效果更全面，适应症更广泛。

Description

小分子抗菌多肽、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及抗菌药物技术领域，特别涉及小分子抗菌多肽、制备方法及其用途。
背景技术
近几十年来，随着抗生素的频繁和不规范使用，导致细菌耐药性问题成为公共安全危机。根据美国疾病控制与预防中心(CDC)的最新调查，抗生素耐药性每年导致全球数百万人患病，预计到2050年，因抗生素耐药性导致的死亡人数将达到上千万。因此，开发新型抗菌药物已成为抗感染治疗的当务之急。
抗菌肽(AMPs)作为有前景的抗多重耐药菌的抗菌药物已显示出前所未有的优势。与干扰病原微生物代谢过程的抗生素不同，AMPs通常通过物理破坏微生物细胞膜脂质和诱导细胞内容物泄漏来产生抗微生物作用，因此它们对细菌耐药性进化概率的影响很小。目前，由于其强大的抗菌潜力和独特的作用机制，AMPs被认为是替代抗生素的理想候选者。
金环蛇抗菌肽Cathelicidin是一个具有多功能的抗菌肽家族，具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。金环蛇抗菌肽(BF30)是2008年中科院昆明动物所赖仞等从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽，经人工合成得到的含30个氨基酸的单一多肽药物，是金环蛇Cathelicidin基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有30个氨基酸残基，分子量3636.24Da。
鉴于金环蛇抗菌肽具有高活性，不易产生耐药性、作用广谱等特点，已成为新型抗感染药物筛选的非常优良先导分子，但金环蛇抗菌肽BF30序列较复杂，合成成本高，并且抗菌活性仍有待提高。
发明内容
本发明以提高金环蛇抗菌肽活性，降低金环蛇抗菌肽合成成本为目的，对金环蛇抗菌肽的氨基酸序列和结构进行改造和优化，得到具有广谱高活性的突变抗菌肽，并提供了该突变抗菌肽的制备方法及用途。
本发明第一方面提供一种抗菌肽，所述抗菌肽具有氨基酸序列X1KRFKKFX2X3KLKKWV，其中X1选自非极性侧链氨基酸，X2选自具有芳香族侧链的氨基酸，X3选自具有芳香族侧链的氨基酸或者具有碱性侧链的氨基酸。
在可选的实施方式中，所述X1选自缬氨酸或异亮氨酸，所述X2选自苯丙氨酸或色氨酸，所述X3选自苯丙氨酸、色氨酸或精氨酸。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽具有SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽N端含有修饰官能团，所述修饰官能团选自5-异恶唑-5甲酰基、乙酰基、2-(1-咪唑基)乙酰基、苯甲酰基、十碳酰基、2-吗啉乙酰基、吡嗪甲酰基、十二碳酰基、対甲苯磺酰基或2-甲基噻唑-5-甲酰基。
在可选的实施方式中，所述修饰抗菌肽中含有至少一个D型或β型氨基酸。
第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述抗菌肽的制备方法，采用固相合成或液相合成方法，将带有侧链保护基的氨基酸按照氨基酸序列依次偶联，然后依次经过脱去侧链保护基、提取和纯化，得到抗菌肽。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽的制备方法还包括对固相合成抗菌肽进行N端修饰的步骤，所述N端修饰使用的官能团选自5-异恶唑-5甲酰基、乙酰基、2-(1-咪唑基)乙酰基、苯甲酰基、十碳酰基、2-吗啉乙酰基、吡嗪甲酰基、十二碳酰基、対甲苯磺酰基或2-甲基噻唑-5-甲酰基。
在可选的实施方式中，固相合成使用的氨基酸中的至少一种为D型或β型氨基酸。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述抗菌肽或采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的抗菌肽在制备抗菌药物、防感染药物、创面修复产品、痤疮治疗药物、放射性皮炎防治药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的用途。
第四方面，本发明提供一种抗菌药物制剂，所述抗菌药物制剂含有前述实施方式任一项所述抗菌肽或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的抗菌肽。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽的有效剂量为0.01～512μg/ml，优选为0.125～256μg/ml。
在可选的实施方式中，所述抗菌作用的病原微生物种类包括细菌和/或真菌。
优选地，所述细菌包括革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；和/或，革兰氏阴性菌，例如铜绿脓杆菌(Pseudomonas aerμginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
在可选的实施方式中，所述病原微生物具有耐药性，耐受抗生素药物种类包括β-内酰胺类、头孢类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类或利福平中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述抗菌药物制剂的剂型包括口服制剂、外用制剂或注射液；所述口服制剂包括颗粒剂、片剂、糊剂或口服溶液；所述外用制剂包括软膏、凝胶、栓剂、药浴液、蹄浴液或喷剂。
本发明取得的有益效果包括：
本发明提供的抗菌肽相较于其他大多数衍生多肽以及现有报道中公开的抗菌多肽具有更强的抑菌活性。使用已知具有耐药性的多种菌株开展杀菌活性评价，结果显示，本发明提供的抗菌肽对耐药菌株具有广谱抑菌活性，抑菌效果更全面，适用场景更广泛。
进一步地，采用溶血活性对本发明提供的抗菌肽的安全性进行评估，经测定，本发明优选的抗菌肽在最高浓度256μg/ml下均未见溶血毒性，具有较高安全性。
因此，本发明提供了一种抗菌活性更强，适用范围更广，开发潜在价值更大的抗菌肽。
附图说明
图1为实施例1合成的抗菌肽WZ-2的高效液相色谱图；
图2为实施例1合成的抗菌肽WZ-2的质谱图；
图3为实施例2合成的抗菌肽Ac-WZ-2的高效液相色谱图；
图4为实施例2合成的抗菌肽Ac-WZ-2的质谱图；
图5为实施例3合成的抗菌肽WZ-4的高效液相色谱图；
图6为实施例3合成的抗菌肽WZ-4的质谱图；
图7为实施例3合成的抗菌肽Ac-WZ-4的高效液相色谱图；
图8为实施例3合成的抗菌肽Ac-WZ-4的质谱图；
图9为实施例4合成的抗菌肽WZ-16的高效液相色谱图；
图10为实施例4合成的抗菌肽WZ-16的质谱图；
图11为实施例4合成的抗菌肽Ac-WZ-16的高效液相色谱图；
图12为实施例4合成的抗菌肽Ac-WZ-16的质谱图；
图13为实施例5合成的抗菌肽WZ-21的高效液相色谱图；
图14为实施例5合成的抗菌肽WZ-21的质谱图；
图15为实施例5合成的抗菌肽Ac-WZ-21的高效液相色谱图；
图16为实施例5合成的抗菌肽Ac-WZ-21的质谱图；
图17为本发明提供的不同抗菌肽的溶血活性实验结果图；
图18为本发明提供的不同抗菌肽经乙酰基修饰后的溶血活性实验结果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本申请，下面提供相关术语的定义和解释。
还应理解，在本文所述的包括多于一个步骤或行动的某些方法中，除非上下文另外指示，否则所述方法的步骤或行动的顺序未必限于所述方法的步骤或行动被列举的顺序。
定义
如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。
如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
如本文所用，多种所述元素之间的连词术语“和/或”被理解为均包含单个选项和组合选项。例如，当两个元素由“和/或”连在一起时，第一选项指的是第一个元素的适用性，而没有第二个元素。第二个选项是指第二个元素的适用性，而没有第一个元素。第三个选项指的是第一和第二个元素一起的适用性。这些选项的任何一个都被理解为属于含义范围内，因此满足本文所用的术语“和/或”的需求。多个选项的并发适用性也被理解为术语所述含义，因此满足术语“和/或”的需求。
如本文所用，术语“抗菌肽”，还可被称作“抗菌多肽”，与“抗菌蛋白”、“抗菌蛋白质”同义，在本文中使用来指具有抗菌、抑菌或杀菌功能的氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守性修饰的变体。
如本文所用，术语“耐药性(drμg resistance)”，又称抗药性，是指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。目前认为后一种方式是产生耐药菌的主要原因。为了保持抗生素的有效性，应重视其合理使用。
如本文所用，术语“MRSA”指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，一般意义中的耐药菌株。具有广谱耐药性，对β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药(世卫组织新型抗生素研发重点病原体清单：十分重要)。
如本文所用，术语“MSSA”是甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌。
如本文所用，术语“D型氨基酸”，与L型氨基酸相对，是同一氨基酸具有不同旋光性的两种同分异构体。按费歇尔投影式，氨基在左侧是L型氨基酸，氨基在右侧为D型氨基酸，通常天然氨基酸为L型氨基酸，D型氨基酸需通过人工合成获得。
如本文所用，术语“β-氨基酸”是指氨基结合在β位碳原子上的氨基酸。唯一常见的天然存在的β-氨基酸是β-丙氨酸，虽然β-丙氨酸常常作为生物活性大分子的组成组分，但β-肽一般不出现在自然界中。正因为这个原因，β-肽类抗生素正被用于解决抗生素耐药性的问题。
如本文所用，术语序列的“保守取代”或“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)将修饰引入本文所述的序列表中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域中已有定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗MASP-2抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知。
示例性的，可以进行保守取代的氨基酸如下表1所示：
表1氨基酸保守取代示例
如本文所用，术语“有效剂量”与“有效量”同义，指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
具体实施方案详述
第一方面本发明提供一种抗菌肽，所述抗菌肽具有氨基酸序列X1KRFKKFX2X3KLKKWV，其中X1选自非极性侧链氨基酸，X2选自具有芳香族侧链的氨基酸，X3选自具有芳香族侧链的氨基酸或者具有碱性侧链的氨基酸。
在可选的实施方式中，所述X1选自缬氨酸或异亮氨酸，所述X2选自苯丙氨酸或色氨酸，所述X3选自苯丙氨酸、色氨酸或精氨酸。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽具有SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1：VKRFKKFFWKLKKWV；
SEQ ID NO.2：VKRFKKFWFKLKKWV；
SEQ ID NO.3：IKRFKKFFRKLKKWV；
SEQ ID NO.4：IKRFKKFFWKLKKWV。
其中SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1在第8位和第9位发生保守取代获得，SEQ IDNO.4为SEQ ID NO.1在第1位发生保守取代获得，SEQ ID NO.3为SEQ ID NO.4在第9位发生非保守取代获得。本发明提供的抗菌肽的核心氨基酸序列包含有15个氨基酸残基，以5个氨基酸残基为一个片段，将本发明提供的抗菌肽核心片段从N端到C端均分为前中后三个片段之后，可以看出，前端片段为无色氨酸的多肽片段。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽N端含有修饰官能团，所述修饰官能团选自5-异恶唑-5甲酰基、乙酰基、2-(1-咪唑基)乙酰基、苯甲酰基、十碳酰基、2-吗啉乙酰基、吡嗪甲酰基、十二碳酰基、対甲苯磺酰基或2-甲基噻唑-5-甲酰基。
上述修饰官能团为以提高抗菌肽的抑菌活性为目的额外添加在抗菌肽N端的修饰官能团，可以理解的是，其他常规的能够用来提高抗菌肽活性的修饰基团也应当理解为本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述修饰抗菌肽中含有至少一个D型氨基酸或β型氨基酸。
第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述抗菌肽的制备方法，采用固相合成或液相合成方法，将带有侧链保护基的氨基酸按照氨基酸序列依次偶联，然后依次经过脱去侧链保护基、提取和纯化，得到抗菌肽。
可以理解的是，多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程。其中固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成，能够大大减轻每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的，羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略，逐步合成简洁迅速，被用于各种生物活性多肽片段的合成；片段组合法为合成含100个以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路线，并已成功地合成了多种有生物活性的多肽，其最大的特点是易于纯制。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽的制备方法还包括对固相合成抗菌肽进行N端修饰的步骤，所述N端修饰使用的官能团选自5-异恶唑-5甲酰基(Ez)、乙酰基(Ac)、2-(1-咪唑基)乙酰基(Mz)、苯甲酰基(Bz)、十碳酰基(Dec)、2-吗啉乙酰基(Ml)、吡嗪甲酰基(Pz)、十二碳酰基(Dodec)、対甲苯磺酰基(Ts)或2-甲基噻唑-5-甲酰基(Sz)，各官能团结构式如下所示：
在可选的实施方式中，固相合成使用的氨基酸中的至少一种为D型氨基酸或β型氨基酸。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述抗菌肽或采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的抗菌肽在制备抗菌药物、防感染药物、创面修复产品、痤疮治疗药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的用途。
第四方面，本发明提供一种抗菌药物制剂，所述抗菌药物制剂含有前述实施方式任一项所述抗菌肽或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的抗菌肽。
在可选的实施方式中，所述抗菌肽的有效剂量为0.01～512μg/ml，优选为0.125～256μg/ml。
在可选的实施方式中，所述抗菌作用的病原微生物种类包括细菌和/或真菌。
在可选的实施方式中，所述细菌包括革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；和/或，革兰氏阴性菌，例如铜绿脓杆菌(Pseudomonas aerμginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
在可选的实施方式中，所述病原微生物具有耐药性，耐受抗生素药物种类包括β-内酰胺类、头孢类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类或利福平中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述抗菌药物制剂的剂型包括口服制剂、外用制剂或注射液；所述口服制剂包括颗粒剂、片剂、糊剂或口服溶液；所述外用制剂包括软膏、凝胶、栓剂、药浴液、蹄浴液或喷剂。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中，检测的方法可以是本领域常规的检测抗菌多肽、抗菌蛋白质的方法，包括但不限于MIC测定，MBC测定，产量检测，纯度检测以及溶血活性评价。
示例性的：
MIC测定方法如下：
(1)CAMHB培养基的制备：称取22.5g CAMHB培养基粉末(深圳海博生物技术有限公司，货号：HB6231-1)，加入蒸馏水1000mL，灭菌后待用；CAMHB培养基中含有牛肉浸粉和酸水解酪蛋白，能够提供细菌生长所需的氮源、维生素和其它生长因子；含有的可溶性淀粉为细菌提供碳源和能量；含有的氯化钙可调节pH，同时是某些酶的激活剂，常用于临床样本或其他样品中需氧微生物快速增菌培养，本发明用于抗菌肽MIC测定，作为其替代培养基还可以选择用MHB培养基或LB培养基等。
(2)工器具的灭菌：将配置好的CAMHB培养基、0.9％(w/v)NaCl、枪头、离心管放入高压灭菌锅中121℃，灭菌30min。枪头、离心管、试管放入干燥箱中干燥24h，96孔板在超净台上紫外杀菌30min。
(3)抑菌多肽储备液制备：将多肽样本分别以灭菌0.9％(w/v)NaCl配置成10mg/ml母液。用CAMHB培养基配制512μg/ml最大浓度，再根据体系稀释为256μg/ml,128μg/ml,64μg/ml,32μg/ml,16μg/ml,8μg/ml,4μg/ml,2μg/ml,1μg/ml,0.5μg/ml,0.25μg/ml。
(4)阳性对照药物的制备：将达托霉素(上海源叶生物科技有限公司，B27420)，BF-30(吉尔生化(上海)有限公司，纯度>99％),ZY13(吉尔生化(上海)有限公司，纯度>99％)分别以灭菌0.9％(w/v)NaCl配置母液，用CAMHB培养基配制成512μg/ml最大浓度，稀释到与药物相应浓度256μg/ml,128μg/ml,64μg/ml,32μg/ml,16μg/ml,8μg/ml,4μg/ml,2μg/ml,1μg/ml,0.5μg/ml,0.25μg/ml。
(5)菌悬液的制备：提前用LB(赛默飞生物制药(杭州)有限公司，1278005)培养基(溶菌肉汤培养基)摇革兰氏阴性菌，用TSB(赛默飞生物制药(杭州)有限公司，CM0129)培养基(胰蛋白胨大豆肉汤培养基)摇革兰氏阳性菌，220rpm，37℃，过夜培养，实验前1：1000稀释待用(体系终浓度为1：2000稀释)。
(6)具体操作步骤
第一步：准备以及试剂配制
操作台酒精擦拭，准备好提前灭菌的枪头、枪、EP管、培养皿、架子、带盖子的96孔板、药品、CAMHB培养基、0.9％(w/v)NaCl、菌液等物品，(以8mg药品为例，加入800μl 0.9％(w/v)NaCl溶解配制10mg/ml母液。取25.6μl母液加入474.4μl CAMHB培养基得到最大处理浓度512μg/ml。)
第二步：二倍稀释法加样
以96孔板的A1～12为例，在A12加200μl 512μg/ml的供试品(对照抗生素药物、本发明提供的不同抗菌肽样品等)，在A1～11分别加入100μl CAMHB培养基。取100μl A12溶液，加入A11吹打混匀，吸出100μl加入A10吹打混匀，继续此类操作直至A2，A2吹打混匀后，吸出100μl丢弃。保证A1为空白对照不加任何药物。然后排枪加入100μl菌液。放入37℃，62％湿度的细菌培养箱培养24h。
第三步：观察判断
24h后，取出96孔板。在光源下，将板子平稳举过头顶，透光肉眼观察每孔细菌生长情况。当阴性对照孔(即不含供试品)内细菌明显生长试验才有意义。明显无菌落呈清亮CAMHB状态为该组MIC(注：也可以借助OD值判断)。当在微量培养基稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
MBC测定方法如下：
(1)TSB琼脂培养基制备：称取TSB培养基干粉30g，琼脂15g混合，加入蒸馏水1000mL，灭菌后待用。
(2)TSB琼脂平板的制备：将灭菌后的TSB培养基冷却至45℃左右，(约15～20mL)倒入培养皿，盖上皿盖，轻轻摇匀，等待平板冷却凝固(大约需5～10min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
(3)将MIC及之后2倍，4倍MIC直至最大浓度孔菌液吹打混匀各吸出100μl于提前做好对应标记的TSB琼脂培养板上，盖上盖子，轻轻将培养皿前后摇晃直至菌液铺满平板。放置细菌培养箱过夜培养。第二天取出观察每块平板上生长的菌落数<0.1％的接种菌量相应培养基管中的最低药物浓度，即是药物的最低杀菌浓度(MBC)。
溶血活性评价方法如下：
取健康家兔血液(也可采用食蟹猴或人血液)，放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％(w/v)氯化钠溶液约10倍量，摇匀，每分钟1000～1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％(w/v)氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％(w/v)氯化钠溶液制成2％(w/v)的混悬液，供试验用。添加100μL加入圆底96孔聚苯乙烯微量板中。每孔加入100μL起始浓度为256μg/mL的待测样品连续两倍梯度稀释。以1％(w/v)triton为阳性对照，DMSO为阴性对照。之后将混合物在37℃下以60rpm摇床振荡孵育1h。孵育结束后，1000×g离心3min，每孔100μL上清液转入新的96孔板中。如试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，或上清液虽有色澄明，则表明无溶血发生。另外，也可在A450nm下测定吸光度来判断。
本发明使用菌株如下：
常规菌株：大肠杆菌(E.coli)ATCC25922、粪肠球菌(E.faecalis)ATCC29212标准菌株在ATCC官方购买获取。金黄色葡萄球菌(S.aureus)SA113、金黄色葡萄球菌(S.aureus)CHS101、金黄色葡萄球菌(S.aureus)YUSA139、金黄色葡萄球菌(S.aureus)YUSA145、粪肠球菌(E.faecalis)16C166、铜绿脓杆菌(P.aeruginosa)PA2237、铜绿脓杆菌(P.aeruginosa)ATCC27853、大肠杆菌(E.coli)Eco2242、大肠杆菌(E.coli)ATCC25922、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)K2044、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)Ab2201、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)Ab2202均保藏于深圳南山人民医院感染科，保藏地址为：深圳市南山区桃园路89号，保藏编号即具体菌种编号。
耐药菌株：金黄色葡萄球菌(S.aureus)YUSA132、金黄色葡萄球菌(S.aureus)YUSA139均保藏于深圳南山人民医院感染科，保藏地址为：深圳市南山区桃园路89号，保藏编号即具体菌种编号。
实施例1：合成抗菌肽VKRFKKFFWKLKKWV(以下编号为WZ-2SEQ ID NO.1)
(1)多肽合成
在Rink Amide MBHA resin树脂(吉尔生化(上海)有限公司，49006)上，依照抗菌肽WZ-2的核心肽序列，依次偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、FmocArg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH，合成完成后，用DMF、DCM、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
(2)裂解、多肽纯化
使用裂解液对步骤(1)所得肽树脂用裂解液进行裂解，所述裂解液含有TFA(三氟乙酸，CAS#:76-05-1，供应商：上海麦克林生化科技有限公司)、TIS(三异丙基硅烷，CAS#：6485-79-6，供应商：上海麦克林生化科技有限公司)、EDT(2,2′-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇，CAS#：14970-87-7，供应商：上海麦克林生化科技有限公司)和H2O的体积比为91:3:3:3。而后滤掉树脂，树脂用少量TFA洗涤，合并滤液，加入到无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥得到WZ-2粗肽，用HPLC(纯化条件如下)对所得粗肽进行纯化，即得WZ-2精肽，MS检测条件如下，检测结果如图2所示，成功合成抗菌肽WZ-2。
HPLC条件：
MS条件：
Instrument Agilgent-6125B
Probe: ESI Probe bias: +4.5kV
Nebulizer Gas Flow 1.5L/min Detector: 1.5kv
CDL: -20.0v T.flow： 0.2ml/min
CDL Temp： 250℃ B.conc.： 50％H2O/50％ACN
Block Temp： 200℃
实施例2：合成N端乙酰基修饰的抗菌肽VKRFKKFFWKLKKWV(以下编号为Ac-WZ-2)
在Rink Amide MBHA resin树脂(吉尔生化(上海)有限公司，49006)上，依照抗菌肽WZ-2的核心肽序列，依次偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH，合成完成后，添加醋酸酐，吡啶做乙酰化修饰，之后用DMF、DCM、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。纯化和检测步骤与实施例1相同，HPLC和MS检测结果分别如图3和图4所示，成功合成乙酰基修饰的抗菌肽Ac-WZ-2，纯度为98.3％。
实施例3：合成抗菌肽WZ-4和Ac-WZ-4(SEQ ID NO.2)
分别参考实施例1和实施例2合成抗菌肽VKRFKKFWFKLKKWV，命名为WZ-4和N端乙酰基修饰的抗菌肽VKRFKKFWFKLKKWV，命名为Ac-WZ-4，WZ-4的HPLC和MS检测结果分别如图5和图6所示。Ac-WZ-4的HPLC和MS检测结果分别如图7和图8所示。制备得到的WZ-4的纯度为98.4％，Ac-WZ-4的纯度为98.3％。
实施例4：合成抗菌肽WZ-16和Ac-WZ-16(SEQ ID NO.3)
分别参考实施例1和实施例2合成抗菌肽IKRFKKFFRKLKKWV，命名为WZ-16和N端乙酰基修饰的抗菌肽IKRFKKFFRKLKKWV，命名为Ac-WZ-16，WZ-16的HPLC和MS检测结果分别如图9和图10所示。Ac-WZ-16的HPLC和MS检测结果分别如图11和图12所示。制备得到的WZ-16的纯度为98.7％，Ac-WZ-16的纯度为98.4％。
实施例5：合成抗菌肽WZ-21和Ac-WZ-21(SEQ ID NO.4)
分别参考实施例1和实施例2合成抗菌肽IKRFKKFFWKLKKWV，命名为WZ-21和N端乙酰基修饰的抗菌肽IKRFKKFFWKLKKWV，命名为Ac-WZ-21，WZ-21的HPLC和MS检测结果分别如图13和图14所示。Ac-WZ-21的HPLC和MS检测结果分别如图15和图16所示。制备得到的WZ-21的纯度为98.7％，Ac-WZ-21的纯度为98.8％。
实施例6：不同抗菌肽抑菌活性对比
本实施例比较了抗菌肽WZ-2和专利CN103275190A中公开的抗菌肽ZY-13的抗菌性能，证明了实施例1提供的抗菌肽具有更优的抗菌活性。
表2 WZ-2和ZY13对不同病原菌抗菌性能对比
表3 WZ-2和ZY-13对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的抑菌效果对比
表4 WZ-2和ZY-13对耐甲氧西林鲍曼不动杆菌和甲氧西林敏感的鲍曼不动杆菌的抑菌效果对比
表5 WZ-2和ZY-13对耐甲氧西林肺炎克雷伯氏菌和甲氧西林敏感的肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果对比
表6 WZ-2和ZY-13对耐甲氧西林大肠杆菌和甲氧西林敏感的大肠杆菌的抑菌效果对比
表7 WZ-2和ZY-13对耐甲氧西林铜绿脓杆菌和甲氧西林敏感的铜绿脓杆菌的抑菌效果对比
由上表2～7可以看出，WZ2对多种病原菌标准株的抗菌、杀菌活性与ZY13相当或更优。另外，从系统的金葡菌的抑菌活性数据上看，不论是对甲氧西林敏感(MSSA)还是耐药的金葡菌(MRSA)，WZ2均优于阳性药ZY13(表3)。对于其他多种源自临床其他菌株的活性，抗菌肽WZ2对于鲍曼不动杆菌(表4)、肺炎克雷伯氏菌(表5)、大肠杆菌(表6)，铜绿脓杆菌(表7)的抑菌活性均整体优于ZY13。
实施例7
本实施例参考实施例1的合成方法，合成多种不同氨基酸序列的抗菌肽，并比较了这些抗菌肽和实施例1、3～5得到的抗菌肽的理化参数及抗菌活性，并与CN103275190A中公开的抗菌肽ZY-13、专利WO2016201972A1中公开的抗菌肽ZY-4、BF-30(2018年拿到IND，用于细菌性阴道炎治疗，泡腾片)、氨苄青霉(Ampicillin)、万古霉(Vancomycin)和庆大霉(Gentamicin)的抗菌性能进行对比，证明了实施例1、3～5提供的抗菌肽具有更优的抗菌活性。
表8不同抗菌肽氨基酸序列及理化参数对比
序号 ID peptides PI # Net Charge H HM
1 WZ-2 VKRFKKFFWKLKKWV-NH2 11.4 15 7 0.471 0.64
2 WZ-4 VKRFKKFWFKLKKWV-NH2 11.4 15 7 0.471 0.687
3 WZ-15 VKRFKKFFRKLKKSV-NH2 12.1 15 8 0.101 0.78
4 WZ-16 IKRFKKFFRKLKKWV-NH2 12.1 15 8 0.292 0.836
5 WZ-17 IKRFKKFRWKLKKWV-NH2 12.1 15 8 0.323 0.528
6 WZ-18 IKRFKKFKWKLKKWI-NH2 11.5 15 8 0.363 0.562
7 WZ-21 IKRFKKFFWKLKKWV-NH2 11.4 15 7 0.509 0.659
表9不同抗菌肽抑菌活性对比
由上表8和表9可以看出，实施例1、3～5提供的抗菌肽相对于其他具有相似氨基酸序列的抗菌肽、已见报道的三种抗菌肽和三种抗生素相比，均具有更优的抗菌活性。
实施例8
本实施例参考实施例7合成的多种抗菌肽的氨基酸序列，结合实施例2的合成方法，在这些抗菌肽的N端引入乙酰基修饰，而后比较其与两个临床候选药PL-5(CAS#:850761-47-6，正处于临床II-III期，用于糖尿病足溃疡，喷雾剂)和PL-18(专利CN102219831B，用于细菌性/真菌性阴道炎治疗，栓剂)的杀菌活性，证明了本发明提供的N端修饰的抗菌肽具有更优的抗菌活性(如表10所示)。
表10乙酰基修饰的不同抗菌肽抑菌活性对比
此外，本实施例还将N端修饰的乙酰基替换为其他修饰官能团，或者全部以D型氨基酸合成抗菌肽，所得抗菌肽均具有与乙酰基相当或者更优的抑菌活性(如表11所示)。
表11不同官能团修饰的抗菌肽抑菌活性对比
实施例9：溶血活性评价
按照上述溶血活性评价方法对上述实施例得到的抗菌肽WZ-2、WZ-4、WZ-16、WZ-21、Ac-WZ-2、AC-WZ-4、Ac-WZ-16、Ac-WZ-21、ZY-13和BF-30进行溶血活性实验，结果如图17、图18所示，可以看出，本发明提供的抗菌肽WZ-2、WZ-4、WZ-16、WZ-21、Ac-WZ-2、AC-WZ-4、Ac-WZ-16和Ac-WZ-21在最高浓度256μg/ml下均未见溶血毒性，证明上述实施例提供的抗菌肽均为安全有效的。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有氨基酸序列X1KRFKKFX2X3KLKKWV，其中X1选自非极性侧链氨基酸，X2选自具有芳香族侧链的氨基酸，X3选自具有芳香族侧链的氨基酸或者具有碱性侧链的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述X1选自缬氨酸或异亮氨酸，所述X2选自苯丙氨酸或色氨酸，所述X3选自苯丙氨酸、色氨酸或精氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽N端含有修饰官能团，所述修饰官能团选自5-异恶唑-5甲酰基、乙酰基、2-(1-咪唑基)乙酰基、苯甲酰基、十碳酰基、2-吗啉乙酰基、吡嗪甲酰基、十二碳酰基、対甲苯磺酰基或2-甲基噻唑-5-甲酰基。
5.根据权利要求4所述的抗菌肽，其特征在于，所述修饰抗菌肽中含有至少一个D型或β型氨基酸。
6.权利要求1～3任一项所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，采用固相合成或液相合成方法，将带有侧链保护基的氨基酸按照氨基酸序列依次偶联，然后依次经过脱去侧链保护基、提取和纯化，得到抗菌肽。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括对固相合成抗菌肽进行N端修饰的步骤，所述N端修饰使用的官能团选自5-异恶唑-5甲酰基、乙酰基、2-(1-咪唑基)乙酰基、苯甲酰基、十碳酰基、2-吗啉乙酰基、吡嗪甲酰基、十二碳酰基、対甲苯磺酰基或2-甲基噻唑-5-甲酰基。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，固相合成使用的氨基酸中的至少一种为D型或β型氨基酸。
9.权利要求1～5任一项所述抗菌肽或采用权利要求6～8任一项所述制备方法得到的抗菌肽在制备抗菌药物、防感染药物、创面修复产品、痤疮治疗药物、放射性皮炎防治药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的用途。
10.抗菌药物制剂，其特征在于，所述抗菌药物制剂含有权利要求1～5任一项所述抗菌肽或采用权利要求6～8任一项所述制备方法制备得到的抗菌肽。
11.根据权利要求10所述的抗菌药物制剂，其特征在于，所述抗菌肽的有效剂量为0.01～512μg/ml，优选为0.125～256μg/ml。
12.根据权利要求10或11所述的抗菌药物制剂，其特征在于，所述抗菌作用的病原微生物种类包括细菌和/或真菌；
优选地，所述细菌包括革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；和/或，革兰氏阴性菌，例如铜绿脓杆菌(Pseudomonas aerμginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
13.根据权利要求12所述抗菌药物制剂，其特征在于，所述病原微生物具有耐药性，耐受抗生素药物种类包括β-内酰胺类、头孢类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类或利福平中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的抗菌药物制剂，其特征在于，所述抗菌药物制剂的剂型包括口服制剂、外用制剂或注射液；
所述口服制剂包括颗粒剂、片剂、糊剂或口服溶液；
所述外用制剂包括软膏、凝胶、栓剂、药浴液、蹄浴液或喷剂。
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