CN116804046A - 一种环状阳离子抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract
本发明公开了一种环状阳离子抗菌肽及其应用，属于生物医药技术领域，该环状阳离子抗菌肽含有15‑20个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；其中，氨基酸序列中两个相隔三个氨基酸残基的赖氨酸残基被(S)‑2,6‑二氨基‑2‑甲基己酸残基取代，并通过取代后的(S)‑2,6‑二氨基‑2‑甲基己酸残基侧链之间的氨基交联成环形成环状阳离子抗菌肽。本发明提供的环状阳离子抗菌肽结构新颖，且易于合成；具有广谱抗菌活性，尤其对临床耐药细菌具有显著抑制效果；同时，血清蛋白酶稳定性好，可以应用于人或动物革兰氏阳性菌或阴性菌引起的感染性疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种环状阳离子抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
阳离子抗菌肽是一类具有良好抗菌活性的活性多肽，通常具有10-50个氨基酸残基，其中含有1个或多个碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸等。阳离子抗菌肽通过其阳离子电荷与细菌细胞膜上的负电荷通过静电相互作用结合，进而破坏细菌细胞膜，从而具有良好的杀菌抑菌活性。由于真核细胞细胞膜成分与细菌细胞膜成分的不同，阳离子抗菌肽通过具有较高的细胞选择性，可以通过特异性的细胞膜裂解机制达到杀菌作用。同时，由于阳离子抗菌肽的作用机制是破坏细菌细胞膜，细菌较难发展出针对阳离子抗菌肽的耐药机制，因此，阳离子抗菌肽具有优异的抗耐药性。基于阳离子抗菌肽的广谱抗菌活性及抗耐药性，其是开发新型抗生素药物的重要前体。
但是，抗菌肽在临床转化中面临着诸多限制，其中最终要的限制因素是其蛋白酶稳定性差，易在体内被体内广泛存在的蛋白水解酶降解为氨基酸从而失去活性。因此，开发新型抗菌肽修饰策略，对于改善抗菌肽的药理学性质具有重要意义。当前，针对抗菌肽的结构改造主要集中于对其序列结构进行设计、或者引入D-型氨基酸进行替换、或者引入环状交联结构。其中，引入环状交联结构形成环状抗菌肽是一种重要的方式，因为许多研究已经表明形成环状结构有助于增强多肽的稳定性。但是，目前针对抗菌肽的环化修饰策略非常有限，有待于进一步发展。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种环状阳离子抗菌肽及其制备方法和应用，本发明同时提供了该类环状阳离子抗菌肽的制备方法，本发明还提供了该类环状阳离子抗菌肽的应用。本发明提供的环状阳离子抗菌肽具有显著的广谱抗菌作用，尤其对临床耐药细菌具有很好的抑制效果，同时具有很高的血清蛋白酶降解抗性。本发明提供了该类环状阳离子抗菌肽的制备策略，通过固相合成方式，可以实现该类环状抗菌肽的快速制备。由于该类环状阳离子抗菌肽的广谱抗菌活性及优异的血清蛋白酶稳定性，其可以应用于人或动物细菌性感染疾病的预防和治疗。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种环状阳离子抗菌肽，该抗菌肽包括15-20个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。其中，氨基酸序列中的两个相隔3个氨基酸残基的赖氨酸残基被(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基取代，且通过(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基侧链之间的氨基交联成环形成环状阳离子抗菌肽。
(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基结构如下：
进一步地，抗菌肽中相隔三个氨基酸的两个(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基的侧链氨基交联成环；在交联成环时，交联基团为1,3-二亚甲基苯、1,2-二亚甲基苯、1,4-二亚甲基、(E)-1,4-二亚甲基-2-丁烯、(Z)-1,4-二亚甲基-2-丁烯基或1,4-二亚甲基-2-丁炔或其他结构类似基团。
作为本发明的一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-01具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKmKLKKmAVKKGFKKFAKV的氨基酸序列，其中第4位、第8位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-02具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKmKAVKmKGFKKFAKV的氨基酸序列，其中第7位、第11位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-03具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKmAVKKmGFKKFAKV的氨基酸序列，其中第8位、第12位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-04具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKmKGFKmKFAKV的氨基酸序列，其中第11位、第15位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-05具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-06具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,3-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-07具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,4-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-08具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过(E)-1,4-二亚甲基-2-丁烯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-09具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过(Z)-1,4-二亚甲基-2-丁烯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-10具有如下结构：
该环状抗菌肽由20个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,4-二亚甲基-2-丁炔进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-11具有如下结构：
该环状抗菌肽由19个氨基酸残基构成，具有KFFKmKLKKmWVKKGWKKFAK的氨基酸序列，其中第4位、第8位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-12具有如下结构：
该环状抗菌肽由19个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKmWVKKmGWKKFAK的氨基酸序列，其中第8位、第12位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-13具有如下结构：
该环状抗菌肽由19个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKWVKKmGWKKmFAK的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-14具有如下结构：
该环状抗菌肽由18个氨基酸残基构成，具有KFFKmKLKKmWVKKGWKKFP的氨基酸序列，其中第4位、第8位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-15具有如下结构：
该环状抗菌肽由18个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKmWVKKmGWKKFP的氨基酸序列，其中第8位、第12位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-16具有如下结构：
该环状抗菌肽由18个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKWVKKmGWKKmFP的氨基酸序列，其中第12位、第16位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-17具有如下结构：
该环状抗菌肽由17个氨基酸残基构成，具有KFFKmKLKKmWVKKGWKFP的氨基酸序列，其中第4位、第8位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-18具有如下结构：
该环状抗菌肽由17个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKmKWVKmKGWKFP的氨基酸序列，其中第7位、第11位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-19具有如下结构：
该环状抗菌肽由17个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKmWVKKmGWKFP的氨基酸序列，其中第8位、第12位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-20具有如下结构：
该环状抗菌肽由17个氨基酸残基构成，具有KFFKKLKKWVKmKGWKmFP的氨基酸序列，其中第11位、第15位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-21具有如下结构：
该环状抗菌肽由16个氨基酸残基构成，具有VFKmKLKKmWVKKGWKFP的氨基酸序列，其中第3位、第7位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-22具有如下结构：
该环状抗菌肽由16个氨基酸残基构成，具有VFKKLKmKWVKmKGWKFP的氨基酸序列，其中第6位、第10位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-23具有如下结构：
该环状抗菌肽由16个氨基酸残基构成，具有VFKKLKKmWVKKmGWKFP的氨基酸序列，其中第7位、第11位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-24具有如下结构：
该环状抗菌肽由16个氨基酸残基构成，具有VFKKLKKWVKmKGWKmFP的氨基酸序列，其中第10位、第14位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-25具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKmRFKKmFFRKFKKFV的氨基酸序列，其中第2位、第6位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-26具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKmRFKKmFFRKFKKFV的氨基酸序列，其中第2位、第6位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过(E)-1,4-二亚甲基-2-丁烯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-27具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKmRFKKmFFRKFKKFV的氨基酸序列，其中第2位、第6位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过(Z)-1,4-二亚甲基-2-丁烯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-28具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKmRFKKmFFRKFKKFV的氨基酸序列，其中第2位、第6位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,4-二亚甲基-2-丁炔进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-29具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKRFKKmFFRKmFKKFV的氨基酸序列，其中第6位、第10位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,2-二亚甲基苯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-30具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKRFKKmFFRKmFKKFV的氨基酸序列，其中第6位、第10位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过(E)-1,4-二亚甲基-2-丁烯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-31具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKRFKKmFFRKmFKKFV的氨基酸序列，其中第6位、第10位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过(Z)-1,4-二亚甲基-2-丁烯进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
作为本发明的又一种优选方案，该环状阳离子抗菌肽其中一例XLLS-32具有如下结构：
该环状抗菌肽由15个氨基酸残基构成，具有VKRFKKmFFRKmFKKFV的氨基酸序列，其中第6位、第10位为两个α-甲基取代赖氨酸残基，并且其侧链氨基之间通过1,4-二亚甲基-2-丁炔进行交联，多肽羧基端进行酰胺化。
上述环状阳离子抗菌肽的制备方法如下：
1)在固相树脂上制备目标环状阳离子抗菌肽的多肽线性前体I：通过标准的多肽固相合成方法在Rink-AM树脂上合成线性多肽前体I；
2)在固相树脂上制备目标环状阳离子抗菌肽前体II：线性多肽前体I与相应的烷基化试剂反应得到环状阳离子抗菌肽前体II；
4)在固相树脂上制备目标环状阳离子抗菌肽前体III：环状阳离子抗菌肽前体II经过脱保护得到环状阳离子抗菌肽前体III；
5)制备目标环状阳离子抗菌肽IV：将抗菌肽前体III从树脂上切割下来得到目标环状阳离子抗菌肽IV。
本发明开发了一类具有新颖结构的环状阳离子抗菌肽，并提供了该类抗菌肽的固相合成制备方法。经过活性测试，证明本发明制备的环状阳离子抗菌肽具有较高的血清稳定性及良好的广谱抗菌活性，具有潜在的药用价值，可用于治疗包括但不限于金黄色葡萄球菌、李斯特菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(含耐碳青霉烯菌)、铜绿假单胞杆菌(含耐碳青霉烯菌)、肺炎克雷伯菌(含耐碳青霉烯菌)、鲍曼不动杆菌(含耐碳青霉烯菌)等革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌引起的细菌性感染。
本发明有益效果为：
1、本发明通过在抗菌肽序列中引入具有α-甲基赖氨酸残基，并通过其侧链氨基之间进行交联，开发了一类结构新颖的环状阳离子抗菌肽。
2、本发明得到的环状阳离子抗菌肽相比于线性抗菌肽具有显著增强的抗菌活性及血清稳定性。
3、本发明得到的环状阳离子抗菌肽具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性菌及阴性菌(包括多药耐药细菌)具有优良的抗菌活性。
4、本发明得到的环状阳离子抗菌肽全部由L-型氨基酸残基组成，但具有显著增强的耐血清蛋白酶降解能力，可用于治疗体内器官、组织等细菌感染，不局限于体表细菌感染。
附图说明
图1为环状阳离子抗菌肽XLLS-01的制备流程图；
图2为阳离子抗菌肽XLLS-05在25％血清中的稳定性分析；其中，1为XLLS-05所对应的线性肽，2为XLLS-05所对应的不含α-甲基取代赖氨酸环状抗菌肽，3为本申请制备的XLLS-05环状抗菌肽，4为本申请制备的XLLS-008环状抗菌肽；
图3为阳离子抗菌肽XLLS-05的溶血毒性分析；其中，1为XLLS-05所对应的线性肽，2为XLLS-05所对应的不含α-甲基取代赖氨酸环状抗菌肽，3为本申请制备的XLLS-05环状抗菌肽，4为本申请制备的XLLS-008环状抗菌肽；
图4为阳离子抗菌肽XLLS-05的细胞毒性分析；其中，1为XLLS-05所对应的线性肽，2为XLLS-05所对应的不含α-甲基取代赖氨酸环状抗菌肽，3为本申请制备的XLLS-05环状抗菌肽，4为本申请制备的XLLS-008环状抗菌肽。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
部分物质的全称或相应的中文名称如下：
DCM:二氯甲烷
DIEA:N,N-二异丙基乙胺
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
HBTU:苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBT:1-羟基苯并三氮唑
MeOH:甲醇
THF：四氢呋喃
TBAH:四丁基氢氧化铵
DBU:1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
实施例1：环状阳离子抗菌肽XLLS-01的制备，具体过程如下，制备流程如附图1所示：
1、Rink-AM树脂的预处理
称取Rink-AM树脂(0.35mmol/g，1g，0.35mmol，1eq)于25mL的玻璃固相管中。随后，向玻璃固相管中加入15mL的DCM，静置15分钟，使树脂充分溶胀，最后通过减压抽滤除去DCM；
2、Fmoc保护基团的脱去
向固相管中加入15mL的20％(v/v)哌啶/DMF，将固相管封好后放置在摇床上振摇15min，重复2次脱保护过程。最后，依次用MeOH，DCM，DMF洗涤树脂三次，每次10mL；
3、制备线性肽XLLS-01-I
通过标准的固相合成方法将Fmoc-Val-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-α-Me-Lys(o-Ns)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-α-Me-Lys(o-Ns)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Phe-OH,Boc-Lys(Boc)-OH依次偶联至Rink-AM固相树脂上，其中，偶联条件为：氨基酸(1.05mmol，3eq)，偶联试剂HBTU(1.05mmol，3eq)、HOBT(1.05mmol，3eq)和DIEA(2.10mmol，6eq)；脱Fmoc保护基团的条件为：20％哌啶/DMF(v/v)。每步氨基酸偶联反应及脱Fmoc保护后，均使用MeOH，DCM，DMF各洗涤树脂3次，得到线性肽抗菌肽XLLS-01-I；
4、通过N-烷基化反应制备环状抗菌肽XLLS-01-II
将XLLS-01-I在DCM中溶胀10分钟，抽去DCM，加入THF(10mL),TBAH(2.1mmol,6eq)后振摇10min，再加入烷基化试剂1,2-二溴甲基苯(0.7mmol,2eq),在摇床上振摇4h后，依次用MeOH，DCM，DMF各洗涤3次得到XLLS-01-II；
5、脱o-Ns保护基团制备双环肽XLLS-01-III
将XLLS-01-II在DCM中溶胀10分钟，抽去DCM后，加入DMF(10mL)，加入2-巯基乙醇(1.75mmol,5eq)和DBU(3.5mmol,10eq)。在摇床上振摇10h后，依次用MeOH，DCM，DMF各洗涤3次得到XLLS-01-III；
6、从固相树脂上切割多肽制备环状阳离子抗菌肽XLLS-01
将XLLS-01-III置于切割试剂(TFA:TES：H2O,95：2.5：2.5，15mL)中，切割过夜。收集滤液，旋蒸除去TFA得到黄色油状粗产物，加入冷乙醚沉淀，离心，弃去乙醚，加水溶解，冻干，半制备分离纯化得到XLLS-01，纯度>95％。质谱鉴定MS m/z calcd for C130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.71。
实施例2：
环状阳离子抗菌肽XLLS-02的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-02的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKmKAVKmKGFKKFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第7位和第11位。通过分离所得XLLS-02纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.70。
实施例3：
环状阳离子抗菌肽XLLS-03的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-03的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKmAVKKmGFKKFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第8位和第12位。通过分离所得XLLS-03纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.69。
实施例4：
环状阳离子抗菌肽XLLS-04的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-04的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKmKGFKmKFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第11位和第15位。通过分离所得XLLS-04纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd forC130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.71。
实施例5：
环状阳离子抗菌肽XLLS-05的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-05的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位。通过分离所得XLLS-05纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd forC130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.69。
实施例6：
环状阳离子抗菌肽XLLS-06的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-06的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位，并且所用烷基化试剂不同，采用1,3-二溴甲基苯。通过分离所得XLLS-06纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.72。
实施例7：
环状阳离子抗菌肽XLLS-07的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-07的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位，并且所用烷基化试剂不同，采用1,4-二溴甲基苯。通过分离所得XLLS-07纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C130H215N31O20[M+4H]4+632.67，found 632.69。
实施例8：
环状阳离子抗菌肽XLLS-08的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-08的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位，并且所用烷基化试剂不同，采用(E)-1,4-二溴-2-丁烯。通过分离所得XLLS-08纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C126H213N31O20[M+4H]4+620.17，found 620.19。
实施例9：
环状阳离子抗菌肽XLLS-09的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-09的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位，并且所用烷基化试剂不同，采用(Z)-1,4-二溴-2-丁烯。通过分离所得XLLS-09纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C126H213N31O20[M+4H]4+620.17，found 620.21。
实施例10：
环状阳离子抗菌肽XLLS-10的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-10的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKAVKKmGFKKmFAKV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位，并且所用烷基化试剂不同，采用1,4-二溴-2-丁炔。通过分离所得XLLS-10纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C126H211N31O20[M+4H]4+619.66，found 619.72。
实施例11：
环状阳离子抗菌肽XLLS-11的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-11的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKmKLKKmWVKKGWKKFAK，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第4位和第8位。通过分离所得XLLS-11纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C135H212N32O19[M+4H]4+646.42，found 646.53。
实施例12：
环状阳离子抗菌肽XLLS-12的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-12的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKmWVKKmGWKKFAK，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第8位和第12位。通过分离所得XLLS-12纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C135H212N32O19[M+4H]4+646.42，found 646.56。
实施例13：
环状阳离子抗菌肽XLLS-13的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-13的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKWVKKmGWKKmFAK，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位。通过分离所得XLLS-13纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C135H212N32O19[M+4H]4+646.42，found 646.49。
实施例14：
环状阳离子抗菌肽XLLS-14的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-14的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKmKLKKmWVKKGWKKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第4位和第8位。通过分离所得XLLS-14纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C131H202N30O18[M+4H]4+620.89，found 620.93。
实施例15：
环状阳离子抗菌肽XLLS-15的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-15的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKmWVKKmGWKKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第8位和第12位。通过分离所得XLLS-15纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C131H202N30O18[M+4H]4+620.89，found 620.95。
实施例16：
环状阳离子抗菌肽XLLS-16的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-16的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKWVKKmGWKKmFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第12位和第16位。通过分离所得XLLS-16纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C131H202N30O18[M+4H]4+620.89，found 620.94。
实施例17：
环状阳离子抗菌肽XLLS-17的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-17的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKmKLKKmWVKKGWKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第4位和第8位。通过分离所得XLLS-17纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C125H190N28O17[M+4H]4+588.87，found 588.95。
实施例18：
环状阳离子抗菌肽XLLS-18的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-18的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKmKWVKmKGWKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第7位和第11位。通过分离所得XLLS-18纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C125H190N28O17[M+4H]4+588.87，found 588.92。
实施例19：
环状阳离子抗菌肽XLLS-19的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-19的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKmWVKKmGWKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第8位和第12位。通过分离所得XLLS-19纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C125H190N28O17[M+4H]4+588.87，found 588.94。
实施例20：
环状阳离子抗菌肽XLLS-20的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-20的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为KFFKKLKKWVKmKGWKmFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第11位和第15位。通过分离所得XLLS-20纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C125H190N28O17[M+4H]4+588.87，found 588.91。
实施例21：
环状阳离子抗菌肽XLLS-21的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-21的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VFKmKLKKmWVKKGWKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第3位和第7位。通过分离所得XLLS-21纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C116H180N26O15[M+4H]4+544.35，found 544.41。
实施例22：
环状阳离子抗菌肽XLLS-22的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-22的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VFKKLKmKWVKmKGWKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第6位和第10位。通过分离所得XLLS-22纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C116H180N26O15[M+4H]4+544.35，found 544.43。
实施例23：
环状阳离子抗菌肽XLLS-23的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-23的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VFKKLKKmWVKKmGWKFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第7位和第11位。通过分离所得XLLS-23纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C116H180N26O15[M+4H]4+544.35，found 544.42。
实施例24：
环状阳离子抗菌肽XLLS-24的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-24的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VFKKLKKWVKmKGWKmFP，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第10位和第14位。通过分离所得XLLS-24纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C116H180N26O15[M+4H]4+544.35，found 544.41。
实施例25：
环状阳离子抗菌肽XLLS-25的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-25的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKmRFKKmFFRKFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第2位和第6位。通过分离所得XLLS-25纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C113H176N28O15[M+4H]4+541.35，found 541.41。
实施例26：
环状阳离子抗菌肽XLLS-26的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-26的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKmRFKKmFFRKFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第2位和第6位，所用烷基化试剂为(E)-1,4-二溴-2-丁烯。通过分离所得XLLS-26纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C109H174N28O15[M+4H]4+528.84，found 528.91。
实施例27：
环状阳离子抗菌肽XLLS-27的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-27的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKmRFKKmFFRKFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第2位和第6位，所用烷基化试剂为(Z)-1,4-二溴-2-丁烯。通过分离所得XLLS-26纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C109H174N28O15[M+4H]4+528.84，found 528.88。
实施例28：
环状阳离子抗菌肽XLLS-28的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-28的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKmRFKKmFFRKFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第2位和第6位，所用烷基化试剂为1,4-二溴-2-丁炔。通过分离所得XLLS-28纯度>95％，质谱鉴定MSm/z calcd for C109H172N28O15[M+4H]4+528.34，found 528.37。
实施例29：
环状阳离子抗菌肽XLLS-29的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-29的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKRFKKmFFRKmFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第6位和第10位，所用烷基化试剂为1,2-二溴甲基苯。通过分离所得XLLS-29纯度>95％，质谱鉴定MSm/z calcd for C113H176N28O15[M+4H]4+541.35，found 541.41。
实施例30：
环状阳离子抗菌肽XLLS-30的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-30的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKRFKKmFFRKmFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第6位和第10位，所用烷基化试剂为(E)-1,4-二溴-2-丁烯。通过分离所得XLLS-30纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C109H174N28O15[M+4H]4+528.84，found 528.88。
实施例31：
环状阳离子抗菌肽XLLS-31的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-31的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKRFKKmFFRKmFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第6位和第10位，所用烷基化试剂为(Z)-1,4-二溴-2-丁烯。通过分离所得XLLS-31纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C109H174N28O15[M+4H]4+528.84，found 528.89。
实施例32：
环状阳离子抗菌肽XLLS-32的制备：环状阳离子抗菌肽XLLS-32的制备方法与XLLS-01相同，其氨基酸序列为VKRFKKmFFRKmFKKFV，α-甲基赖氨酸残基在多肽序列第6位和第10位，所用烷基化试剂为1,4-二溴-2-丁炔。通过分离所得XLLS-32纯度>95％，质谱鉴定MS m/z calcd for C109H172N28O15[M+4H]4+528.34，found 528.38。
实施例33环状阳离子抗菌肽的抗菌活性测定
取一定量的TSB液体培养基于培养皿中，将培养至对数期的细菌稀释至1-5×105CFU/mL。向96孔板第一排每孔加菌液180μL，药液20μL(药液起始浓度1.28mg/mL)每个样品设3复孔。以TSB培养基为阴性对照，后面2倍稀释，使最终浓度成倍比下降，37℃孵育16-20h，随后综合观察96孔板中每孔溶液的澄清透明情况和在多功能酶标仪波长为490nm下每孔的吸光度值来确定环状抗菌肽的最小抑菌浓度。
本申请所列举的部分环状阳离子抗菌肽针对一系列革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性如表1所示，所使用细菌菌株包括四种革兰氏阳性菌包括LM(李斯特菌)，SA(金黄色葡萄球菌)，MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)，MDR-EF(多药耐药性屎肠球菌)，五种革兰氏阴性菌包括EC(大肠杆菌)，PA(铜绿假单胞杆菌)，MDR-EC(多药耐药性大肠杆菌)，MDR-KP(多药耐药性肺炎克雷伯菌)，MDR-AB(多药耐药性鲍曼不动杆菌)，其中多药耐药菌株均来自于临床分离样本，对多种传统抗生素(包括碳青霉烯类抗生素)具有耐药作用。由表1可见，本申请制备得到的环状阳离子抗菌肽具有广谱高效的抗菌活性，包括对多株耐药性菌株也具有良好的抗菌活性，有望作为广谱抗菌药物应用于临床治疗细菌性感染。
表1.环状阳离子抗菌肽的抗菌活性
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实施例34环状阳离子抗菌肽的血清稳定性检测
将环状阳离子抗菌肽XLLS-05(1.28mg/mL)与25％的人血清(v/v)37℃下孵育。在不同的时间点(0,0.5h,1h,1.5h,3h,5h,7h,12h和24h)取120μL混合液,加入240μL含12％三氯乙酸的溶液(水:乙腈＝1:3)沉淀蛋白，随后将其放置于4℃冰箱静置30min。以14000rpm/min的转速离心10分钟使沉淀的蛋白与溶液分离，取35μL的上清液通过HPLC定量分析与血清共孵育后多肽的浓度变化。
实验结果如图2所示：在图2中，1为对应的线性肽，2为对应的不含有α-甲基取代赖氨酸的环状抗菌肽，3为环状阳离子抗菌肽XLLS-05，4为环状阳离子抗菌肽XLLS-08。通过分析发现，环状阳离子抗菌肽XLLS-05在25％人血清中的半衰期>24h，明显高于其对应的线性肽及其所对应的不含α-甲基取代赖氨酸的环状抗菌肽，表明其具有优异的血清稳定性。环状阳离子抗菌肽XLLS-08在25％人血清中的半衰期约为12h，稳定性也明显高于线性肽。
实施例35环状阳离子抗菌肽的生物安全性检测
为考察本发明环状阳离子抗菌肽的生物安全性，通过溶血毒性实验和细胞毒性实验来对其初步评价，如图3及图4所示。本实验通过检测环状抗菌肽对人血红细胞的破坏程度(即血红蛋白的泄漏量)来评价多肽对人血红细胞的毒性，以及用MTT法来检测其对293T细胞毒性，实验操作步骤具体如下(所涉及的试剂及材料均可通过公开渠道获得，这属于本领域的公知常识)：
1、环状阳离子抗菌肽的溶血毒性测定
(1)人红细胞的处理：取500μL加抗凝剂的人血液于50mL离心管中，加入10mL的1×PBS后用移液枪缓慢吹打混匀，以1200rpm/min的转速离心10min，弃掉上清液。重复操作3次至上清液澄清透明无黄色出现，随后加入12mL的1×PBS稀释备用。
(2)不同浓度药物的配备：将浓度为1.28mg/mL的多肽用1×PBS稀释至浓度为320μg/mL，160μg/mL，80μg/mL，40μg/mL和20μg/mL；配制0.1％Triton X-100作为阳性对照。
(3)溶血毒性测定：在96孔板中每孔加入60μL稀释后的人血红细胞液。随后将上述不同浓度的药物加入96孔板中，每个浓度重复5孔，每孔加60μL。另取5孔加60μL的0.2％Triton X-100作为阳性对照，5孔加60μL的1×PBS作为空对照。将96孔板放置于37℃培养箱中共孵育1h后，以1200rpm/min的转速离心10分钟，将各浓度组、阳性对照组和空白对照组的上清液转移至另一新的96孔板中，最后用多功能酶标仪在576nm波长下检测其的吸光值，重复实验3次。
实验结果如图3所示，环状阳离子抗菌肽XLLS-05及XLLS-08在高浓度320μg/mL下依然无显著的溶血毒性。
2、环状阳离子抗菌肽的细胞毒性测定：
(1)将293T细胞稀释至1×105个/mL,随后转入至96孔板中，每孔100μL。将96孔板放置于5％ CO2细胞培养箱中37℃条件下培养过夜至细胞贴壁。
(2)多肽与细胞共孵育：将浓度为1.28mg/mL的HT-04用DMEM培养基(含10％FBS)稀释至128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/m和8μg/mL这5种浓度备用。弃掉上述96孔板中的培养基，并向96孔板中加入不同浓度的多肽药液，每个浓度重复5孔，每孔加100μL。以不加多肽的培养基组作为阴性对照，不加多肽也不加培养基组作为空白对照。最后将96孔板放置于5％ CO2细胞培养箱中37℃条件下培养24h。
(3)MTT染色及吸光值检测：将96孔板中的培养基及多肽吸起弃掉，向96孔板中加入浓度为500μg/mL的MTT溶液，每孔100μL,并将96孔板放置于5％ CO2细胞培养箱中37℃条件下培养4h。取出96孔板，并以3800rpm/min的转速离心10分钟，弃掉上清液，再向每孔中加入100μL的DMSO，将96孔板放置在摇床上轻摇15分钟使甲瓒溶解。最后，在多功能酶标仪490nm波长下检测吸光值。重复上述实验3次。
实验结果如图4所示，环状阳离子抗菌肽XLLS-05及XLLS-08对293T细胞在高浓度>64μg/mL下具有较低的细胞毒性。
综上检测可知，本申请制备得到的环状阳离子抗菌肽具有良好的生物安全性。
最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种环状阳离子抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽包括15-20个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；其中，所述氨基酸序列中任意两个相隔三个氨基酸残基的赖氨酸残基被(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基取代，并通过取代后的(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基侧链之间的氨基交联成环形成环状阳离子抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽在交联成环时，交联基团为1,2-二亚甲基苯、1,3-二亚甲基苯、1,4-二亚甲基、(E)-1,4-二亚甲基-2-丁烯、(Z)-1,4-二亚甲基-2-丁烯或1,4-二亚甲基-2-丁炔。
3.根据权利要求1或2所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的抗菌肽序列为KFFKKLKKAVKKGFKKFAKV，其中：
第4位和第8位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第7位和第11位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第8位和第12位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第11位和第15位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第12位和第16位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
4.根据权利要求1或2所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，SEQ ID NO.2所示的抗菌肽序列为KFFKKLKKWVKKGWKKFAK，其中：
第4位和第8位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第8位和第12位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第12位和第16位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
5.根据权利要求1或2所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，SEQ ID NO.3所示的抗菌肽序列KFFKKLKKWVKKGWKKFP，其中：
第4位和第8位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第8位和第12位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第12位和第16位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
6.根据权利要求1或2所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，SEQ ID NO.4所示的抗菌肽序列KFFKKLKKWVKKGWKFP，其中：
第4位和第8位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第7位和第11位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第8位和第12位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第11位和第15位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
7.根据权利要求1或2所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，SEQ ID NO.5所示的抗菌肽序列VFKKLKKWVKKGWKFP其中：
第3位和第7位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第6位和第10位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第7位和第11位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环；
或第10位和第14位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
8.根据权利要求1或2所述的环状阳离子抗菌肽，其特征在于，SEQ ID NO.6所示的抗菌肽序列为VKRFKKFFRKFKKFV，其中：
第2位和第6位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
或第6位和第10位的两个赖氨酸残基由(S)-2,6-二氨基-2-甲基己酸残基所取代，且其侧链之间的氨基交联成环。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的环状阳离子抗菌肽，或其药学上可接受的盐，以及其在药学上可接受的载体。
10.权利要求1～8任一项所述的环状阳离子抗菌肽，或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌所引起的细菌性感染药物中的应用。
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