CN101265296A - 爬行动物cathelicidin抗菌肽及衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了来源于爬行动物的爬行动物cathelicidin抗菌肽，所述抗菌肽具有选自序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，本发明还涉及其衍生物以及其应用。爬行动物cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有抗细菌和抗真菌性质，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。它们可以应用于抗微生物感染制剂的制备，用于人和动物的治疗。
Description
技术领域
本发明提供了一种来源于爬行动物的隶属于cathelicidin抗菌肽家族的抗菌肽及其衍生物，本发明还涉及这些肽的制备及其应用，属生物医学领域。
背景技术
抗菌肽广泛地分布在两栖类、昆虫、植物和哺乳动物中。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效，正成为新一类抗生素，其研制目前受到广泛重视(Zasloff M，2002.Antimicrobial peptidesof multicellular orgabisms.Nature，415，389-395)。
Cathelicidin是主要在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族，成熟抗菌肽位于前体分子的C-末端，具有很高的变异性。Cathelicidin和防御素一样，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分。内源性抗菌肽CAP-18/LL-37是发现的人类唯一的cathelicidin家族的成员，是中性粒细胞特殊颗粒(亦称二级颗粒)中的主要蛋白质。研究表明LL-37具有广谱的抗微生物活性、结合和抑制脂多糖活性、结合内毒素、免疫调节、参与伤口的愈合和血管的发生等多种功能(Carretero et al.，2008.In vitro and in vivo wound healing-promoting activities ofhuman cathelicidin LL-37.J.Invest.Dermatol.，128：223-36.)。
目前，仅在哺乳类(＞35个)、鸟类(4个)以及鱼类(Hagfish)中发现cathelicidin抗菌肽。Hagfish中发现的3个cathelicidin抗菌肽分子的信号肽与cathelin肽段完全相同，在成熟肽的编码区由于突变而产生3种抗菌肽分子。Hagfish抗菌肽被认为是古老的Cathelicidin抗菌肽(Uzzell et al.，2003.Hagfish intestinal antimicrobial peptides are ancientcathelicidins.Peptides，24：1655-67)。
发明内容
本发明的目的是提供一种爬行动物cathelicidin抗菌肽及其衍生物，本发明还提供爬行动物cathelicidin抗菌肽及其衍生物在抗微生物中的应用。爬行动物来源的cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。可以应用于抗微生物感染制剂的制备，用于人和动物的治疗。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
一种爬行动物cathelicidin抗菌肽，所述抗菌肽具有选自序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg AlaLys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe。
衍生自上面所述的爬行动物cathelicidin抗菌肽的功能等价物，所述功能等价物符合以下序列之一：
SEQ ID NO：2 Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala
Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe；
SEQ ID NO：3 Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala
Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe；
SEQ ID NO：4 Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe
Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe；
SEQ ID NO：5 Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe
Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe；
SEQ ID NO：6 Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg；
SEQ ID NO：7 Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe；
SEQ ID NO：8 Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe。
衍生自上面所述的爬行动物cathelicidin抗菌肽的功能等价物，这些等价物可以是上面所述肽的片段或修饰物，得自翻译后加工如糖基化，或化学修饰如酰胺化、乙酰化、酰化、与脂质或糖偶联、与核苷酸偶联等，其中一个或多个氨基酸是对映异构体、非对映异构体、D构象的天然氨基酸，稀有的氨基酸尤其是羟基脯氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸和合成的氨基酸特别是鸟氨酸、正亮氨酸、环己丙氨酸和Ω氨基酸。
爬行动物来源的cathelicidin家族抗菌肽的制备方法：根据推导的爬行动物来源的cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物的氨基酸序列，用全自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
本发明提供了一组分离的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列编码本发明的抗菌肽及其衍生物。
本发明爬行动物来源的cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物也可以使用本领域技术人员熟知的方法，通过遗传工程的方法制备。
爬行动物来源的cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物作为制备抗微生物物质的应用。
在爬行动物眼镜蛇毒腺cDNA文库中发现了cathelicidin抗菌肽家族成员。其信号肽及cathelin肽段与其它cathelicidin家族的成员高度保守，而其成熟肽高度变异。眼镜蛇cathelicidin抗菌肽显示了广谱的抗菌活性。进一步对爬行动物眼镜蛇cathelicidin抗菌肽开展了突变研究，结果表明其功能等价物也具有广谱的抗菌活性。
将本发明的爬行类cathelicidin家族抗菌肽全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同cathelicidin家族成熟肽。
因此，爬行动物来源的cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用。与其它来源碱性抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。
附图说明
图1是本发明眼镜蛇cathelicidin家族抗菌肽的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的眼镜蛇cathelicidin家族抗菌肽的成熟序列。
具体实施方式
实施例1 眼镜蛇抗菌肽的基因克隆
1)眼镜蛇毒腺总RNA的提取。切下活体眼镜蛇蛇头，立即放入液氮中。4小时后取出液氮中保存的蛇头，小心剥离毒腺并置于研钵内。称重后取30mg毒腺组织于液氮中研磨至粉末状。加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCO/BRL产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4℃，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为眼镜蛇毒腺总RNA。
2)眼镜蛇毒腺mRNA的分离。采用美国Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒。取眼镜蛇毒腺总RNA 500μg溶于500μl经DEPC处理然后高压灭菌的水中，放入65℃水浴10分钟。加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠(随mRNA分离纯化试剂盒)轻轻混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次。然后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管中，加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至上述试管，则上清中为纯化的mRNA。加入1/10体积的3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30分钟，然后于4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于10μlDEPC水中。
3)眼镜蛇毒腺cDNA文库构建。采用美国GIBCO/BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒。
3.1、cDNA第一链合成(mRNA反转录)：于1.5ml试管中加入2.0μl NotI引物和7μlmRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5×第一链合成缓冲液，2μl 0.1M DTT，1μl 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反转录酶，于42℃保温1小时后放入冰浴。
3.2、cDNA第二链合成：在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl 5×第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4DNA多聚酶继续保温5分钟。
3.3、DNA的抽提和乙醇沉淀：加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净的试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。
3.4、Sal I adapter的连接：上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl 5×T4DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μl DEPC水中。
3.5、Not I酶水解：于cDNA溶液中加入5μl React 3缓冲液，4μl NotI酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μl TEN缓冲液中。
3.6、DNA分级分离：将cDNA样品过柱(试剂盒中含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA，cDNA大于300bp的组分合并，体积为200μl，加入5μl酵母tRNA，100μl7.5M乙醇胺，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN缓冲液中。
3.7、合成的cDNA连接到pSPORT 1质粒：取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl 5×T4DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT 1质粒(Not I-Sal I酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时。
3.8、大肠杆菌HB101感受态细胞的制备：挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液在540nm的OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2重悬，再以2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内备用。
3.9、连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞，冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃振荡培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿上(15cm直径)。37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％的甘油于液氮保存的所构建眼镜蛇毒腺cDNA文库大约含1.8×105个独立克隆。
4)眼镜蛇抗菌肽的基因克隆。采用cDNA文库构建质粒pSPORT 1的通用引物T7启动子序列(5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’)以及SP6启动子序列(5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’)鉴定每个克隆的插入片段大小。通过对2000多个插入片段＞400bp的克隆的随机测序，结合核酸及蛋白质的序列比较，发明人得到了一个眼镜蛇蛇毒抗菌肽编码基因，其cDNA由777个核苷酸组成，自5’端至3‘端序列为(SEQID NO：10)：
gtggagctct gtagcagaag aaccaaggat ggaagggttc ttctggaaga 50
ccttgctggt ggttggagct cttaccatca gtgggacctc ctcatttcca 100
cacaaacccc tgacctatga ggaggctgtg gaccttgcag tgagcgtgta 150
caacagcaaa tctggggaag actccctcta ccgtctcctg gaggctgtcc 200
ctgcactcaa gtgggatgct ctttctgaaa gcaatcaaga gctgaacttc 250
agcgtcaagg agacggtgtg ccagatggct gaagaacgat ccttggagga 300
atgtgacttc caggaagccg gggccgtcat gggatgcaca ggctactatt 350
tctttgggga gtcgccccca gtgctcgttc tcacctgcaa gtctgtgggt 400
aacgaagagg agcagaagca ggaggagggg aacgaggagg agaaggaggt 450
ggagaaggag gaaaaggagg aagaccagaa ggatcagccc aagagggtca 500
agagattcaa gaaatttttc aagaagctga agaacagcgt gaagaagcgt 550
gccaagaaat tcttcaagaa gccaaaggtc atcggggtca ccttcccctt 600
ctaagagagg ggctcgaaag gacgtgcggc ctccgctctc caatcccagg 650
aaaaccggca gagaaaacga tgcgggatgc tccagtccat caaatcattt 700
cccaatagga tgctctgcca gtcaatccat gaataaataa atatgcactc 750
ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 777
其编码的抗菌肽前体蛋白氨基酸序列为(SEQ ID NO：9)：
Met Glu Gly Phe Phe Trp Lys Thr Leu Leu Val Val Gly Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Gly Thr Ser Ser Phe Pro His Lys Pro Leu Thr Tyr
20 25 30
Glu Glu Ala Val Asp Leu Ala Val Ser Val Tyr Asn Ser Lys Ser
35 40 45
Gly Glu Asp Ser Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Ala Val Pro Ala Leu
50 55 60
Lys Trp Asp Ala Leu Ser Glu Ser Asn Gln Glu Leu Asn Phe Ser
65 70 75
Val Lys Glu Thr Val Cys Gln Met Ala Glu Glu Arg Ser Leu Glu
80 85 90
Glu Cys Asp Phe Gln Glu Ala Gly Ala Val Met Gly Cys Thr Gly
95 100 105
Tyr Tyr Phe Phe Gly Glu Ser Pro Pro Val Leu Val Leu Thr Cys
110 115 120
Lys Ser Val Gly Asn Glu Glu Glu Gln Lys Gln Glu Glu Gly Asn
125 130 135
Glu Glu Glu Lys Glu Val Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Asp Gln
140 145 150
Lys Asp Gln Pro Lys Arg Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys
155 160 165
Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys
170 175 180
Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe
185 190
从上述前体蛋白的序列分析，根据目前对cathelicidin抗菌肽成熟肽加工位点的知识，即成熟的抗菌肽一般都是从成对的碱性氨基酸后面加工释放出成熟肽的N-端，结合对信号肽与成熟肽间高度保守的cathelin肽段的分析，可以推论在此前体蛋白中，Val157-Phe191为眼镜蛇cathelicidin抗菌肽的成熟序列(SEQ ID NO：1)。
实施例2
1、蛇毒抗菌肽的制备：
根据编码爬行动物眼镜蛇cathelicidin抗菌肽的核酸序列推导出成熟抗菌肽的氨基酸序列，衍生物的氨基酸序列以该成熟抗菌肽为模板，结合结构模拟进行决定。分别用全自动多肽合成仪合成它们对应的全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
3、纯化的蛇毒抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，用全自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
所合成蛇毒抗菌肽的名称以及氨基酸序列如下所示：
Nn-CAMP35(SEQ ID NO：1)：
缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Val LysArg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe LysLys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe)；
Oh-CAMP35(SEQ ID NO：2)：
缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Val LysArg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe LysLys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)；
Bf-CAMP35(SEQ ID NO：3)：
缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Val Lys ArgPhe Lys Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys ProArg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)；
Nn-CAMP32(SEQ ID NO：4)：
苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu LysAsn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe ProPhe)；
Oh-CAMP32(SEQ ID NO：5)：
苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu LysAsn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)；
Sv-CAMP18(SEQ ID NO：6)：
缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸(ValLys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg)；
Nn-CAMP17(SEQ ID NO：7)：
丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Ala LysLys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe)；
Oh-CAMP17(SEQ ID NO：8)：
丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Ala LysLys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)。
实施例3
爬行动物来源cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物抑制细菌生长的作用：
抗菌活性检测，参照文献方法(Lehrer et al.，1991.Ultrasensitive assays for endogenousantimicrobial polypeptides.J.Immunol.Methods，137：167-173)，采用琼脂糖双层打孔法测定最低有效浓度MEC(Minimal Effective Concentration)。本实施例中的样品采用固相法化学合成，各合成抗菌肽的名称及其全序列氨基酸一级结构见实施例2。
底层培养基配方为：1％低熔点琼脂糖(SigmaA6013)，0.3mg/ml胰蛋白冻(Oxoid产品)溶于10mM pH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。底层培养基20ml于42℃时分别加入过夜培养对数生长期细菌(约105-106CFU)，摇匀后使其在直径76mm培养皿中均匀摊布作为底层。待凝固后，底层培养基上打3mm的圆孔，每孔加5μl不同浓度的抗菌肽水溶液。37℃孵育3小时后，在底层上覆盖一层营养琼脂(顶层培养基：1％SigmaA6013低熔点琼脂糖，0.6mg/ml Oxoid胰蛋白冻溶于10mM pH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中)，37℃继续孵育12-16小时。测量无菌生长的透明环直径。抗菌活性的计算：抗菌活性单位U＝(抗菌环的直径mm-3)×10。以抗菌肽浓度的对数值为横坐标，抗菌活性为纵坐标作回归方程，并计算能抑制细菌生长的抗菌肽的最小浓度MEC。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。
表1.蛇毒抗菌肽抑制细菌生长的作用：
由表1可见，合成的爬行动物来源cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌生长的作用，可作为抗微生物物质应用于制备抗微生物感染制剂。
序列表.SEQ
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>爬行动物cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用
<160>10
<210>1
<211>35
<212>PRT
<213>眼镜蛇(Naja naja)
<400>1
Met Glu Gly Phe Phe Trp Lys Thr Leu Leu Val Val Gly Ala Leu
-155 -150 -145
Thr Ile Ser Gly Thr Ser Ser Phe Pro His Lys Pro Leu Thr Tyr
-140 -135 -130
Glu Glu Ala Val Asp Leu Ala Val Ser Val Tyr Asn Ser Lys Ser
-125 -120 -115
Gly Glu Asp Ser Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Ala Val Pro Ala Leu
-110 -105 -100
Lys Trp Asp Ala Leu Ser Glu Ser Asn Gln Glu Leu Asn Phe Ser
-95 -90 -85
Val Lys Glu Thr val Cys Gln Met Ala Glu Glu Arg Ser Leu Glu
-80 -75 -70
Glu Cys Asp Phe Gln Glu Ala Gly Ala Val Met Gly Cys Thr Gly
-65 -60 -55
Tyr Tyr Phe Phe Gly Glu Ser Pro Pro Val Leu Val Leu Thr Cys
-50 -45 -40
Lys Ser Val Gly Asn Glu Glu Glu Gln Lys Gln Glu Glu Gly Asn
-35 -30 -25
Glu Glu Glu Lys Glu Val Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Asp Gln
-20 -15 -10
Lys Asp Gln Pro Lys Arg Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys
-5 -1 1 5
Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys
10 15 20
Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe
25 30 35
<210>2
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val
1 5 10 15
Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly
20 25 30
Val Ser Ile Pro Phe
35
<210>3
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys Ser Val
1 5 10 15
Lys Lys Arg Ala Lys Glu Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly
20 25 30
Val Ser Ile Pro Phe
35
<210>4
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg
1 5 10 15
Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe
20 25 30
Pro Phe
<210>5
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg
1 5 10 15
Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile
20 25 30
Pro Phe
<210>6
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val
1 5 10 15
Lys Lys Arg
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe
1 5 10 15
Pro Phe
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile
1 5 10 15
Pro Phe
<210>9
<211>191
<212>PRT
<213>眼镜蛇(Naja naja)
<400>9
Met Glu Gly Phe Phe Trp Lys Thr Leu Leu Val Val Gly Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Gly Thr Ser Ser Phe Pro His Lys Pro Leu Thr Tyr
20 25 30
Glu Glu Ala Val Asp Leu Ala Val Ser Val Tyr Asn Ser Lys Ser
35 40 45
Gly Glu Asp Ser Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Ala Val Pro Ala Leu
50 55 60
Lys Trp Asp Ala Leu Ser Glu Ser Asn Gln Glu Leu Asn Phe Ser
65 70 75
Val Lys Glu Thr Val Cys Gln Met Ala Glu Glu Arg Ser Leu Glu
80 85 90
Glu Cys Asp Phe Gln Glu Ala Gly Ala Val Met Gly Cys Thr Gly
95 100 105
Tyr Tyr Phe Phe Gly Glu Ser Pro Pro Val Leu Val Leu Thr Cys
110 115 120
Lys Ser Val Gly Asn Glu Glu Glu Gln Lys Gln Glu Glu Gly Asn
125 130 135
Glu Glu Glu Lys Glu Val Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Asp Gln
140 145 150
Lys Asp Gln Pro Lys Arg Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys
155 160 165
Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys
170 175 180
Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe
185 190
<210>10
<211>777
<212>DNA
<213>眼镜蛇(Naja naja)
<400>10
gtggagctct gtagcagaag aaccaaggat ggaagggttc ttctggaaga 50
ccttgctggt ggttggagct cttaccatca gtgggacctc ctcatttcca 100
cacaaacccc tgacctatga ggaggctgtg gaccttgcag tgagcgtgta 150
caacagcaaa tctggggaag actccctcta ccgtctcctg gaggctgtcc 200
ctgcactcaa gtgggatgct ctttctgaaa gcaatcaaga gctgaacttc 250
agcgtcaagg agacggtgtg ccagatggct gaagaacgat ccttggagga 300
atgtgacttc caggaagccg gggccgtcat gggatgcaca ggctactatt 350
tctttgggga gtcgccccca gtgctcgttc tcacctgcaa gtctgtgggt 400
aacgaagagg agcagaagca ggaggagggg aacgaggagg agaaggaggt 450
ggagaaggag gaaaaggagg aagaccagaa ggatcagccc aagagggtca 500
agagattcaa gaaatttttc aagaagctga agaacagcgt gaagaagcgt 550
gccaagaaat tcttcaagaa gccaaaggtc atcggggtca ccttcccctt 600
ctaagagagg ggctcgaaag gacgtgcggc ctccgctctc caatcccagg 650
aaaaccggca gagaaaacga tgcgggatgc tccagtccat caaatcattt 700
cccaatagga tgctctgcca gtcaatccat gaataaataa atatgcactc 750
ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 777
Claims (6)
1、一种爬行动物cathelicidin抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有选自序列表SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列：Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser ValLys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe。
2、衍生自权利要求1所述的爬行动物cathelicidin抗菌肽的功能等价物，其特征在于所述功能等价物符合以下序列之一：
SEQ ID NO：2 Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys
Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe；
SEQ ID NO：3 Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys
Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe；
SEQ ID NO：4 Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys
Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe；
SEQ ID NO：5 Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys
Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe；
SEQ ID NO：6 Val Lys Arg Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys
Arg；
SEQ ID NO：7 Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe；
SEQ ID NO：8 Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe。
3、如权利要求2所述的衍生自权利要求1所述的爬行动物cathelicidin抗菌肽的功能等价物，其特征在于：这些功能等价物可以是权利要求1所述肽的片段或修饰物，得自翻译后加工如糖基化，或化学修饰如酰胺化、乙酰化、酰化、与脂质或糖偶联、与核苷酸偶联等，其中一个或多个氨基酸是对映异构体、非对映异构体、D构象的天然氨基酸，稀有的氨基酸尤其是羟基脯氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸和合成的氨基酸特别是鸟氨酸、正亮氨酸、环己丙氨酸和Ω氨基酸。
4、权利要求1-3所述爬行动物cathlicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法，其特征在于：采用固相化学法合成。
5、分离或人工合成的核苷酸序列或其互补序列，其特征在于：所述核苷酸序列编码权利要求1-2所述的爬行动物cathlicidin抗菌肽。
6、权利要求1-3所述的爬行动物cathlicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽在制备抗微生物感染的药物中的应用。
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-
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