CN104072583A - 能抑制和杀灭多种耐药性细菌的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杀灭和抑制细菌特别是多种耐药性细菌的多肽，其用于杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌有显著的效果。本发明还涉及包含所定义的多肽的组合物，涉及所定义的多肽和组合物在制备药物中的用途，以及用于体外杀灭或抑制多种耐药性细菌。

Description

能抑制和杀灭多种耐药性细菌的多肽

技术领域

本发明涉及新多肽，特别是杀灭和抑制细菌的新多肽,具体是一组能抑制和杀灭多种耐药性细菌的新多肽。

背景技术

超级细菌，指由于滥用抗生素使得其抗药性越来越强的细菌，其抗药性强到现在的各种抗生素已经对其没有作用，所以给这类细菌统称超级细菌。超级细菌还特指耐甲氧苄青霉素（甲氧西林）金黄色葡萄球菌 (MRSA)，它是皮肤细菌的一种，由于一般抗生素很难杀死它，所以很难诊治。超级病菌也是一种耐药性细菌，这种超级病菌能在人身上造成浓疮和毒疱，甚至逐渐让人的肌肉坏死。更可怕的是，抗生素药物对它不起作用，病人会因为感染而引起可怕的炎症，高烧、痉挛、昏迷直到最后死亡。这种病菌的可怕之处并不在于它对人的杀伤力，而是它对普通杀菌药物——抗生素的抵抗能力，对这种病菌，人们几乎无药可用。2010年，英国媒体爆出：南亚发现新型超级病菌NDM-1，抗药性极强可全球蔓延。

由于超级细菌和超级病菌的出现，人类面临极大的威胁。因此，在现有抗生素无能为力的情况下，研发新型杀灭或者抑制抗耐药性细菌的药物，极为迫切。

发明内容

本发明的一个目的是提供杀灭和抑制细菌的新多肽,特别是能抑制和杀灭多种耐药性细菌的新多肽。

具体地，本发明涉及一组能抑制和杀灭多种耐药性细菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia), 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和/或大肠杆菌等的新多肽。

本发明的能抑制和杀灭耐药性细菌的新多肽，其由XFP-10B、XFP-11、XHP-12B、XHP-14E或XHP-24B所对应的氨基酸序列组成：

XFP-10B: KRWFKIWKRR

XFP-11: WRWWKIWKRWR

XHP-12B: WVKRIKRFLRWL

XHP-14E: KRIVKRIKDFLRWL

XHP-24B: LLKELWTKIKRARKAVLRKIKRLL。

各序列中的字母为氨基酸的缩写：

A-丙氨酸 Ala 

R-精氨酸 Arg 

D-天冬氨酸 Asp 

E-谷氨酸 Glu 

I-异亮氨酸 Ile 

L-亮氨酸 Leu 

K-赖氨酸 Lys 

F-苯丙氨酸 Phe 

T-苏氨酸 Thr 

W-色氨酸 Trp 

V-缬氨酸 Val 。

本发明所述的新多肽的生产方法，为固相合成 –Boc法。这里用的是经典的多肽固相合成法中的Boc法，其中氨基酸使用D-氨基酸，在化学修饰时使N端乙酰化，C端氨基化。Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法。用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等。

具体包括：

一、树脂合成

1)  Peptide acid Merrifield Resin and PAM Resin

2)  Peptidecarboxamide MBHA Resin

二、肽链合成

1) 氨基酸的偶联；

2) N-端Boc基团的切除；

在HF切割以前须将 N-端Boc保护基团用TFA除去。手工切割N-端Boc基团方法是用TFA/DCM比为1：1的溶液在室温条件下洗涤反应15分钟。

三、切割

1）切割前的树脂准备:所有树脂在切割前必须完全的洗净和干燥。  

特殊情况处理: 

A）His的Dnp保护基团的切割 ： 用最小体积的DMF溶胀树脂； 用20mol的苯硫酚处理1-2小时； 将树脂转移到黏结玻璃漏斗中，在用HF液体或TFMSA处理前以DMF，甲醇和冷乙醚频繁冲洗。

B）含Trp的多肽树脂的脱甲酰基： 以体积比为1：10哌啶/DMF液放入圆底烧瓶中，并在冰浴中冷却； 加入多肽树脂（1g/10ml），在00C下搅拌反应2小时； 用DMF（5倍体积）洗两次，DCM两次，MeOH两次； 用HF切割前高真空干燥上述所得树脂至少4小时。

2） HF 切割

标准HF切割法（0.2mmol）  

A）将多肽树脂，聚四氟乙烯管和净化剂混合物加入反应容器中。含Cys的多肽用HF/苯甲醚/DMS/p-苯甲硫酚（10：1：1：0.2），而不含Cys的用HF/DMS/苯甲醚（10：1：1）。  

B）将盖子旋紧，切割前在冰的纯甲醇中冷却至少5分钟。      

C）在参照生产商的说明下蒸馏10ml的HF到瓶中。因为含Arg(Tos)的多肽切割会持续2小时以上。     

D）反应最后，通过氮气流蒸发HF和DMS。     

E）用TFA从树脂上吸取出切除下的多肽。     

F）负压下过滤移走树脂，用TFA洗树脂两次。过滤筛选，加入8-10倍的冷 乙醚。有时需要蒸发大多数TFA以得到粗品的沉淀物。  

3）切割后期处理：

A）沉淀，在真空下在Hirsch漏斗中用硬滤纸过滤沉淀的肽。用冷醚冲洗沉淀物，在合适的缓冲溶液中溶解太。然后冻干 

B）离心，加入少量体积的叔丁甲醚在残留物中做底，研磨，直到得到悬浮物，那悬浮物转移到一个干净的离心管中，密闭离心，自动离心机在这过程中是必须的，将醚从管中小心的倒出，用醚重复洗涤，溶解残留物在合适的缓冲溶液里，后冻干  

C）水溶性肽，沉淀后，加水到残留物中，然后把混合物转移到分离漏斗中，少量乙醇可能会用于助容。  

D）充分摇晃堵塞的漏斗，分散堵塞物，静止让两层分离，分离下层液（水）

E）加多量水到漏斗中，重复上述的摇晃—静止—分离三次，移去上层液，然后放置于干净的烧瓶中，将混合液移到分离漏斗中  

F）加少量的新配二乙基醚，重复上述的摇晃—静止—分离二到三次，每次都把醚层移去，把水层放到分离漏斗中，收集水层到干净的烧瓶，冻干。

本发明的另一个方面是提供包含前述所定义的多肽的组合物。

该组合物可以包含一种或者多种本发明前述所定义的多肽，以及为实现组合物的功能与作用而添加的非多肽的成分，例如为了实现促进酶解的活性酶，或者是增加分散能力的表面活性剂。

该组合物，其还包含杀细菌剂。杀细菌剂可以是本领域所知的抗生素。

该组合物可包含合适的载体物质和/或传递媒介，当该组合物用作药物时，该媒介可以将本发明的新型多肽传送到希望的位点。

上述组合物可以根据本领域的已知方法制备。

本发明的第三个方面是：

提供前述所定义的多肽以及上述的组合物在制备药物中的用途，用于杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia), 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和/或大肠杆菌。

特别是在制备兽用或人用治疗或预防药物中的用途，用于杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌, 鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌。

以及用于体外杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌方面的用途。

体外杀灭或抑制的方法是将本发明的前述所定义的多肽以及上述的组合物与所述的细菌接触。

本发明的多肽以及组合物，在上述的用途应用中的剂量和使用条件可以根据本领域已知的方法来确定。

经过试验，本发明的前述所定义的多肽用于杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌有显著的效果。

附图说明

图1是多肽XFP-11杀灭肺炎克雷伯菌的效果图。 

图 2是多肽XFP-10B杀灭鲍曼不动杆菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(C)的效果图。

图 3多肽XFP-12B杀灭鲍曼不动杆菌(A)、 肺炎克雷伯菌(B)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(C)的效果图。

图 4多肽XHP-14E杀灭鲍曼不动杆菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(C)的效果图。

图 5是多肽XHP-24B杀灭鲍曼不动杆菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(C)的效果图。

具体实施方式

实施例1

最小抑菌浓度（MIC）评估，采用微量肉汤稀释法。

A、抗菌药物和培养基制备

抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。

药敏试验用抗菌药物浓度范围：根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值。

培养基：NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。接种物的制备, 用接种环挑取形态相似待检菌落3~5个，接种于4~5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2~6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。

B、MIC板制备

MIC板制备：无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。

C、接种物制备

接种物制备：将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

D、结果判断

结果判断：以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。

结果见下表。

多肽名称	鲍曼不动杆菌	肺炎克雷伯菌	大肠杆菌	耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
					XFP-10B	16  μg/ml	8   μg/ml	16  μg/ml	8   μg/ml
XFP-11	16  μg/ml	16  μg/ml	32  μg/ml	16  μg/ml
					XHP-12B	32  μg/ml	16  μg/ml	16  μg/ml	32  μg/ml
XHP-14E	8   μg/ml	16  μg/ml	16  μg/ml	16  μg/ml
					XHP-24B	16  μg/ml	32  μg/ml	8   μg/ml	16  μg/ml

本实验中使用：大肠杆菌: E.COLI 105438，鲍曼不动杆菌：AB5075，肺炎克雷伯菌：KP4640。

实施例2

最低杀菌浓度测试（MBC）

最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）：杀死99.9%（降低3个数量级）的供试微生物所需的最低药物浓度。

二倍稀释测最小杀菌浓度：就是将药物浓度依次减半（倍比稀释），比如在96孔板的某行/列做MBC，每个孔均加入10μl药液，第一个孔药液浓度是100μg/mL，第二个孔是50μg/mL，第三个25μg/mL……。操作起来就是比如第一个孔加20μl药液，从第一个孔吸取10μl药液到第二孔，加培养液10μl，混匀后，从中吸取10μl加进第三孔里，再加培养液10μl，混匀……。最低至哪个浓度，已经没有活细菌了，该浓度即为MBC。

结果见图1~5。

其中，HR---小时，μg/ml---浓度， CFU reduction %---菌落减少百分比。

本实验中使用：大肠杆菌: E.COLI 105438，鲍曼不动杆菌：AB5075，肺炎克雷伯菌：KP4640。

Claims (9)

1.能抑制和杀灭耐药性细菌的多肽，其由XFP-10B、XFP-11、XHP-12B、XHP-14E或XHP-24B所对应的氨基酸序列组成：

XFP-10B: KRWFKIWKRR；

XFP-11: WRWWKIWKRWR；

XHP-12B: WVKRIKRFLRWL；

XHP-14E: KRIVKRIKDFLRWL；

XHP-24B: LLKELWTKIKRARKAVLRKIKRLL。

2.生产如权利要求1所定义的多肽的方法，其为固相合成–Boc法。

3.包含如权利要求1所定义的多肽的组合物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于还包含杀细菌剂。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于还包含为实现杀细菌之外的功能与作用而添加的非多肽的成分。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述非多肽的成分包括：为了实现促进酶解的活性酶，或者是增加分散能力的表面活性剂，以及传送多肽到希望位点的传递媒介和/或合适的载体物质。

7.如权利要求1所定义的多肽或者如权利要求3、4、5或6所述的组合物在制备药物中的用途，用于杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌。

8.如权利要求1所定义的多肽或者如权利要求3、4、5或6所述的组合物在制备兽用或人用治疗或预防药物中的用途，用于杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌。

9.如权利要求1所定义的多肽或者如权利要求3、4、5或6所述的组合物用于体外杀灭或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌方面的用途。