CN101450966A

CN101450966A - 一种抗耐药菌的多肽及用途

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Publication number: CN101450966A
Application number: CNA2007101685256A
Authority: CN
Inventors: 李文鑫; 曹志贱; 戴潮; 吴英亮; 马一保
Original assignee: TANG KEHUANG
Current assignee: Wuhan More Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2007-11-29
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2027-11-29
Also published as: CN101450966B

Abstract

本发明公开了一种抗耐药菌的多肽及用途，通过化学合成的方法，获得蝎毒抗菌多肽，然后采用96孔板培养法测定了该蝎毒抗菌多肽对耐青霉素金黄葡萄球菌、耐青霉素表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌的最小抑制浓度和生长抑制曲线，结果表明该抗菌多肽对耐青霉素葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌具有高效的抗菌功能，其活性与万古霉素相当。多肽ABP－W1在制备治疗或预防由耐青霉素葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌等革兰氏阳性菌的药物中的应用，效果显著。本发明的抗菌多肽对耐青霉素葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌的抗菌活性高，杀菌快，方法简便，可作为抗菌药物开发。

Description

一种抗耐药菌的多肽及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种高效抗耐药菌功能的多肽。具体地说，本发明涉及一种东亚钳蝎抗菌肽对耐青霉素葡萄球菌的高效抗菌作用；也涉及一种东亚钳蝎抗菌肽对耐甲氧西林葡萄球菌的高效抗菌功能。对于抗生素敏感菌而言，其抗菌效果与青霉素相当，但不会产生耐受性。对于耐受菌而言，其抗菌效果与万古霉素相当，但没有副作用；同时涉及一种东亚钳蝎抗菌多肽对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症的药物中的用途。在预防和治疗由耐受菌引起医院感染中效果显著，可作为抗菌药物开发。

背景技术

1929年，英国细菌学家弗莱明在其实验室中发现：点青霉分泌的一种未知物质(即“青霉素”)具有强力抑菌作用。在此后几十年里，抗生素已发展成为几大系列上百个品种的重要临床药物。二十世纪初抗生素的发现堪称为医药技术发展史上重大里程碑之一。但近几年来细菌耐药现象已成为各国医疗界所面临的一严重问题。如何对付越来越普遍的耐药细菌已成为国际医学界所面临的一棘手难题。中国是世界上滥用抗生素较为严重的国家，耐药菌引起的医院感染人数，已占到住院感染患者总人数的百分之三十左右。美国《美国医学会杂志》刊登一份政府调查报告说，被称为“超级病菌”的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在美国国内正呈蔓延趋势，每年预计有超过9万人严重感染这一病菌。专家警告说，MRSA在美国每年致死的人数可能超过艾滋病。MRSA自1961年被发现后，到上世纪80年代后期就已成为全球发生率最高的医院内感染病原菌之一。全世界范围内，目前能够被证实对MRSA有效的只有万古霉素，MRSA被列为世界三大最难解决感染性疾患的第一位。然而，作为对付细菌的抗生素最后一道防线万古霉素不但有严重的副作用(如引起神经性耳聋)，而且在临床上也分离到了耐万古霉素的细菌。因此，迫切需要开发新的“抗菌物质”。

近年来寻找新的抗菌活性多肽成为了药物学家们对付细菌耐药和抗药的首选策略。抗菌活性多肽不会象常规抗生素那样容易产生细菌耐药，这无疑是天然和人工合成抗菌活性多肽研发的一个莫大的鼓励。事实上，国外越来越多的药物公司和科研机构正投入大量的人力和物力致力于抗菌活性多肽的研制。

蝎子是我国的一种传统名贵中药，2000多年前就记载了蝎子的药用史。明朝《本草纲目》更详细记载蝎主治“诸风瘾疹、中风、半身不遂、口眼歪斜、语涩、手足抽挚，小儿惊痫风搐”等多种疾病，具有抗肿瘤，杀虫，抑菌和抗菌功效，其作用主要来源于蝎尾毒腺分泌的毒液。对东亚钳蝎有实验研究表明，全蝎乙醇提取物在体外对8种表浅致病真菌均有抑制作用，尤其对裴氏着色菌、中克氏孢子丝菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌较为敏感，其抗真菌作用优于大蒜浸出液。采用现代分子生物学技术和高效分离纯化技术，从多种蝎毒中鉴定了一类小分子抗菌活性肽，这类肽是在蝎体液中经免疫诱导产生的，含3对二硫键或不含二硫键，多数带正电荷，具有影响革兰氏阳性菌膜通透性的功能。例如Possani等从蝎毒腺分离得到了一批抗菌肽，包括Scorpine、Cecropines、Hadrurin等，它们除了具有杀菌功能，还可以杀灭疟原虫。Tytgat也从蝎毒腺中分离到了几种抗菌肽Parabutoporin，Opistoporin1和Opistoporin2，对它们进行了一系列的功能研究，发现Opistoporin1和Parabutoporin这两个肽更能有效地抑制革兰氏阴性菌的生长，且它们都能抑制真菌的生长。因此，蝎毒液中蕴藏着大量的天然抗菌活性物质。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种蝎毒抗菌多肽，抗耐受菌活性高，杀菌速度快，该抗菌肽含有13个氨基酸，生产成本低，水溶性好。

本发明还涉及一种抗菌多肽在制备治疗对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症的药物中的应用，具有高效治疗功能的多肽，治疗效果好，无副作用。多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐青霉素金黄葡萄球菌、耐青霉素表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌、耐甲氧西林溶血性葡萄球菌、对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症和感染疾病的药物中的应用。在预防和治疗由耐青霉素葡萄球菌或耐等革兰氏阳性菌引起的医院感染效果显著。

为了实现上述目的，采用化学合成的方法，获得了蝎毒抗菌多肽ABP-W1，抗菌试验结果表明，抗菌多肽ABP-W1对临床分离的耐青霉素高达10000μg/ml的金黄葡萄球菌P1383和表皮葡萄球菌P1389的最小抑菌浓度MIC均为4μg/ml，抗菌效果比万古霉素(万古霉素对其最小抑菌浓度MIC均为8μg/ml)高1倍，具有高效的抗菌效果。同时，ABP-W1对临床分离的耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1381(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达5000μg/ml和400μg/ml)和耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达10000μg/ml和400μg/ml)、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达4000μg/ml和100μg/ml)和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达20000μg/ml和400μg/ml)的最小抑菌浓度MIC均为8μg/ml，抗菌效果与万古霉素相当，具有高效的抗菌功能。以耐青霉素金黄葡萄球菌P1383感染小鼠，获得典型的败血症模型小鼠，10mg/kg的ABP-W1药物可以使败血症小鼠完全康复，其疗效与70mg/kg的万古霉素疗效相当，而70mg/kg的青霉素钠几乎无疗效。抗菌多肽ABP-W1可开发成高效的抗菌药物。

本发明提供的一种蝎毒抗菌多肽。首先构建高质量东亚钳蝎毒腺组织cDNA文库，具体包括蝎毒腺总RNA的分离和mRNA纯化，cDNA的第一链和第二链合成，双链cDNA与pSPORT1载体(购自美国Invitrogen)的连接和转化，获得蝎毒腺组织cDNA文库。在构建文库的基础上，随机挑选50克隆子进行测序，序列分析发现W1克隆子为一个新的东亚钳蝎抗菌肽基因，命名为ABP-W1。一种分离的多肽基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcattggtgctgttgctagtcttctcagaaaaatttttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

ABP-W1的前体组织形式编码70个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽(23个残基)、成熟肽(13个残基)和前体肽(34个残基)。基于蝎毒素前体C末端残基的加工规则，ABP-W1末端最后的残基Phe被特异性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，本发明提供一个东亚钳蝎蝎毒抗菌肽：FIGAIARLLRKIF-NH2(SEQ ID NO：2)。

本发明提供的一种高效抗耐青霉素葡萄球菌的多肽(SEQ ID NO：2)。通过固相化学合成的办法，得到了纯度达95％以上的合成多肽ABP-W1。抗菌结果表明合成多肽ABP-W1对耐青霉素金黄葡萄球菌P1383(青霉素的最小抑菌浓度MIC高达10000μg/ml)和耐青霉素表皮葡萄球菌P1389(青霉素的最小抑菌浓度MIC高达10000μg/ml)的高效抗菌作用，其最小抑菌浓度MIC均为4μg/ml，ABP-W1抗菌效果比万古霉素(最小抑菌浓度MIC均为8μg/ml)高1倍，而比青霉素高2500倍。

本发明提供的一种高效抗耐甲氧西林葡萄球菌的多肽(SEQ ID NO：2)。合成的ABP-W1多肽对临床分离的耐甲氧西林的金黄葡萄球菌P1381(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达5000μg/ml和400μg/ml)和耐甲氧西林的金黄葡萄球菌P1386(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达10000μg/ml和400μg/ml)、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达4000μg/ml和100μg/ml)和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达20000μg/ml和400μg/ml)的最小抑菌浓度MIC均为8μg/ml，请见表1。生长抑制曲线结果表明，抗菌多肽ABP-W1对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386(图2、图3和图4)和敏感金黄葡萄球菌P969(图6、图7和图8)的生长抑制效果显著(图5和图9)。抗菌效果与万古霉素相当，具有高效的抗耐甲氧西林葡萄球菌功能。

本发明提供的一种对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症具有高效治疗功能的多肽。以耐青霉素金黄葡萄球菌P1383感染小鼠，获得典型的败血症模型小鼠，10mg/kg的ABP-W1药物可以使败血症小鼠完全康复，其疗效与70mg/kg的万古霉素疗效相当，而70mg/kg的青霉素钠几乎无疗效(请见表2)，治疗效果好，无副作用。在预防和治疗由耐青霉素葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌等革兰氏阳性菌引起的医院感染效果显著。

本发明涉及的ABP-W1抗菌多肽，只含有13个氨基酸，生产成本低，水溶性好。对于抗生素敏感菌而言，ABP-W1多肽抗菌效果与青霉素相当，但不会产生耐药性。对于耐药菌而言，ABP-W1多肽抗菌效果与万古霉素相当，但没有副作用。在预防和治疗由耐受菌引起医院感染中效果显著。该抗菌肽与现有的抗生素相比，具有高效、不产生耐药性、无副作用和杀菌速度快的优点。

附图说明

图1东亚钳蝎蝎毒抗菌肽ABP-W1基因及其氨基酸。

cDNA序列下方为推断的对应氨基序列；信号肽氨基酸以单下划线标记；成熟肽氨基酸以黑体标记；方框部分氨基酸为羧肽酶识别位点；阴影部分氨基酸为C端前体肽。

图2青霉素钠对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386的生长抑制曲线。青霉素钠盐的浓度单位为μg/ml。

图3头孢噻肟对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386的生长抑制曲线。头孢噻肟的浓度单位为μg/ml。

图4万古霉素对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386的生长抑制曲线。万古霉素的浓度单位为μg/ml。

图5抗菌多肽ABP-W1对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386的生长抑制曲线。抗菌多肽ABP-W1的浓度单位为μg/ml。

图6青霉素钠盐对敏感金黄葡萄球菌P969的生长抑制曲线。青霉素钠盐的浓度单位为μg/ml。

图7头孢噻肟对敏感金黄葡萄球菌P969的生长抑制曲线。头孢噻肟的浓度单位为μg/ml。

图8万古霉素对敏感金黄葡萄球菌P969的生长抑制曲线。万古霉素的浓度单位为μg/ml。

图9抗菌多肽ABP-W1对敏感金黄葡萄球菌P969的生长抑制曲线。抗菌多肽ABP-W1的浓度单位为μg/ml。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：一种蝎毒抗菌多肽的制备。步骤如下：A：蝎毒腺总RNA的提取(Trizol LS一步法：Trizol LS购自美Invitrogen)

①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入10ml TRIZOL reagent混匀，室温(20-25℃，以下相同)放置5分钟；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室温放置2-3分钟，4℃下12000g离心15分钟；③取水相加1倍体积异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000g离心10分钟得RNA沉淀；④沉淀用5ml75％乙醇洗涤，7500g离心5分钟；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treated water，55-60℃保温10分钟以彻底溶解RNA。整个过程参照TRlZOL(Total RNA Isolation)ReagentKit推荐方法进行。制备的蝎毒腺总RNA采用甲醛变性凝胶电泳检测其质量。得到了高质量的蝎毒腺总RNA。

B：mRNA的分离纯化

采用PolyA Tract mRNA分离系统(Promega，USA)分离和纯化mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)与mRNA3’端poly(A)尾的互补配对特性，用生物素标记Oligo(dT)，通过它与mRNA3’端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo(dT)/mRNA杂交体，最后用无RNA酶的ddH₂O将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。①样品的制备：将RNA加入到含有32μlβ-巯基乙醇的800μl的GTC中。②探针的退火：取250pM浓度Oligo(dT)5μl，加蒸馏水至50μl；加入1.6ml预热的di lution buffer(dilution buffer已加入32μlβ—巯基乙醇)，与RNA混匀，70℃温育5分钟。③磁珠的活化：取1.2ml的磁珠SA-PMPS(购自美Promega)于1.5ml的离心管中；用0.5×SSC重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS3次。④mRNA的获取：将70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟放磁架上吸附磁珠，弃上清液；2ml的0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC；加入无RNA酶的ddH₂O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心(12000g×3分钟)或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA。通过电泳和紫外测定mRNA的浓度和纯度。⑤mRNA的沉淀：将④获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，mRNA将用于cDNA的合成。

C：第一链cDNA合成

①在1.5ml Ep管中加入2μlNot I Primer-adapter和6μl mRNA(含3μgmRNA)，70℃温育10min，迅速放于冰上，离心后，加入下列成分：4μl 5X firststrand buffer；2μl 0.1M DTT；1μl 10mM dNTPs；1μl H₂O。轻轻混匀后离心，37℃放至2min；②加入5μl逆转录酶，混匀后取2μl，加1μl[α-³²P]dCTP(4μCi)(示踪管)。与上述反应组分(样品管)同时37℃温育1h，然后放入冰上终止反应；③对于示踪管，依次加入43μl 20mM EDTA和5μl酵母tRNA，混匀后，分别取两份10μl点于两张滤膜上，1份用10％ TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空气干燥后，放入1.5ml闪烁液中(为1^#样品)；另1份空气干燥后，放入1.5ml闪烁液(为2^#样品)。另30μl示踪液，加1.5μl7.5M醋酸氨(NH₄Oac)和90μl无水乙醇(-20℃)，混匀后立即14,000rpm离心20min，弃上清，加入0.5ml70％无水乙醇(-20℃)，14,000rpm离心2min，弃上清，37℃干燥10min让乙醇挥发，溶于10μl TEN溶液，加入10μl2X加样缓冲液，取10μl用于碱性凝胶电泳。用[α-³²P]dCTP标记λDNAHindIII片段作分子量标记；④混匀后室温下放置15min，加入2μl0.2M EDTA终止反应。取6μl反应液和6ml2X碱性电泳缓冲液混匀，电泳5h后，用7％ TCA浸泡20min，直至溴酚兰变黄。然后用卫生纸吸干(8h左右)，进行放射自显影；⑤对于样品管，用于第二链的合成。

D：第二链cDNA合成

①冰上在样品管中依次加入下列成分；②轻轻混匀后，16℃温育2h；③加入2μl(10units)T4DNA聚合酶，继续16℃反应5min；④转入冰上，加入10μl0.5M EDTA；⑤加入等体积(150μl)酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，彻底涡旋后，室温下14,000rpm离心5min。将水相(140μl)转入另一1.5ml Ep管；⑥加入70μl的7.5M NH₄OAc和0.5ML无水乙醇(-20℃)，涡旋后，室温下14,000rpm离心20min；⑦弃上清，加入0.5ml70％乙醇(-20℃)，同上离心2min。弃上清，37℃干燥10min。

E：双链cDNA与Sal I衔接头的连接

①用25μl灭菌水溶解实D的cDNA样品，然后按下表依次加入；②轻轻混匀，16℃反应过夜(约20h)。③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提和NH₄Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。

F：Not I消化双链cDNA

①将E的样品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混匀后，37℃温育2h；③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉淀，37℃干燥10min。④溶于70μl TEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存备用。

G：去除双链cDNA分子中的过量Sal I衔接头和酶切小片段

用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除过量Sal I衔接头和酶切小片段。①室温下悬浮树脂，然后取600μl加于离心柱中，2000rpm离心10s，去掉液体。在树脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上离心；②收集洗脱液用于连接反应。

H：双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化

①在1.5ml Ep管中依次加入下列成分；②室温下反应16h；③在②反应液中依次加入下列成分：5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M NH40ac，70μl无水乙醇(-20℃)。涡旋混匀后立即14000离心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃)洗涤，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl电击转化50μl E.coli K12 MC1061。用PCR方法鉴定文库的质量，正向引物：5’TCGACCCACGCGTCCG 3’(按SalI衔接头序列设计)；反向引物：5’GAGCGGCCGCCCT15 3’(按NotI引物-衔接头的序列设计)。

I：随机测序策略筛选cDNA文库

随机从构建好的东亚钳蝎毒腺cDNA文库中挑选50克隆子，送上海三博公司测序。序列录入软件为BioEdit v4.5.8(Tom Hall，1999)，同源性比较和信号肽切割位点预测软件分别为CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。序列分析表明克隆子W1为一个全新的抗菌肽基因，命名为ABP-W1。其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：

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ttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcattggtgctgttgctagtc

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atgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(图

1)。ABP-W1的前体组织形式编码70个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽(23个残基)、成熟肽(13个残基)和前体肽(34个残基)。基于蝎毒素前体C末端残基的加工规则，ABP-W1末端最后的残基Phe被特异性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。ABP-W1抗菌多肽氨基酸序列，一种分离的东亚钳蝎抗菌多肽序列，其序列为：FIGAIARLLRKIF-NH2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

J：化学合成蝎毒抗菌多肽ABP-W1

从东亚钳蝎毒腺中分离了一个由13氨基酸组成的多肽ABP-W1，且被酰氨化。采用固相化学合成的办法获得高纯度的ABP-W1多肽：

FIGAIARLLRKIF-NH2。

实施例2：抗菌多肽ABP-W1药物对耐青霉素葡萄球菌的最小抑菌浓度

多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐青霉素金黄葡萄球菌或青霉素表皮葡萄球菌的药物中的应用过程是：A将耐青霉素金黄葡萄球菌P1383或耐青霉素表皮葡萄球菌P1389培养到OD₆₀₀＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的ABP-W1，达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照孔加入20μl的1％BSA；B37℃培养12小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在630nM波长处的吸光值；C确定药物ABP-W1的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复试验的A和B步骤。最终确定抗菌肽ABP-W1对耐青霉素金黄葡萄球菌P1383或耐青霉素表皮葡萄球菌P1389的最低抑制浓度。同时测定抗生素药物万古霉素、青霉素钠和头孢噻肟对耐青霉素金黄葡萄球菌P1383和耐青霉素表皮葡萄球菌P1389的最小抑菌浓度。

抗菌结果表明合成多肽ABP-W1对耐青霉素金黄葡萄球菌P1383和耐青霉素表皮葡萄球菌P1389的高效抗菌作用，其最小抑菌浓度MIC均为4μg/ml，而万古霉素对它们的最小抑菌浓度MIC均为8μg/ml，ABP-W1抗菌效果比万古霉素高1倍。青霉素钠对它们的最小抑菌浓度MIC高达10000μg/ml，ABP-W1抗菌效果而比青霉素高2500倍。

实施例3：抗菌多肽ABP-W1药物对耐甲氧西林葡萄球菌的最小抑菌浓度

抗菌肽ABP-W1在制备治疗或预防耐甲氧西林葡萄球菌的药物中的应用过程是：A将耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386和P1381、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374或耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369培养到OD₆₀₀＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的ABP-W1，达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照孔加入20μl的1％BSA；B37℃培养12小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在630nM波长处的吸光值；C确定药物ABP-W1的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复A和B步骤。最终确定抗菌肽ABP-W1对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386和P1381、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374或耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369的最低抑制浓度。同时测定抗生素药物万古霉素、青霉素钠和头孢噻肟对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386和P1381、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374、耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369的最小抑菌浓度。

ABP-W1多肽对临床分离的耐甲氧西林的金黄葡萄球菌P1381(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达5000μg/ml和400μg/ml)和耐甲氧西林的金黄葡萄球菌P1386(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达10000μg/ml和400μg/ml)、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达4000μg/ml和100μg/ml)和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369(青霉素和头孢噻肟的最小抑菌浓度MIC分别高达20000μg/ml和400μg/ml)的最小抑菌浓度MIC均为8μg/ml。抗菌效果与万古霉素相当，具有高效的抗耐甲氧西林葡萄球菌功能。

实施例4：抗菌多肽ABP-W1药物对敏感葡萄球菌的最小抑菌浓度

多肽ABP-W1在制备治疗或预防敏感葡萄球菌的药物中应用过程是：A将临床分离的敏感金黄葡萄球菌P969、敏感表皮葡萄球菌P1111和P1368培养到OD₆₀₀＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的ABP-W1，达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照孔加入20μl的1％BSA；B37℃培养12小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在630nM波长处的吸光值；C确定药物ABP-W1的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复试验的前两个步骤A和B。最终确定抗菌肽ABP-W1对敏感金黄金黄葡萄球菌P969、敏感金黄表皮葡萄球菌P1111和P1368的最低抑制浓度。同时测定抗生素药物万古霉素、青霉素钠和头孢噻肟对敏感金黄葡萄球菌P969、敏感表皮葡萄球菌P1111和P1368的最小抑菌浓度。

抗菌结果表明，ABP-W1药物对敏感金黄葡萄球菌P969、敏感表皮葡萄球菌P1111和P1368的最小抑菌浓度均为4μg/ml，而万古霉素对它们的最小抑菌浓度均为8μg/ml，青霉素钠对它们的最小抑菌浓度分别为4μg/ml、40μg/ml和40μg/ml，头孢噻肟对它们的最小抑菌浓度分别为5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml。ABP-W1药物对临床分离敏感金黄葡萄球菌和敏感表皮葡萄球菌的抗菌效果良好，比传统的抗生素效果要高1倍以上。

实施例5：抗菌多肽ABP-W1药物对耐甲氧西林金黄葡萄球菌的生长抑制曲线

多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐甲氧西林金黄葡萄球菌的药物中应用过程是：将耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386培养到OD₆₀₀＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的ABP-W1，达到终浓度为40μg/ml，8μg/ml，2μg/ml，0.4μg/ml。阴性对照孔加入20μl的1％BSA；37℃培养摇床培养，分别在3、4、5、6、7和8小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在630nM波长处的吸光值。以培养时间为横坐标和菌液在630nM处的吸光度为纵坐标做生长曲线。同时测定抗生素药物万古霉素(浓度为40μg/ml，8μg/ml和2μg/ml)、青霉素钠(40000μg/ml，4000μg/ml，400μg/ml和40μg/ml)和头孢噻肟(400μg/ml，40μg/ml，4μg/ml和0.4μg/ml)对耐甲氧西林金黄葡萄球菌P1386的生长曲线。

ABP-W1多肽对临床分离的耐甲氧西林的金黄葡萄球菌P1386具有高效的抗菌效果，2μg/ml的ABP-W1多肽可以完全抑制耐甲氧西林的金黄葡萄球菌P1386的正常生长。

实施例6：抗菌多肽ABP-W1药物对敏感葡萄球菌的生长抑制曲线

多肽ABP-W1在制备治疗或预防敏感葡萄球菌的药物中应用过程是：将临床分离的敏感金黄葡萄球菌P969培养到OD₆₀₀＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的ABP-W1，达到终浓度为40μg/ml，8μg/ml，2μg/ml，0.4μg/ml。阴性对照孔加入20μl的1％的1％BSA；37℃培养摇床培养，分别在3、4、5、6、7和8小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在630nM波长处的吸光值。以培养时间为横坐标和菌液在630nM处的吸光度为纵坐标做生长曲线。同时测定抗生素药物万古霉素(浓度为40μg/ml，8μg/ml、2μg/ml和0.4μg/ml)、青霉素钠(400μg/ml，40μg/ml，4μg/ml和0.4μg/ml)和头孢噻肟(40μg/ml，10μg/ml，2μg/ml和0.4μg/ml)对临床分离的敏感金黄葡萄球菌P969的生长曲线。

ABP-W1多肽对临床分离的敏感金黄葡萄球菌P969具有高效的抗菌效果，2μg/ml的ABP-W1多肽可以完全抑制敏感金黄葡萄球菌P969的正常生长。

实施例7：ABP-W1药物对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症小鼠的治疗试验

多肽ABP-W1在制备治疗或预防对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症的药物中应用过程是：将临床分离的耐青霉素葡萄球菌P1383培养到OD₆₀₀＝0.8时，离心收集菌体，将耐青霉素葡萄球菌P1383以10⁷/ml的浓度配制在0.3％的胃粘素中。挑选30只18-20g的小白鼠，按照6只/组随机分组，共5组。一组腹腔注射0.5ml的0.3％胃粘素做对照，剩下四组共25只小鼠腹腔注射0.5ml的10⁷/ml耐青霉素葡萄球菌P1383。1小时后，对四组小白鼠分别用生理盐水、ABP-W1(10mg/kg)、万古霉素(70mg/kg)和青霉素钠(70mg/kg)药物注射腹腔，进行药物治疗，连续室温饲养小鼠7天，记录各组小鼠的死亡数目。0.3％胃粘素做对照组小鼠全部存活。生理盐水注射败血症小鼠对照组在第一天全部死亡。ABP-W1药物和万古霉素药物治疗败血症小鼠试验组全部存活。而青霉素钠治疗败血症小鼠试验组在第一天有3只小鼠死亡，第二天有2只小鼠死亡，第三天有1只小鼠死亡，该组6只小鼠全部死亡。

治疗试验结果表明，在动物水平上，10mg/kg的ABP-W1药物剂量可以使耐青霉素葡萄球菌引起的败血症小鼠恢复正常，其治疗效果与70mg/kg的万古霉素药物相当。

试验结果请见下表：

表1为抗菌多肽ABP-W1对耐青霉素葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌和敏感葡萄球菌的最小抑菌浓度以及与万古霉素、青霉素钠和头孢噻肟的最小抑菌浓度的比较。

表2为ABP-W1药物对耐青霉素葡萄球菌P1383引起的败血症小鼠的治疗试验结果。每组试验小鼠数为6只。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种抗耐药菌的多肽及用途

<130>一种抗耐药菌的多肽及用途

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>338

<212>DNA

<213>Mesobuthus martensii karsch

<400>1

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>Mesobuthus martensii karsch

<400>2

Claims

1、一种分离的东亚钳蝎抗菌多肽，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2、多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐青霉素金黄葡萄球菌的药物中的应用。

3、多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐青霉素表皮葡萄球菌的药物中的应用。

4、多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐甲氧西林金黄葡萄球菌的药物中的应用。

5、多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐甲氧西林人葡萄球菌的药物中的应用。

6、多肽ABP-W1在制备治疗或预防耐甲氧西林溶血性葡萄球菌的药物中的应用。

7、多肽ABP-W1在制备治疗或预防对耐青霉素葡萄球菌引起的败血症的药物中的应用。