CN108753646A - 一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌及其筛选方法，该人葡萄球菌分离于健康人皮肤定植的人葡萄球菌菌株，命名为S34‑1，对临床常见的革兰阳性耐药病原菌均有明显抑菌作用，但对革兰阴性耐药菌无抑菌作用。该人葡萄球菌株S34‑1基因组大小为2195430bp，包含2个质粒，大小分别为29577bp和29535bp，其已于2018年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.15552。本发明还涉及该人葡萄球菌S34‑1在制备抗革兰阳性耐药菌药物中的应用。本发明从人体共生/定植菌群中筛选到对临床常见耐药病原菌有广谱抗菌活性的菌株，为挖掘对人体低毒无害、结构全新、不易产生耐药、针对性更强的新型抗菌分子打下基础。

Description

一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌及其 筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物动物细胞系领域，尤其涉及一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌及其筛选方法。
背景技术
多重耐药菌感染已经成为全球棘手的公共健康议题。2017年WHO发布12种临床耐药菌的全球警告，碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌(CRE)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)及甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)等都是临床抗感染治疗最棘手的病原类型。大多数现有的抗生素来源于环境(土壤等)微生物的代谢产物，但环境微生物这一有限资源在上世纪六十年代已被最大程度的挖掘。随着近几年对人体微生物组学研究进展，研究者开始关注于和人类共适应、共进化数百万年的人体共生菌/定植菌群，约100万亿个细菌组成的人体共生菌影响人体的健康。人体不同部位的共生菌群构成了抵御病原体入侵的第一道防线，能够与病原体竞争营养、阻止病原体粘附定植，分解和吸收宿主无法消化的碳水化合物，合成分泌宿主必须的维生素，对肠道黏膜免疫和机体免疫系统都产生动态而持久的影响。尤为重要的是人体共生菌群能产生作用于人体和环境细胞的特有代谢产物，其中一种即为抗菌分子，它能够抑制其他细菌在该部位的定植和入侵，为产生菌提供了必要的竞争优势。
人体皮肤和上呼吸道是抵御外来病原微生物入侵的第一道防线，皮肤和上呼吸道定植的菌群以凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative Staphylococcus，CNS)为主，包括人葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌、沃氏葡萄球菌及路登葡萄球菌等。CNS的存在对维持皮肤和上呼吸道正常的生理功能及免受其他病原微生物的入侵具有重要意义。
目前，均未有报道人葡萄球菌与抗革兰阳性耐药菌之间具有关联性的相关文献。
发明内容
本发明的目的是从人体共生/定植菌群中筛选到对临床常见耐药病原菌有广谱抗菌活性的菌株，具体涉及一株分离于健康人皮肤表面定植的人葡萄球菌菌株，该菌株产生的抗菌分子对临床常见革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌，所述人葡萄球菌的大小为2195430bp，G+C含量为50％，含有7个前噬菌体，3个基因组岛以及2个质粒，其中所述质粒的大小分别为29577bp和29535bp。
进一步地，所述人葡萄球菌命名为S34-1，其分类命名为人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，其保藏编号为CGMCC No.15552，保藏日期为2018年04月03日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
进一步地，所述革兰阳性耐药菌包括：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、耐大环内酯类抗生素的肺炎链球菌、耐万古霉素的屎肠球菌。
进一步地，所述甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌包括社区获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)、医院获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)、家畜来源甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(LA-MRSA)。
本发明的第二个目的是提供一种如上所述的对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌的筛选方法，其包括如下步骤：
步骤1)对健康受试者的人皮肤拭子样本进行常规菌群培养，对每一样本进行基因测序鉴定，其分析结果为健康人群皮肤可培养菌群在属水平上含有一定比例的人葡萄球菌；
步骤2)通过平板抑菌试验，分析健康人皮肤表面分离的定植人葡萄球菌对所测试的革兰阳性耐药病原菌的生长的抑制作用；
步骤3)筛选对所有测试的革兰阳性耐药病原菌都有显著抑菌作用的人葡萄球菌，并将其命名为S34-1。
为了进一步优化上述筛选方法，本发明采用的技术措施还包括：
进一步地，所述步骤1)中的一定比例的人葡萄球菌为：葡萄球菌属在健康人群皮肤可培养菌群中的占比为80.2％；在所述葡萄球菌属中，人葡萄球菌的占比46.4％。
进一步地，所述步骤1)和步骤2)中的健康受试者为体检正常、无既往疾病史、近半年无医院接触史的18～25岁的受试者。
进一步地，所述步骤1)中的基因测序为对每一样本进行20个单克隆的MALDI-TOFMS和16S rRNA的基因测序。
本发明的第三个目的是提供一株上述的人葡萄球菌在制备抗革兰阳性耐药菌药物中的应用。
进一步地，所述抗革兰阳性耐药菌药物包括抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌药物、抗耐大环内酯类抗生素的肺炎链球菌药物、抗耐万古霉素的屎肠球菌药物。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明从人体共生/定植菌群中筛选到对临床常见耐药病原菌有广谱抗菌活性的菌株，具体为一株分离于健康人皮肤表面定植的人葡萄球菌菌株S34-1，该菌株产生的抗菌分子对临床常见革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性，这为挖掘对人体低毒无害、结构全新、不易产生耐药、针对性更强的新型抗菌分子打下基础。
附图说明
本发明所述的对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌，其命名为S34-1，其分类命名为人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，其保藏编号为CGMCC No.15552，保藏日期为2018年04月03日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
图1表示人葡萄球菌S34-1上清对不同来源的病原性革兰阳性耐药菌都有广谱的抑菌效果的示意图；注：平板上涂布不同国家来源的临床常见耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，人葡萄球菌S34-1细菌上清点种在涂布耐药菌的平板上，24小时后观察抑菌结果。
图2表示人葡萄球菌S34-1菌株全基因组测序分析的结果示意图；其中A：采用三代PacBio RS II平台测序，测序数据分析采用mGenomeSubtractor软件；B：人葡萄球菌S34-1菌株基因组大小为2195430bp，G+C含量为50％，含有7个Prophage(前噬菌体)，3个GI-likeregion(基因组岛)，2个质粒，大小分别为29577bp和29535bp。
具体实施方式
本发明公开一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌，其分离于健康人皮肤定植的人葡萄球菌菌株，命名为S34-1，其已于2018年04月03日保藏，其保藏编号为CGMCC No.15552。本发明还涉及一种上述人葡萄球菌的筛选方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌的筛选步骤，其包括：
步骤1)对上海地区体检正常、无既往疾病史、近半年无医院接触史的18～25岁男性200人和女性200人皮肤拭子样本进行常规菌群培养，每一样本进行20个单克隆的MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序鉴定。分析结果发现健康人群皮肤可培养菌群在属水平上葡萄球菌属占到80.2％。而进一步对葡萄球菌属细菌进行菌种鉴定，发现人葡萄球菌占46.4％。
步骤2)通过平板抑菌试验，分析健康人皮肤表面分离的定植人葡萄球菌对不同国家、社区和医院分离的致病性的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐大环内酯类抗生素的肺炎链球菌(MRSP)、耐万古霉素的屎肠球菌(VRE)、碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌(CRE)等生长的抑制作用(具体受试的临床常见耐药病原菌类型见表1)。
步骤3)皮肤表面的人葡萄球菌可以产生作用效果不同的抗菌分子，有效抵抗临床耐药病原菌的定植和入侵。其中S34-1菌株对所有测试革兰阳性耐药病原菌都有显著抑菌作用，其他皮肤定植的表皮葡萄球菌不能对所有的受试革兰阳性耐药病原菌有抑制作用(抑菌结果见图1)。
表1：用来筛选的的临床常见耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)类型
编号 菌株名 MLST分型 来源 Source of
1 SF8300 ST8 USA300 CA-MRSA
2 SF8300agr mutant ST8 USA300 CA-MRSA
3 MW2 ST1 USA400 CA-MRSA
4 MW2agr mutant ST1 USA400 CA-MRSA
5 BD02-25 ST8 USA500 HA-MRSA
6 BD-02-25agr mutant ST8 USA500 HA-MRSA
7 07-02662 ST80 Germany CA-MRSA
8 SF-1497 ST30 USA1100 CA-MRSA
9 CN1 ST72 South Korea CA-MRSA
10 SF 1208 ST36 USA200 HA-MRSA
11 BAA-40 ST239 Canada HA-MRSA
12 BAA-43 ST239 Canada HA-MRSA
13 SF-2561 ST5 USA100 HA-MRSA
14 S0385 ST398 Holland LA-MRSA
15 2014-58 ST9 China LA-MRSA
16 2012-RJ2 ST59 China CA-MRSA
17 2012-3 ST398 China CA-MRSA
18 09-770 ST239 China HA-MRSA
19 05-72 ST5 China HA-MRSA
本发明通过对体检正常、无既往疾病史、近半年无医院接触史的18～25岁健康人皮肤表面共生/定植菌群进行菌种鉴定，发现葡萄球菌属是主要菌属，人葡萄球菌是主要菌种。通过对健康人皮肤表面定植的所有葡萄球菌菌株进行平板抑菌试验筛选，发现一株分离于健康人皮肤表面定植的人葡萄球菌菌株，将该菌株命名为S34-1，对所有受试的临床革兰阳性耐药病原菌具有广谱的抑菌效果(图1)，但对临床耐药的革兰阴性病原菌无明显抑菌作用。本发明将人皮肤表面定植的人葡萄球菌菌株S34-1培养上清经过过滤浓缩，抗菌作用依然存在，说明表皮葡萄球菌S34-1产生的抗菌分子是分泌到菌体外上清中的。
实施例2
本实施例为对实施例1中所筛选的临床革兰阳性耐药病原菌有广谱抗菌活性分子人葡萄球菌S34-1进行基因测序。其结果如下：
本实施例对这株产生对临床革兰阳性耐药病原菌有广谱抗菌活性分子的人葡萄球菌株S34-1进行全基因组测序分析(图2A)，发现其大小为2195430bp，G+C含量为50％，含有7个Prophage(前噬菌体)，3个GI-like region(基因组岛)，2个质粒，大小分别为29577bp和29535bp(图2B)。
本实施例中所述的人葡萄球菌菌株S34-1已于2018年04月03日进行保藏，其分类命名为人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，其保藏编号为CGMCC No.15552，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
实施例3
本实施例为人葡萄球菌菌株S34-1的抑菌实验验证，其以金黄色葡萄球菌USA300为例，验证步骤如下：
(1)挑取金黄色葡萄球菌USA300单克隆接种10ml新鲜的TSB，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)用酶标仪检测细菌OD600，调节细菌OD600至0.0001接种到50ml固体TSB培养基中，充分混匀后铺平皿。
(3)挑取分离自健康人皮肤的S34-1菌株单克隆接种到10ml新鲜的TSB，37℃，220rpm摇菌过夜。
(4)分别取细菌悬液、细菌培养物离心后的上清和沉淀5μl点种于含有USA300细菌的固体平皿，待干燥后置37℃温箱培养过夜，次日观察抑菌圈。
由该验证实验可知，本发明所述的S34-1菌株对金黄色葡萄球菌USA300具有明显的抑菌作用。
由上述实施例可知，本发明提供了一株分离于健康人皮肤定植的人葡萄球菌菌株S34-1，该菌株产生的抗菌分子对临床常见革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性，这为挖掘对人体低毒无害、结构全新、不易产生耐药、针对性更强的新型抗菌分子打下基础。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一株对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌，其特征在于，所述人葡萄球菌的大小为2195430bp，G+C含量为50％，含有7个前噬菌体，3个基因组岛以及2个质粒，其中所述质粒的大小分别为29577bp和29535bp。
2.根据权利要求1所述的人葡萄球菌，其特征在于，所述人葡萄球菌命名为S34-1，其保藏编号为CGMCC No.15552，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.根据权利要求1所述的人葡萄球菌，其特征在于，所述革兰阳性耐药菌包括：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、耐大环内酯类抗生素的肺炎链球菌、耐万古霉素的屎肠球菌。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述的对革兰阳性耐药菌具有广谱抗菌活性的人葡萄球菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)对健康受试者的人皮肤拭子样本进行常规菌群培养，对每一样本进行基因测序鉴定，其分析结果为健康人群皮肤可培养菌群在属水平上含有一定比例的人葡萄球菌；
步骤2)通过平板抑菌试验，分析健康人皮肤表面分离的定植人葡萄球菌对所测试的革兰阳性耐药病原菌的生长的抑制作用；
步骤3)筛选对所有测试的革兰阳性耐药病原菌都有显著抑菌作用的人葡萄球菌，并将其命名为S34-1。
5.根据权利要求4所述的的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中的一定比例的人葡萄球菌为：葡萄球菌属在健康人群皮肤可培养菌群中的占比为80.2％；在所述葡萄球菌属中，人葡萄球菌的占比46.4％。
6.根据权利要求4所述的的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)中的健康受试者为体检正常、无既往疾病史、近半年无医院接触史的18～25岁的受试者。
7.根据权利要求4所述的的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中的基因测序为对每一样本进行20个单克隆的MALDI-TOF MS和16S rRNA的基因测序。
8.一株如权利要求1～3中任一项所述的人葡萄球菌在制备抗革兰阳性耐药菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗革兰阳性耐药菌药物包括抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌药物、抗耐大环内酯类抗生素的肺炎链球菌药物、抗耐万古霉素的屎肠球菌药物。
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