CN102295683A

CN102295683A - 抗单纯疱疹病毒多肽及其应用

Info

Publication number: CN102295683A
Application number: CN2011102483188A
Authority: CN
Inventors: 李文鑫; 曹志贱; 吴英亮; 韩松
Original assignee: WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2031-08-24
Also published as: CN102295683B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了抗单纯疱疹病毒活性多肽及其用途。试验表明本发明所述抗单纯疱疹病毒多肽对单纯疱疹病毒增殖具有高效抑制作用，可用于制备治疗或预防单纯疱疹相关疾病药物。本发明提供的以抗单纯疱疹病毒多肽为有效成分的治疗单纯疱疹病毒引起疱疹的药物制剂，用于治疗疱疹见效明显，治疗效果显著，对治疗单纯疱疹、口唇疱疹、生殖疱疹等有效率达到100％，且无毒副作用，治愈后不复发。

Description

抗单纯疱疹病毒多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及抗单纯疱疹病毒多肽及其应用。

背景技术

单纯疱疹病毒(HSV)是一种常见的人类传染病病毒，在全球广泛分布，可造成龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染，引发单纯疱疹、口唇疱疹、生殖疱疹，严重影响人体健康。单纯疱疹病毒在感染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中通过皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体，周而复始的循环。

疱疹病毒的治疗方法包括一般疗法、中医中药治疗和抗病毒药治疗，其中抗病毒药物治疗是现阶段最主要的治疗方法。目前，抗病毒药物有很多，如阿糖腺苷或无环鸟苷，阿昔洛韦(ACV)，它们是口服高效抗病毒药，均为开链嘌呤核苷，能抑制病毒脱氧核糖核酸合成，但对宿主细胞DNA的合成作用较少，被认为是当前最有效的抗HSV药物。近年来还新开发出无环鸟苷的类似物，如万乃洛韦(valaciclovir)、法昔洛韦(famicidovir)、潘昔洛韦(pencidovir)等，具有疗效确切、生物利用度高等优点。但这些抗病毒药物的使用产生病毒的耐药性，导致许多疱疹治疗药物疗效不佳。

中国传统医药常用“以毒攻毒”的策略治疗人类的疑难杂症，其中以蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等有毒动物为首选药材。现代研究表明这些有毒动物的毒液中富含动物活性多肽，称为多肽的生物活性物质，因其具有纯生物物质、稳定性强、杀病毒强、广谱、无抗药耐药性、无毒副作用和“三致”作用特点，已成为全球竞争研发的重要药物资源[Nat.Rev.Drug.Discov.20032：63]。

有毒动物阳离子防御肽是一类由宿主生成在天然免疫中特异性发挥防御性作用的一类小分子多肽，通常由10-50个氨基酸构成，静电荷从+2到+9不等。根据结构的差别，阳离子防御肽可以分为如下几类：含有2-4个β片层的两亲性分子、两亲性α螺旋、卷曲结构、以及含有高级结构的分子，它们都在生物体抵御微生物的入侵中发挥重要的作用。而其中的α螺旋类阳离子防御肽特异性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒进入的过程，或者是直接作用于病毒的包膜。例如，蜂毒溶血肽Melitiin和天蚕素Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-1病毒的增殖，爪蟾抗病毒多肽Magainin-2对疱疹病毒HSV和HSV-2有一定的抑制效果，Dermaseptin就是通过作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，从而达到抗病毒的作用。蝎子中阳离子防御肽的研究也已经有多年的历史。其中除了从淋巴系统中发现的防御肽外，更多的是从蝎毒腺中分离到的防御肽，例如Hadrurin、Scorpine、Opistoporin、Parabutoporin、ISCT和Pandinin，这些多肽都属α螺旋类阳离子防御肽，且阳离子防御肽不再是传统的疫苗防治，而是通过直接抑制病毒达到抗病毒的目的。

发明内容

本发明目的是提供稳定的抗单纯疱疹病毒多肽。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种多肽，其氨基酸序列为PheIleX₁X₂IleAlaX₃LeuLeuX₄X₅IlePhe、PheIleX₆IleX₇LeuLeuX₈IlePhe或PheIleX₉IleX₁₀LeuX₁₁IlePhe，其中X₁、X₃和X_5～11独立选自Arg、Lys或His；X₂和X₄为任意氨基酸；且该多肽不为Phe Ile Lys Arg Ile AlaArg Leu Leu Arg Lys Ile Phe。

本发明通过构建和筛选我国西藏琵蝎毒腺组织cDNA文库，得到了具有抗单纯疱疹病毒活性的多肽基因，通过基因工程技术，获得了西藏琵蝎抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1，其序列为Phe Ile Arg Lys Ile Ala Arg Leu Leu LysArg Ile Phe。根据AHSVP1的成熟肽序列，使用在线NPSserver[DSC法(Discrimination of protein Secondary structure Class)]对其进行二级结构预测，并利用软件AHTHEPROT 2000绘制其二级结构图像。二级结构图显示AHSVP1含有100％的α-Helix结构，具有典型的两亲性(amphiphilic)α-Helix结构，含有大量带净正电荷的碱性残基(Arg和Lys)。然后对AHSVP1多肽序列进行大量点突变，发现氨基酸序列为PheIleX₁X₂IleAlaX₃LeuLeuX₄X₅IlePhe、PheIleX₆IleX₇LeuLeuX₈IlePhe或PheIleX₉IleX₁₀LeuX₁₁IlePhe的AHSVP1同源结构多肽，并不影响其双亲性的特征，其中X₁、X₃和X_5～11独立选自Arg、Lys或His，X₂和X₄为任意氨基酸。因此，本发明提供了抗单纯疱疹病毒多肽，其氨基酸序列为PheIleX₁X₂IleAlaX₃LeuLeuX₄X₅IlePhe、PheIleX₆IleX₇LeuLeuX₈IlePhe或PheIleX₉IleX₁₀LeuX₁₁IlePhe，其中X₁、X₃和X_5～11独立选自Arg、Lys或His；X₂和X₄为任意氨基酸；且该多肽不为Phe Ile Lys Arg Ile Ala Arg LeuLeu Arg Lys Ile Phe。

本发明还提供了具有通过在本发明所述多肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的且具有抗单纯疱疹病毒活性的多肽。所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在氨基酸序列的任意位点进行，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗单纯庖疹病毒活性即可。类似的，所取代、缺失或添加的氨基酸的数目也是任意的，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗单纯庖疹病毒活性。

在具体实施实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：1～25之一所示的氨基酸序列的多肽。其中具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽为AHSVP1。AHSVP1的前体组织形式编码70个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽(23个残基)、成熟肽(13个残基)和前体肽(34个残基)，如图1所示，其中，cDNA序列下方为推断的对应氨基酸序列；信号肽氨基酸以斜体标记；成熟肽氨基酸为阴影部分氨基酸；下划线部分氨基酸为C端前体肽。

本发明还提供了本发明所述具有SEQ ID NO：1～25之一所示的氨基酸序列的多肽一个或多个氨基酸残基被甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修饰所得到的氨基酸序列的且具有抗单纯疱疹病毒活性的多肽。所述的氨基酸被甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修饰，可以在氨基酸序列任意位点进行，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗单纯庖疹病毒活性即可。类似的，所述被甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修饰的氨基酸的数目也是任意的，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗单纯庖疹病毒活性。

本发明也提供了编码本发明所述多肽的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。对于编码本发明所述多肽的DNA分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于抗菌性多肽的氨基酸序列的DNA分子。

在一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽AHSVP1的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示。

在其它实施方案中，本发明还提供了可以编码具有SEQ ID NO：2～25所示氨基酸序列的多肽的DNA分子。

实验表明，本发明所述多肽对单纯疱疹病毒增殖具有高效抑制作用，对单纯疱疹病毒的IC₅₀小于2μg/mL。因此本发明提供了所述多肽在制备治疗或预防单纯疱疹相关疾病药物中的应用，所述单纯疱疹相关疾病具体为单纯疱疹、口唇疱疹或生殖器疱疹。

本发明还提供了一种治疗疱疹的药物制剂，包括治疗有效量的本发明所述多肽中的一种或几种和药学上可接受的辅料。本领域技术人员可将所述抗单纯疱疹病毒多肽直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成抗病毒常用制剂如口服液、注射液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、滴丸剂、软膏剂和凝胶剂等。

在实施方案中，本发明所述治疗疱疹的药物制剂为凝胶剂，由于可直接作用于病灶，利于药物释放，且使用方便，涂布性好，不妨碍皮肤正常功能，该剂型深受临床患者的青睐。

本发明提供的凝胶剂中本发明所述多肽含量可在广泛的限度内变化，具体含量取决于有待治疗的疾病的严重性、施用的模式和时间等。优选的，本发明所述凝胶剂中包括0.5wt％本发明所述抗单纯疱疹病毒多肽中的一种或几种。

在具体实施方案中，本发明提供的所述凝胶剂还包括10wt％的丙二醇、20wt％的乙醇、15wt％的羟甲基纤维素、1wt％的三乙醇胺、0.1wt％的羟苯乙酯和53.4wt％的无菌水。

本发明经临床疗效观察，在100例单纯疱疹患者中，用本发明所述凝胶剂涂抹2天后有效率可达42％，用药第4、6和10天时有效率达到86％、98％和100％。本发明还分别针对口唇疱疹和生殖疱疹进行了临床疗效观察，结果显示本发明所述含有AHSVP1或其同源结构多肽的治疗疱疹的凝胶制剂对治疗口唇疱疹和生殖疱疹有效率达到100％。

本发明提供了抗单纯疱疹病毒多肽。试验表明本发明所述多肽对单纯疱疹病毒增殖具有高效抑制作用，可用于制备治疗或预防单纯疱疹相关疾病药物。本发明提供的以抗单纯疱疹病毒多肽为有效成分的治疗单纯疱疹病毒引起疱疹的药物制剂，用于治疗疱疹见效明显，治疗效果显著，对治疗单纯疱疹、口唇疱疹、生殖疱疹等有效率达到100％，且无毒副作用，治愈后不复发。

附图说明

图1示抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1 cDNA序列及其氨基酸序列，其中，cDNA序列下方为推断的对应氨基酸序列；信号肽氨基酸以斜体标记；成熟肽氨基酸为阴影部分氨基酸；下划线部分氨基酸为C端前体肽；

图2示抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1及其部分结构同源多肽的双亲性结构图；

图3示抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1色谱图；

图4示抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1质谱图；

图5示抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1抗HSV-1浓度依赖效应，其中横坐标为AHSVP1多肽浓度(μg/mL)，纵坐标为相应浓度的多肽处理后病毒的噬斑形成百分比。

具体实施方式

本发明实施例公开了抗单纯疱疹病毒活性多肽及其用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：抗单纯疱疹病毒多肽基因的制备

取40只西藏琵蝎(Scorpops tibetanus)蝎尾腺，用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，提取方法参照Trizol试剂盒说明书。用Poly A Tract mRNA分离系统(Promega，USA)和纯化mRNA，并采用Superscript Plasmid System cDNAlibrary construction kit(Gibco/BRL)试剂盒构建西藏琵蝎毒腺组织cDNA文库。将cDNA克隆到pSPORT1载体中，并转化大肠杆菌DH5α。随机从构建好的西藏琵蝎毒腺cDNA文库中挑选2000克隆子，对测序的结果进行序列分析，采用CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)软件进行同源性比较和信号肽切割位点预测，获得具有编码抗单纯疱疹病毒活性多肽AHSVP1的cDNA基因，所编码的成熟肽为具有如SEQ IDNO：1氨基酸序列的抗单纯疱疹病毒多肽AHSVP1。AHSVP1的前体组织形式编码70个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽(23个残基)、成熟肽(13个残基)和前体肽(34个残基)。

实施例2：AHSVP1多肽的结构分析及其同源结构双亲性多肽

根据SEQ ID NO：1所示的AHSVP1的成熟肽序列FIRKIARLLKRIF，即Phe Ile Arg Lys Ile Ala Arg Leu Leu Lys Arg Ile Phe，使用在线NPSserver[DSC法(Discrimination of protein Secondary structure Class)]对其进行二级结构预测，并利用软件AHTHEPROT 2000绘制其二级结构图像，结果见图2。二级结构图显示AHSVP1含有100％的α-Helix结构，具有典型的两亲性(amphiphilic)α-Helix结构，含有大量带净正电荷的碱性残基(Arg和Lys)。然后根据AHSVP1螺旋图对AHSVP1多肽序列进行大量点突变和缺失，各序列见表1。

表1：抗单纯疱疹病毒多肽AHSVP1及其结构同源多肽

SEQ IDNO.	多肽名称	氨基酸序列	突变性质	a螺旋值
					1	AHSVP1	FIRKIARLLKRIF	野生型	100％
2	AHSVP1-R3K	FIKKIARLLKRIF	碱性	100％
					3	AHSVP1-R3H	FIHKIARLLKRIF	碱性	100％
4	AHSVP1-K4A	FIRAIARLLKRIF	非极性	100％
					5	AHSVP1-K4D	FIRDIARLLKRIF	酸性	100％
6	AHSVP1-K4R	FIRRIARLLKRIF	碱性	100％
					7	AHSVP1-K4S	FIRSIARLLKRIF	极性中性	100％
8	AHSVP1-R7K	FIRKIAKLLKRIF	碱性	100％
					9	AHSVP1-R7H	FIRKIAHLLKRIF	碱性	100％
10	AHSVP1-K10A	FIRKIARLLARIF	非极性	100％
					11	AHSVP1-K10D	FIRKIARLLDRIF	酸性	100％
12	AHSVP1-K10R	FIRKIARLLRRIF	碱性	100％
					13	AHSVP1-K10S	FIRKIARLLSRIF	极性中性	100％
14	AHSVP1-R11K	FIRRIARLLKKIF	碱性	100％
					15	AHSVP1-R11H	FIRRIARLLKHIF	碱性	100％
16	AHSVP1-16	FIIRLLRIF	缺失、碱性	100％
					17	AHSVP1-17	FIKIRLLRIF	缺失、碱性	100％
18	AHSVP1-18	FIRIKLLRIF	缺失、碱性	100％
					19	AHSVP1-19	FIRIRLLKIF	缺失、碱性	100％
20	AHSVP1-20	FIRIHLLRIF	缺失、碱性	100％
					21	AHSVP1-21	FIRIRLRIF	缺失、碱性	100％
22	AHSVP1-22	FIKIRLRIF	缺失、碱性	100％
					23	AHSVP1-23	FIRIKLRIF	缺失、碱性	100％
24	AHSVP1-24	FIRIRLKIF	缺失、碱性	100％
					25	AHSVP1-25	FIRIHLRIF	缺失、碱性	100％

由表1结果可见氨基酸序列为PheIleX₁X₂IleAlaX₃LeuLeuX₄X₅IlePhe、PheIleX₆IleX₇LeuLeuX₈IlePhe或PheIleX₉IleX₁₀LeuX₁₁IlePhe的AHSVP1同源结构多肽，并不影响其双亲性的特征，其中X₁、X₃和X_5～11独立选自Arg、Lys或His；X₂和X₄为任意氨基酸。

实施例3 化学合成AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽

根据AHSVP1(Phe Ile Arg Lys Ile Ala Arg Leu Leu Lys Arg Ile Phe)及其同源结构双亲性多肽的氨基酸序列进行人工合成。固相化学合成方法获得了高纯度的AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽。对制得AHSVP1多肽进行纯度检测，结果见图3和图4。AHSVP1同源结构多肽的检测结果未显示。

实施例4：AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽的细胞毒性检测

按照3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)检测AHSVP1及其同源结构双亲性多肽的细胞毒性。Vero细胞消化计数，按7000～10000/孔接种至96孔板，37℃，5％CO₂培养24h。将AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽进行梯度稀释，加入到细胞培养基中，使之终浓度分别为25、50、75、100、150、200、250μg/mL，每个浓度设3～5个重复孔，37℃，5％CO₂培养48h。取出培养板，每孔加入5mg/mL(PBS配制，即0.5％MTT)的MTT溶液20μL，轻摇混匀，37℃，5％CO₂孵育4h。吸去培养基，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，室温震摇20min，使结晶紫沉淀完全溶解，用酶标仪在570nm波长下检测各孔吸光值，计算细胞存活率。同时设置调零孔(含培养基、MTT和DMSO)，对照孔(含有Vero细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养基、MTT和DMSO)。

结果显示，AHSVP1及其同源结构双亲性多肽的细胞毒性的CC50均大于100μg/mL。

实施例5：AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽的溶血性检测

取健康人抗凝血(由武汉大学校医院提供)，离心收集血细胞，用1×Hepes(pH7.2)洗2～3次，1200g离心10min，血细胞用生理盐水重悬计数，以10⁷～10⁸/孔加至96孔板。然后将AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽进行梯度稀释，加入到细胞培养基中，使之终浓度分别为25、50、75、100、150、200、250μg/mL，以生理盐水和Triton X-100作为阴性和阳性对照，每个浓度设3～5个重复孔，37℃孵育30～60min，1000g离心5min，取上清100μL，用酶标仪在570nm波长下检测吸光值，计算溶血率。。

结果显示，AHSVP1及其同源结构双亲性多肽的溶血性HC50均大于250μg/mL。

实施例6：AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽对单纯疱疹病毒抑制效应

试验材料：Vero细胞，购自武汉大学典型培养物保藏中心；培养基为MEM培养基，含有10％(传代培养基)或2％(维持培养基)胎牛血清(FBS，GIBCO)、2mM/mL左旋谷氨酸盐、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，培养条件为37℃，5％CO₂培养箱培养；病毒株为单纯疱疹病毒HSV(F株)和I单纯疱疹病毒HSV-2，购自中国科学院武汉病毒所保藏中心。

单纯疱疹病毒HSV的扩增：取Vero细胞培养至汇合度70～80％，吸出培养基，加入HSV病毒稀释液，37℃吸附约2h，补充2％FBS-MEM培养基至正常培养体积，置37℃，5％CO₂培养。约48～72h后，待细胞单层出现80～90％病变，反复冻融3～5次，收集细胞及上清至离心管中，4℃3000～4000rpm离心10min，除去细胞碎片，上清分装，-80℃保存备用。病毒储存液的滴度以蚀斑法测定。

AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽对HSV感染抑制的剂量关系检测：将Vero细胞接种96孔板，37℃，5％CO₂培养24h，至细胞汇合度达到70～80％。将AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽进行连续两倍稀释，浓度梯度为0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mL，然后将HSV病毒储存液进行连续稀释，按相同PFU的感染剂量分别与不同浓度AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽混合孵育2h，无血清培养基洗细胞三次后，加入病毒与多肽混合液，37℃感染吸附约2h，移除病毒液，用无血清培养基清洗三次，除去游离病毒，分别添加含对应浓度多肽的细胞覆盖层(2×MEM，含4％FBS，使用前与等体积1.5％低熔点琼脂糖混匀，成为含2％FBS的细胞维持液)，置37℃，5％CO₂培养约72h后，弃去细胞培养液，然后每孔加入2mL 1％结晶紫染液(含10％甲醛)染色2min。观察并计录蚀斑的形态、大小、数目，计算AHSVP1多肽和其同源结构双亲性多肽对HSV的抗病毒效应。

计算方法：空斑形成单位(PFU/mL)＝每孔平均空斑数×病毒稀释度/每孔接种病毒量。不同浓度AHSVP1多肽抑制HSV噬斑形成效应如图5，AHSVP1同源结构双亲性多肽抑制HSV噬斑形成效应如表2所示。

表2 AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽对单纯疱疹病毒的抑制效应

SEQ IDNO.	多肽名称	氨基酸序列	HSV-1(μg/mL)	HSV-2(μg/mL)
					1	AHSVP1	FIRKIARLLKRIF	0.8	0.9
2	AHSVP1-R3K	FIKKIARLLKRIF	1.4	1.5
					3	AHSVP1-R3H	FIHKIARLLKRIF	1.9	1.5
4	AHSVP1-K4A	FIRAIARLLKRIF	1.8	1.3
					5	AHSVP1-K4D	FIRDIARLLKRIF	1.0	1.6
6	AHSVP1-K4R	FIRRIARLLKRIF	1.1	1.8
					7	AHSVP1-K4S	FIRSIARLLKRIF	1.1	0.9
8	AHSVP1-R7K	FIRKIAKLLKRIF	0.8	1.0
					9	AHSVP1-R7H	FIRKIAHLLKRIF	0.9	0.9
10	AHSVP1-K10A	FIRKIARLLARIF	0.9	0.9
					11	AHSVP1-K10D	FIRKIARLLDRIF	1.0	1.0
12	AHSVP1-K10R	FIRKIARLLRRIF	0.9	0.9
					13	AHSVP1-K10S	FIRKIARLLSRIF	1.4	1.9
14	AHSVP1-R11K	FIRRIARLLKKIF	1.4	1.9
					15	AHSVP1-R11H	FIRRIARLLKHIF	1.7	1.9
16	AHSVP1-16	FIRIRLLRIF	1.1	1.5
					17	AHSVP1-17	FIKIRLLRIF	1.2	0.9
18	AHSVP1-18	FIRIKLLRIF	0.8	1.0
					19	AHSVP1-19	FIRIRLLKIF	0.9	0.9
20	AHSVP1-20	FIRIHLLRIF	0.9	0.9
					21	AHSVP1-21	FIRIRLRIF	1.0	1.0
22	AHSVP1-22	FIKIRLRIF	0.9	0.9
					23	AHSVP1-23	FIRIKLRIF	1.4	1.9
24	AHSVP1-24	FIRIRLKIF	1.4	1.9
					25	AHSVP1-25	FIRIHLRIF	1.7	1.9

由图5和表2结果可见AHSVP1多肽及其同源结构双亲性多肽对单纯疱疹病毒具有抑制效应，对HSV噬斑形成效应的半数抑制浓度均小于2μg/mL。

实施例7：本发明所述治疗疱疹的凝胶剂

处方：AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽0.5g、丙二醇10g、乙醇20g、羟甲基纤维素1.5g、三乙醇胺1g、羟苯乙酯0.1g，无菌水加至100g。

制备：将羟甲基纤维素洒于无菌水液面(60mL左右)，隔夜后成为凝胶剂基质，静置后真空脱泡，将AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽、丙二醇、乙醇、三乙醇胺和羟苯乙酯混匀，缓慢加入到浆料中混匀，缓慢搅拌，以避免剧烈搅拌混入过多气泡，分装，即得本发明所述治疗疱疹凝胶剂。

空白对照凝胶剂：制剂中除了不含有AHSVP1多肽或其同源结构双亲性多肽外，其余处方和制备同本发明所述治疗疱疹凝胶剂。

实施例8：本发明所述治疗疱疹的凝胶剂对单纯疱疹病毒的抑制作用

将实施例7制备的凝胶剂按照1∶49的比例溶解在灭菌的生理盐水中，并进行等比稀释10个浓度，置于4℃冰箱备用。按照实施例6所述方法对本发明所述治疗疱疹的对HSV感染的抑制作用进行检测，观察并计录蚀斑的形态、大小、数目，计算含有AHSVP1或其同源结构多肽的凝胶制剂对HSV的抗病毒效应，所述凝胶剂按照制剂中有效成分抗单纯疱疹病毒多肽AHSVP1或其结构同源多肽计算，结果见表3。

表3 本发明所述治疗疱疹的凝胶制剂对单纯疱疹病毒的抑制效应

SEQ IDNO.	多肽名称	HSV-1(μg/mL)	HSV-2(μg/mL)
				1	AHSVP1	0.8	0.9
2	AHSVP1-R3K	1.4	1.5
				3	AHSVP1-R3H	1.9	1.5
4	AHSVP1-K4A	1.8	1.3
				5	AHSVP1-K4D	1.0	1.6
6	AHSVP1-K4R	1.1	1.8
				7	AHSVP1-K4S	1.1	0.9
8	AHSVP1-R7K	0.8	1.0
				9	AHSVP1-R7H	0.9	0.9
10	AHSVP1-K10A	0.9	0.9
				11	AHSVP1-K10D	1.0	1.0
12	AHSVP1-K10R	0.9	0.9
				13	AHSVP1-K10S	1.4	1.9
14	AHSVP1-R11K	1.4	1.9
				15	AHSVP1-R11H	1.7	1.9
16	AHSVP1-16	1.1	1.5
				17	AHSVP1-17	1.2	0.9
18	AHSVP1-18	0.8	1.0
				19	AHSVP1-19	0.9	0.9
20	AHSVP1-20	0.9	0.9
				21	AHSVP1-21	1.0	1.0
22	AHSVP1-22	0.9	0.9
				23	AHSVP1-23	1.4	1.9
24	AHSVP1-24	1.4	1.9
				25	AHSVP1-25	1.7	1.9

由表3结果可见本发明所述含有AHSVP1或其同源结构多肽的治疗疱疹的凝胶制剂对HSV噬斑形成效应的半数抑制浓度均小于2μg/mL。

实施例9：本发明所述治疗疱疹的凝胶剂对疱疹患者的临床治疗试验

病例选择：病人均来自武汉大学人民医院皮肤科门诊经临床确诊的单纯疱疹患者。排除使用过其他抗病毒药物者、严重的肝肾功能不全者以及孕妇哺乳期妇女。

实验分组：将200例病人采用多中心开放平行对照观察方法，分为实验组、对照组。实验组：100人，男性52人，女性48人，年龄18岁到42岁；对照组：100人，男性53人，女性47人，年龄19岁到41岁。2组间年龄性别、病期以及皮损程度等各项指标值相比，差异均无明显意义，具有可比性。

实验方法：实验组给予本发明所述治疗疱疹的凝胶剂；对照组给予3％阿昔洛韦ACV软膏。用药方法为用温热水和皂液或硫磺药皂洗脸，将面部油灰充分洗净，再用棉签蘸药，反复轻轻涂抹于患处，每日早晚各涂抹一次，连续2周为一疗程。

疗效观察：用药2天时，实验组有效率为42％，高于对照组(7％)。在用药的第4、6和10天时，实验组有效率分别为86％，98％和100％，而对照组的有效率仅为32％、43％和53％。两组间有效率差异明显，而且实验组比对照组起效快，实验组丘疹停止出现时间和疼痛缓解时间较对照组短(P＜0.01)，实验组水疱停止出现时间及瘙痒缓解时间也早于对照组(P＜0.01)。实验组完全结痂时间比对照组短(P＜0.01)。

不良反应：实验组100例患者中无1例不良反应。对照组100例患者中有5例涂药后局部灼热感，潮红停药后，自行缓解，未作处理。此外，实验组治疗前后共观察了12例血尿常规、14例肝功，8例肾功能检查，均无异常改变。

结果表明，本发明所述治疗疱疹的凝胶剂治疗单纯疱疹较阿昔洛韦软膏起效快、程疗短，且无毒副作用。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为PheIleX₁X₂IleAlaX₃LeuLeuX₄X₅IlePhe、PheIleX₆IleX₇LeuLeuX₈IlePhe或PheIleX₉IleX₁₀LeuX₁₁Ile Phe，其中X₁、X₃和X_5～11独立选自Arg、Lys或His；X₂和X₄为任意氨基酸；且该多肽不为Phe Ile Lys Arg Ile Ala Arg Leu Leu Arg Lys Ile Phe。

2.具有通过在权利要求1所述多肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列且具有抗单纯疱疹病毒活性的多肽。

3.根据权利要求1所述多肽，其特征在于，具有SEQ ID NO：1～25之一所示的氨基酸序列。

4.具有权利要求3所述多肽的一个或多个氨基酸残基被甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修饰所得到的氨基酸序列的且具有抗单纯疱疹病毒活性的多肽。

5.编码权利要求1～4任意一项所述多肽的DNA分子。

6.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。

7.权利要求1～4任意一项所述多肽在制备治疗或预防单纯疱疹相关疾病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述单纯疱疹相关疾病为单纯疱疹、口唇疱疹或生殖器疱疹。

9.一种治疗疱疹的药物制剂，其特征在于，包括治疗有效量的权利要求1～4任意一项所述多肽中的一种或几种和药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为凝胶剂。

11.根据权利要求10所述药物制剂，其特征在于，所述凝胶剂包括0.5wt％的权利要求1～4任意一项所述多肽中的一种或几种。

12.根据权利要求11所述药物制剂，其特征在于，还包括10wt％的丙二醇、20wt％的乙醇、15wt％的羟甲基纤维素、1wt％的三乙醇胺、0.1wt％的羟苯乙酯和53.4wt％的无菌水。