CN108823162A

CN108823162A - 重组人溶菌酶在制备抗艾滋病药物中的应用

Info

Publication number: CN108823162A
Application number: CN201810746840.0A
Authority: CN
Inventors: 张华�; 李亚男; 吕秋军; 夏枫耿; 陈达凯; 陈聪伟; 杨创钦; 郑金丽; 李月俏; 邓远倪; 陈禹兴; 梁佳潮
Original assignee: Guangzhou Qilong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Qilong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2018-11-16

Abstract

本发明提供了一种通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法及其应用，所述方法通过使人溶菌酶接触感染HIV的细胞，所述的人溶菌酶通过基因重组技术制备而得，能够提供高表达、高纯度、高活性的人溶菌酶，且对细胞毒性较小，对HIV‑1_IIIB感染C8166细胞形成合胞体起抑制作用，具有显著的抗HIV活性和较高的治疗指数，可作为制备诊断、预防、治疗、抑制艾滋病药物的理想选择。

Description

重组人溶菌酶在制备抗艾滋病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种重组人溶菌酶在制备抗艾滋病药物中的应用。

背景技术

艾滋病(AIDS,ac quiredi mmunodeficiencys ydrome)是由人类免疫缺陷病毒(HIV,hu mani mmunodeficiencyvirus)也就是艾滋病病毒所引起的传染病。HIV于1983年首次确定，属于反转录病毒，有3个开放读码框(gag，po l和env)，并含有至少6个较小的基因，这些基因编码多种蛋白，以调节转录、胞内运输和病毒RNA的翻译；还编码影响宿主细胞的其它蛋白，在病毒的传播和感染性方面具有重要功能。病毒通过gpl20包膜蛋白和保守的CD，结合位点直接作用感染细胞。病毒一旦被整合，就被视为细胞的正常基因，转录细胞基因的聚合酶生成病毒mRNA转录产物，病毒也可不被转录，进人潜伏状态，在以后的某个时间再次被激活。转录开始后，生成全长RNA，在胞质中经过翻译产生组装病毒颗粒所需的结构蛋白和酶蛋白，包膜糖蛋白在粗面内质网上翻译并被高尔基器加工，随后被运输到细胞表面。复制的病毒以出芽方式从细胞中长出。

根据联合国艾滋病规划署的最新报道，截止2015年底，全球范围内已有3670万人口感染了HIV病毒，且每年新增感染者210万人，每年死于HIV病毒的人数高达110万。从HIV病毒发现至今已超过三十年，但仍未找到治愈的方法。

自1987年第一个治疗HIV感染的药物齐多夫定(zidovudine，AZT)被美国FDA批准上市以来，截止2013年已有33种抗HIV病毒的化学实体药物被美国FDA批准上市，其中包括18种逆转录酶抑制剂，11种蛋白酶抑制剂，2种整合酶抑制剂，1种CCR5协同受体拮抗剂和1种膜融合抑制剂(USFDA，2013)。这些不断涌现出来的抗HIV新药能够有效地抑制人体内HIV病毒的复制，减缓艾滋病发展进程，大大提高了艾滋病人的平均存活时间。但是，由于这些药物主要靶向逆转录酶、蛋白酶、Gp41和整合酶等有限的几个病毒蛋白，病毒通过频繁变异极易适应和逃避药物施加的选择压力。随着这些药物的广泛使用，很容易产生交叉耐药性及严重的毒副作用，使其临床应用受到很大限制。而且目前使用的抗HIV感染药物还存在其他种种弊病，诸如价格昂贵、使用不方便、毒性高，服药繁琐、不能清除体内病毒等。

因此有必要研究一种新型的无耐药性、无抗原性、无毒性的抗艾滋病药物。最新的研究和临床报道表明溶菌酶可以应用于病毒性感染疾病，特别是对艾滋病、SARS等疾病的治疗，其生物源性和蛋白质本身特点使得其在低毒性和抗耐药性等方面更显优势，为临床用药提供了新的选择，溶菌酶具有杀菌效果强、杀菌谱广、稳定性强、易被机体所接受等优点，且还能促进免疫功能恢复，并且对人无毒、没有任何毒副作用和不良反应、无药害残留，可以作为制备抗艾滋病药物的理想选择。

虽然人溶菌酶具有独特的优越性和多种多样的药理作用效果，在临床上具有多种重要的应用价值，但天然人溶菌酶来源极其困难。人溶菌酶在母乳中含量较高，但其来源极其有限。另外虽然在抗艾滋病药物领域中逐步开展了一些有关溶菌酶应用方面的研究工作，但将重组人溶菌酶作为抗艾滋病药物的研究还有待进一步开发，其应用范围和应用量的研究少有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种重组人溶菌酶在制备抗艾滋病药物中的应用。本发明提供的重组人溶菌酶，其抗病毒机制为：溶菌酶是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pH环境下带有大量正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。本发明通过利用重组人溶菌酶的这一特性来制备抗艾滋病药物。

本发明提供了如下的技术方案：

本发明第一方面提供了一种通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，所述方法包括用人溶菌酶接触感染HIV的细胞。

在本发明的一实施例中，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤中，人溶菌酶对细胞的细胞毒指标CC₅₀大于300μg/ml。

优选地，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤中，人溶菌酶对细胞的细胞毒指标CC₅₀为340-460μg/ml

在本发明的一实施例中，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤中，人溶菌酶抑制HIV导致的细胞病变，半数抑制指标EC₅₀小于100μg/ml。

优选地，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤中，人溶菌酶抑制HIV导致的细胞病变，半数抑制指标EC₅₀为50-75μg/ml。

优选地，所述HIV-1导致的细胞病变为HIV-1诱导细胞形成合胞体。

在本发明的一实施例中，所述人溶菌酶的编码基因序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。

进一步地，所述人溶菌酶的编码基因序列编码所得的氨基酸序列如SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2所示序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。

在本发明的一实施例中，所述人溶菌酶为重组表达纯化所得人溶菌酶或合成人溶菌酶。

在本发明的一实施例中，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤包括：将搭载有所述溶菌酶的、药学上可接受的载体接触感染HIV的细胞。

优选地，所述载体还包括药学上接受的辅料，进一步地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述载体还包括抗艾滋病药物，所述抗艾滋病药物还包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合酶抑制剂或CCR5抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明的一实施例中，所述用人溶菌酶接触感染HIV的细胞包括：

1)在体外用人溶菌酶接触感染HIV的细胞；或

2)用人溶菌酶接触感染HIV患者的细胞。

本发明第二方面提供了一种第一方面所述的方法在制备诊断、预防、治疗、抑制艾滋病药物中的应用。

本发明第三方面提供了一种人溶菌酶在制备诊断、预防、治疗、抑制艾滋病药物中的应用，所述艾滋病药物包括人溶菌酶。

在本发明的一实施例中，所述的艾滋病药物在应用中，人溶菌酶对细胞的细胞毒指标CC₅₀为240～460μg/ml。

在本发明的一实施例中，所述的艾滋病药物在应用中，人溶菌酶抑制HIV导致的细胞病变，半数抑制指标EC₅₀为40～80μg/ml。

本发明的一实施例中，所述人溶菌酶的编码基因序列包括genebank登录号为No.AAC63078.1的序列，或与No.AAC63078.1所示序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。

本发明的一实施例中，所述人溶菌酶为重组表达纯化所得人溶菌酶或合成人溶菌酶。

本发明的一实施例中，所述的艾滋病药物包括搭载有所述溶菌酶的、药学上可接受的载体。优选地，所述的艾滋病药物在应用中，将搭载有所述溶菌酶的、药学上可接受的载体接触感染HIV的细胞。

在本发明的一实施例中，所述抗艾滋病药物还包括药学上接受的辅料，进一步地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明的一实施例中，所述抗艾滋病药物还包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合酶抑制剂或CCR5抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。

本发明有益之处在于：

1、本发明提供的重组人溶菌酶，解决了人溶菌酶来源少的问题，通过制备基因重组人溶菌酶，能够提供高表达、高纯度、高活性的人溶菌酶。

2、本发明提供的重组人溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药效，针对艾滋病这类复杂的免疫系统疾病具有一定优势。

3、本发明提供的重组人溶菌酶安全无毒性，易被人体吸收，不在体内残留，不产生耐药性，可解决抗生素带来的耐药性难题。

附图说明

图1为本发明实施例提供的重组人溶菌酶对C8166细胞的毒性试验结果，其中CC₅₀＝399.81±58.23μg/ml；

图2为本发明实施例提供的TDF对C8166细胞的毒性试验结果，其中CC₅₀＝274.95±45.83μM；

图3为本发明实施例提供的重组人溶菌酶对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制作用试验结果，其中EC₅₀＝62.23±12.90μg/ml；

图4为本发明实施例提供的TDF对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制作用试验结果，其中EC₅₀＝2.46±0.35nM；

图5为本发明实施例提供的重组人溶菌酶对HIV-1_IIIB直接杀伤作用(第一次实验)试验结果，其中EC₅₀＝>200μg/ml；

图6为本发明实施例提供的重组人溶菌酶对HIV-1_IIIB直接杀伤作用(第二次实验)试验结果，其中EC₅₀＝>200μg/ml。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1

检测重组人溶菌酶的抗HIV作用：

1.实验材料与方法

1.1测定药物和化合物

待测样品为重组人溶菌酶，阳性对照化合物替诺福韦酯(tenofovir disoproxilfumarate，TDF)购自大连美仑生物技术有限公司。待测样品溶解于无血清RPMI-1640中，贮存液浓度为2.5mg/ml，储存条件为：-80℃；TDF溶解于DMSO中，贮存液浓度为100mM，储存条件为：4℃。

1.2试剂和溶液

1.2.1试剂

MTT(3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl,噻唑蓝)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide)、青霉素(Penicillin)为Sigma-aldrich公司产品。SDS(Sodium dodecylsulfate，十二烷基硫酸钠)、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)为Amresco公司产品。DMF(N,N’-Dimethyl formamine,N,N-二甲基甲酰胺)为西陇化工股份有限公司产品；RPMI-1640、胎牛血清为Invitrogen公司产品。

1.2.2培养基

RPMI-1640完全培养基，含有10％胎牛血清,2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM2-巯基乙醇，100,000IU青霉素，100μg/ml链霉素。

1.3细胞和病毒

人T淋巴细胞系C8166、HIV-1实验株HIV-1_IIIB均来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)；细胞以含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1_IIIB，滴定并计算出病毒的TCID50。病毒贮存液分装后，置-80℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。

1.4HIV-1感染性滴定

HIV-1_IIIB按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μl，每孔终体积为200μl。37℃，5％CO₂培养。第3天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100μl，第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(CytopathicEffect,CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID50(50％Tissue Culture InfectionDose)。

1.5C8166细胞的毒性实验

4×10⁵/ml C8166细胞悬液100μl与不同浓度的待测重组人溶菌酶溶液混合，设3个重复孔。同时设置替诺福韦酯(TDF)作为阳性药物对照孔和不含药物的对照孔，37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波：570/630nm。计算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic Concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。

1.6对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验

将8×10⁵/ml C8166细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释的待测重组人溶菌酶溶液的96孔细胞培养板上，孵育30min后加入50μl的HIV-1_IIIB稀释上清，1300TCID50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。TDF为阳性药物对照。37℃，5％CO₂培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC₅₀(50％EffectiveConcentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。

1.7样品体外对HIV-1_IIIB的直接杀伤活性

将不同稀释度的待测重组人溶菌酶溶液100μl与100μl HIV-1_IIIB上清在96孔板中混合，同时设置0.5％H₂O₂作为阳性药物对照。室温下孵育10min、30min和60min，吸1μl上述混合液到已加好4×10⁴/孔的C8166细胞的96孔板中，37℃,5％CO₂培养箱中培养三天。倒置显微镜下(100×)计数合胞体个数，计算EC₅₀值。

1.8计算公式

根据实验结果，采用Origin2016绘制折线图，按Reed&Muench法计算出样品抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)，50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为：TI＝CC₅₀/EC₅₀。

a)细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

b)HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

2结果

2.1重组人溶菌酶对C8166细胞的毒性实验

本实验用MTT方法测定了待测样品对人T淋巴细胞系细胞C8166的体外细胞毒性作用。

结果表明：二次重复试验重组人溶菌酶对C8166细胞的CC₅₀为399.81±58.23μg/ml；二次重复试验TDF对C8166细胞毒性作用的CC₅₀为274.95±45.83μM(表1、2；图1、2)。

表1.重组人溶菌酶对C8166细胞的毒性作用的实验数据

表2.阳性对照TDF对C8166细胞的毒性作用的实验数据

2.2体外抗HIV-1实验结果

2.2.1重组人溶菌酶与阳性对照TDF对HIV-1IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验

本实验选用HIV-1实验株HIV-1_ⅢB感染C8166细胞，在药物存在或不存在下培养3天后，在倒置显微镜下计数HIV-1诱导细胞形成合胞体细胞的数量，计算样品抗HIV-1作用。

结果显示，二次重复试验重组人溶菌酶抑制HIV-1_ⅢB诱导C8166细胞形成合胞体实验的EC₅₀为62.23±12.90μg/ml；二次重复试验对照药物TDF的EC₅₀为2.46±0.35nM(表3、4；图3、4)。

表3.重组人溶菌酶对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验数据

表4.阳性对照TDF对HIV-1IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验数据

2.2.2重组人溶菌酶直接杀HIV-1作用

杀病毒实验是指在病毒感染细胞前，药物与HIV-1直接在室温或者37℃孵育一定时间，然后加入到靶细胞中。用来检测药物对病毒是否能使病毒失活。

结果表明：重组人溶菌酶无直接杀病毒作用，在10min、30min和60min三个时间点均没有表现出杀灭HIV-1的作用。阳性对照0.05％H₂O₂有很强的杀灭HIV-1作用。

表5.重组人溶菌酶对HIV-1IIIB直接杀伤作用(第一次实验)

表6.重组人溶菌酶对HIV-1IIIB直接杀伤作用(第二次实验)

3实验结果汇总

表7化合物体外细胞毒性和抗HIV-1活性结果汇总

上述结果表明重组人溶菌酶对C8166细胞的毒性比较小，CC₅₀为399.81±58.23μg/ml；对HIV-1_ⅢB感染C8166细胞形成合胞体抑制作用，EC₅₀为62.23±12.90μg/ml，TI为6.42；重组人溶菌酶在10min、30min和60min三个时间点均没有表现出能直接杀灭HIV-1的作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州奇龙生物科技有限公司

<120> 重组人溶菌酶在制备抗艾滋病药物中的应用

<130> 2017

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggtctttg aaaggtgtga gttggccaga actctgaaaa gattgggaat ggatggctac 60

aggggaatca gcctagcaaa ctggatgtgt ttggccaaat gggagagtgg ttacaacaca 120

cgagctacaa actacaatgc tggagacaga agcactgatt atgggatatt tcagatcaat 180

agccgctact ggtgtaatga tggcaaaacc ccaggagcag ttaatgcctg tcatttatcc 240

tgcagtgctt tgctgcaaga taacatcgct gatgctgtag cttgtgcaaa gagggttgtc 300

cgtgatccac aaggcattag agcatgggtg gcatggagaa atcgttgtca aaacagagat 360

gtccgtcagt atgttcaagg ttgtggagtg taa 393

<210> 2

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly

1 5 10 15

Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala

20 25 30

Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp

50 55 60

Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala

85 90 95

Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp

100 105 110

Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys

115 120 125

Gly Val

130

Claims

1.一种通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其特征在于，所述方法包括使人溶菌酶接触感染HIV的细胞。

2.如权利要求1所述的通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其特征在于，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤中，人溶菌酶对细胞的细胞毒指标CC₅₀大于300μg/ml。

3.如权利要求1所述的通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其特征在于，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤中，人溶菌酶抑制HIV导致的细胞病变，半数抑制指标EC₅₀小于100μg/ml。

4.如权利要求1所述的通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，所述人溶菌酶的编码基因序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。

5.如权利要求1所述的通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其特征在于，所述人溶菌酶为重组表达纯化所得人溶菌酶或合成人溶菌酶。

6.如权利要求1所述的通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其特征在于，所述的用人溶菌酶接触感染HIV的细胞步骤包括：将搭载有所述人溶菌酶的、药学上可接受的载体接触感染HIV的细胞。

7.如权利要求1所述的通过人溶菌酶抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其特征在于，所述的人溶菌酶接触感染HIV的细胞包括：

1)在体外用人溶菌酶接触感染HIV的细胞；或

2)用人溶菌酶接触感染HIV患者的细胞。

8.一种如权利要求1所述的方法在制备诊断、预防、治疗、抑制艾滋病药物中的应用。

9.一种人溶菌酶在制备诊断、预防、治疗、抑制艾滋病药物中的应用，所述艾滋病药物包括人溶菌酶。