CN103360464A - 多肽、编码该多肽的dna分子、载体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多肽、编码该多肽的DNA分子、载体、制备方法及应用。该多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌、临床耐药病原菌均具有广谱高效抑制作用，同时能促进组织修复与创面愈合，可用于制备治疗或预防细菌、厌氧菌特别是耐药细菌导致的非特异性感染、特异性感染的相关疾病的药物与促进组织修复和伤口愈合的药物。

Description

多肽、编码该多肽的DNA分子、载体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多肽、编码该多肽的DNA分子、载体、制备方法及应用。
背景技术
在各类创伤中，无论是烧伤、冷伤、挤压伤、战创伤、动物咬伤、核放射伤、及复合伤等各类创伤，还是开放伤或闭合伤的临床治疗中，防治感染和促进组织修复和创伤愈合始终是创伤治疗中的永恒的主题。
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环或局部环境中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染或局部感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分可有感染性休克和迁徙性病灶。尤其是老人、儿童、有慢性病或免疫功能低下者、治疗不及时有并发症者，可发展为败血症或者脓毒血症。
人体感染的致病菌或条件致病菌种类很多，可侵入人体不同部位的组织器官，引起局部组织或全身炎症反应及多种病变。
在非特异性的感染中，也就是化脓性感染中，常见的有疖、痈、丹毒、急性淋巴管炎、急性淋巴结炎、甲沟炎、脓性指头炎、手指侧化脓性腱鞘炎、滑囊炎、掌深间隙感染、脓血症、菌血症等，致病菌有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等，可由单一病菌导致感染，也可以由几种细菌共同致病形成混合感染，所以临床用药的广谱性显得特别重要。
痤疮也是一种非特异性感染，为青少年常见病、多发病，中年亦有发生。临床表现为白头痤疮、黑头痤疮、炎性丘疹、继发性脓疮、囊肿或结节、发痛、发痒如若感染可留下疤痕，影响容颜和身心健康。现己知许多发病因素及环节在痤疮发生、发展及转归中起关键作用。其中最为重要的原因是毛囊及皮脂腺单位中的微生物作用，首先是厌氧的丙酸痤疮杆菌，其次为需氧的表皮及金黄色葡萄球菌等优势化脓菌。细菌感染在痤疮的发生中是重要发病因素。
特异性感染是指结核、破伤风、气性坏疽、炭疽、百日咳、流行性脑脊髓炎、淋病、伤寒、细菌性痢疾、白喉等是分别由结核杆菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、炭疽杆菌、百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、白喉棒状杆菌引起的独特病变。特异性感染在致病菌、病程演变及治疗等方面与一般的感染不同，这是传染病学研究的主要内容。
促进伤口愈合，是创伤学中与抗感染同样重要的二大问题之一。近年来，现代细胞生物学和分子生物学研究的介入，及大量的实验观察到了创伤愈合过程中的细胞活动及其影响因素，认为多种生长因子参与调控创伤愈合过程，其可能的机理也十分复杂。
慢性难愈合感染创面，是体表慢性难愈合创面中感染了细菌的创面的统称。体表慢性难愈合创面，是一种由系列创伤和疾病所致。发生在体表的长期未愈合的创面，主要包括创伤性溃疡、下肢静脉性溃疡、压迫性溃疡以及糖尿病溃疡。由于发生在体表，且病程长，外观影响大、并发症多及治疗费用极其昂贵等特点，因此对患者生活和质量产生重大影响，是现代社会必须面对的重要问题。
在体表慢性难愈合创面中有87%的创面有细菌感染，主要为金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。由于患者治疗时间长，其创面细菌很大部分产生了不同程度的耐药性，特别是难愈合创面感染MRSA、MRCNS、耐红霉素化脓性链球菌、产ESBLs大肠埃希菌、铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株(IPM-R株)时，由于临床缺乏有效的治疗药物，可能会给病人造成截肢的严重后果。
湿疹（eczema）是由多种复杂的内、外因素引起的一种具有多形性皮损伤和易有渗出倾向的皮肤炎症性反应，病因复杂多难以确定。自觉症状瘙痒剧烈。病情易反复，并伴有细菌的继发感染，可迁延多年不愈。
就防治伤口感染而言，常用药物是抗生素，但抗生素滥用所致病原菌的耐药性已使许多创伤无药可用，导致病人出现脓血症、菌血症、其他器官严重损伤的全身感染，或在体表形成慢性难愈合感染创面。抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点。耐药菌另一个危害是可以在不同地区、国家之间的人群之间传播。肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的常见病源菌，近年来肺炎链球菌对抗生素耐药性呈上升趋势，并已出现多重耐药菌株，是临床感染控制中棘手的难题。当前许多抗细菌感染治疗药物大部分疗效不佳是由于耐药细菌特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染所导致。因此，急需发现新的抗菌物质。
近年来，生物活性抗菌肽的研究已成为国际药学界抗生素发展的前沿科学，目前已经有1300多种抗菌肽被分离鉴定，其共同特点为：分子量小（12-100个氨基酸残基）、多聚阳离子型、两亲建构。这些被称为肽类抗生素的生物活性物质，因为具有纯生物物质、稳定性强、抗菌力强、广谱、无抗药耐药性、无毒副作用和“三致”作用特点，已被认为是现有抗生素的最佳替代品。抗菌活性多肽Ctryamp或其结构同源多肽是从西藏特里豚蝎获得的天然抗菌肽分子，由于产生机制、杀菌机制和作用方式与传统抗生素不同，可很快杀灭微生物（包括使用由传统抗生素产生的耐药菌）而自身不产生耐药性，且肽水解后的氨基酸有利于皮肤组织的生成。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种多肽、编码该多肽的DNA分子、载体、制备方法及应用。该西藏特里豚蝎抗菌活性多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌、临床耐药病原菌均具有广谱高效抑制作用，同时能促进组织修复与创面愈合，可用于制备治疗或预防细菌、厌氧菌特别是耐药细菌导致的非特异性感染、特异性感染的相关疾病的药物与促进组织修复和伤口愈合的药物。本发明提供的以广谱抗菌活性多肽为有效成分的预防细菌感染与促进组织修复的添加剂（如化妆品添加剂、保健品添加剂、饲料添加剂等），用于预防细菌感染与促进组织修复。预防细菌感染效果好、促进皮肤组织修复佳、无副作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提拱了一种多肽，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明公开了一组西藏特里豚蝎Ctryamp多肽的同源结构多肽，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。根据Ctryamp的成熟肽序列（FIRIARLLRIF），使用在线NPSserver［DSC法（Discrimination of proteinSecondary structure Class）］对其进行二级结构预测，并利用软件AHTHEPROT2000显示其二级结构图像。结果表明，Ctryamp含有100%的α-Helix结构，具有典型的两亲性（amphiphilic）α-Helix结构，含有大量带净正电荷的碱性残基（Arg）。根据多肽序列的螺旋图，然后对Ctryamp多肽序列FIRIARLLRIF进行大量点突变，发现FIX1IAX2LLX3IF（X1，X2和X3为His、Arg和Lys的3个碱性氨基酸中任意一个氨基酸）（SEQ ID NO:1）序列并不影响其双亲性的特征（表1）。因此，本发明提供了一组西藏特里豚蝎Ctryamp多肽的同源结构多肽（SEQ ID NO：1）。
在本发明的一些实施例中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
作为优选，取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
作为优选，缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
作为优选，添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸。
作为优选，其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。
本发明具体公开了一种西藏特里豚蝎Ctryamp多肽，其序列为SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。Ctryamp的前体组织形式编码68个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽（23个残基）、成熟肽（11个残基）和前体肽（34个残基）。如图1所示，cDNA序列下方为推断的对应氨基酸序列；信号肽氨基酸以斜体标记；成熟肽氨基酸为阴影部分氨基酸；下划线部分氨基酸为C端前体肽。因此，本发明提供一个西藏特里豚蝎抗菌肽：FIRIARLLRIF（SEQID NO:2）。
本发明还提供了多肽在制备抗菌剂中的应用；多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
在本明的一些实施例中，抗菌剂用于抑制细菌。
在本发明的一些实施例中，细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
抗菌结果表明合成多肽Ctryamp及其结构同源多肽对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌CCTCCAB94012和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌CCTCCAB94004的生长具有高效抑制作用。在6.25μg/mL时，Ctryamp多肽及其结构同源多肽对大肠杆菌CCTCCAB94012的抑制率就可以达到100%，而在6.25μg/mL时，对金黄色葡萄球菌CCTCCAB94004的抑制率就可以达到100%（表2）。Ctryamp多肽对革兰氏阴性菌，特别是致病性大肠杆菌和铜绿假单胞菌增殖具有高效抑制作用（表3），Ctryamp多肽对铜铝价担保杆菌的最小抑菌浓度为8-16μg/mL。抗菌结果还表明Ctryamp多肽对革兰氏阳性细菌的增殖、厌氧菌的生长具有高效抑制作用（表3）。
在本发明的一些实施例中，革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分枝杆菌属、厌氧细菌或棒状杆菌属。抗菌结果表明合成Ctryamp多肽对临床耐药细菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌、耐红霉素化脓性链球菌、耐青霉素类和头孢类，耐单酰胺类，对喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类有交叉耐药的产ESBLs大肠埃希菌、耐亚胺培南的铜绿假单胞菌(IPM-R株)）具有高效抑制作用（表3）。
抗菌结果表明化学合成Ctryamp多肽对引起特异性感染的细菌（包括百日咳鲍特菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌、伤寒沙门菌和白喉棒状杆菌）具有高效抑制作用（表3）。
在本发明的另一些实施例中，革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、肠道杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、鲍特菌属或嗜血杆菌属。
本发明还提供了多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用；多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
在本发明的一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用中细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
在本发明的一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用中革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分枝杆菌属、厌氧细菌或棒状杆菌属。
在本发明的另一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用中革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、肠道杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、鲍特菌属或嗜血杆菌属。
在本发明的一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用中感染为非特异性感染和/或特异性感染。
在本发明的一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用中，非特异性感染为疖、痈、丹毒、急性淋巴管炎、急性淋巴结炎、甲沟炎、脓性指头炎、手指侧化脓性腱鞘炎、滑囊炎、掌深间隙感染、脓血症、菌血症。
在本发明的一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用中，特异性感染为结核、破伤风、气性坏疽、炭疽、百日咳、流行性脑脊髓炎、淋病、伤寒、细菌性痢疾或白喉。
在本发明的一些实施例中，感染为MRSA、MRCNS、耐红霉素化脓性链球菌、产ESBLs大肠埃希菌、铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R株）引起的感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为金黄色葡萄球菌引起的局部感染、全身感染或毒素性疾病。
在本发明的另一些实施例中，感染为凝固酶阴性葡萄球菌引起的泌尿系统感染、败血症或术后感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为链球菌引起的化脓性炎症、风湿热与急性肾小球肾炎、猩红热、细菌性肺炎、龋齿、亚急性细菌性心内膜炎或新生儿感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为肺炎链球菌引起的大叶性肺炎、气管炎、中耳炎、脑膜炎、胸膜炎、心内膜炎或败血症。
在本发明的另一些实施例中，感染为无乳链球菌引起的孕妇产褥期脓毒血症、新生儿脑膜炎、产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染或骨髓炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为肠球菌引起的心血管系统感染或尿路感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为屎肠球菌引起的尿路感染、化脓性腹部感染、败血症、心内膜炎或腹泻发烧。
在本发明的另一些实施例中，感染为粪肠球菌引起的心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染或伤口感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为淋病奈瑟菌引起的淋病。
在本发明的另一些实施例中，感染为埃希菌引起的泌尿系统感染、肠道外的化脓性感染、肠道感染或出血性结肠炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为志贺氏菌引起的细菌性痢疾。
在本发明的另一些实施例中，感染为沙门菌引起的伤寒与副伤寒。
在本发明的另一些实施例中，感染为肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支气管炎泌尿道感染、创伤感染、脑膜炎或腹膜炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为产酸克雷伯菌引起的抗生素相关性出血性结肠炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为枸橼酸杆菌引起的肺炎或脑膜炎；
在本发明的另一些实施例中，感染为阴沟肠杆菌引起的皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸道感染、腹部感染、中枢神经系统感染、眼部感染、伤口感染、心内膜炎或败血症；
在本发明的另一些实施例中，感染为沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、菌血症或手术后感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为破伤风梭菌引起的破伤风。
在本发明的另一些实施例中，感染为产气荚膜梭菌引起的气性坏疽或食物中毒等临床感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为无芽孢厌氧菌引起的腹部感染、女性生殖道、盆腔感染或菌血症。
在本发明的另一些实施例中，感染为白喉棒状杆菌引起的白喉。
在本发明的另一些实施例中，感染为痤疮棒状杆菌引起的痤疮、粉刺。
在本发明的另一些实施例中，感染为铜绿假单胞菌引起的伤口感染、烧伤组织感染等局部化脓性感染、肺部感染、泌尿道感染、中耳炎、角膜炎、心膜炎或败血症。
在本发明的另一些实施例中，感染为鲍曼不动杆菌引起的呼吸道感染、菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染或呼吸机相关性肺炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为百日咳鲍特菌引起的百日咳。
在本发明的另一些实施例中，感染为流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌引起的婴儿及孩童菌血病症、急性细菌性脑膜炎、蜂窝组织炎、骨髓炎或关节感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为结核分枝杆菌引起的结核病。
在本发明的另一些实施例中，感染为慢性难愈合感染创面。
在本发明的另一些实施例中，多肽在制备预防和/或治疗湿疹的药物中的应用。
本发明还提供了多肽在制备促进组织修复和/或伤口愈合的药物中的应用；多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明还提供了多肽在制备治疗烧伤、冷伤、挤压伤、战创伤、动物咬伤、核放射伤或复合伤的药物中的应用；多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明还提供了一种编码上述多肽的DNA分子，其具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Ⅱ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
本发明构建高质量西藏特里豚蝎毒腺组织cDNA文库，具体包括蝎毒腺总RNA的分离和mRNA纯化，cDNA的第一链和第二链合成，双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化，获得蝎毒腺组织cDNA文库。在构建文库的基础上，随机挑选3000克隆子进行测序，序列分析发现第2007克隆子为一个新的西藏特里豚蝎抗菌肽基因，命名为Ctryamp，其序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列：ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa（图1）。
本发明还提供了一种重组载体，其含有上述DNA分子。
本发明还提供了一种多肽的制备方法，包括以下步骤：
获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；
取DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导转化体表达蛋白，经分离纯化，即得；
其中(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中，多肽的制备方法中DNA分子为具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Ⅱ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。
作为优选，原核系统宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种治疗创面感染和/或促进组织修复愈合的药物制剂，由多肽及药学上可接受的辅料组成；其中，多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。在本发明的一些实施例中，多肽占药物制剂的质量百分含量为0.01%～1.5%。
在本发明的一些实施例中，辅料包括羟丙甲基纤维素，羟丙甲基纤维素占所述药物制剂的质量百分含量为7.0%。
作为优选，以重量百分数计，本发明提供的药物制剂由多肽0.01～1.5%、丙三醇5%、羟丙甲基纤维素7%、乙醇酸0.1%、EDTA0.1%，余量为水组成。
作为优选，本发明提供的药物制剂为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、擦剂、膜剂、贴剂、膏剂、软膏剂、橡胶膏剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂、滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、气雾剂、吸入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、灌肠剂或栓剂。
本发明还提拱了多肽在制备饲料添加剂、保健品添加剂、食品添加剂、化妆品添加剂中的应用；多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明提拱了一种多肽，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。抗菌结果表明合成多肽Ctryamp及其结构同源多肽对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌CCTCCAB94012和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌CCTCCAB94014的生长具有高效抑制作用。在6.25μg/mL时，Ctryamp多肽及其结构同源多肽对大肠杆菌CCTCCAB94012的抑制率就可以达到100%，而在6.25μg/mL时，对金黄色葡萄球菌CCTCCAB94014的抑制率就可以达到100%。进一步抗菌结果表明合成Ctryamp多肽对革兰氏阴性菌，特别是致病性大肠杆菌和铜绿假单胞菌增殖具有高效抑制作用（表3），Ctryamp多肽对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为8-16μg/mL。抗菌结果还表明化学合成Ctryamp多肽对革兰氏阳性细菌的增殖具有高效抑制作用（表3）。抗菌结果表明化学合成Ctryamp多肽对厌氧菌的生长具有高效抑制作用（表3）。Ctryamp多肽对临床耐药细菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌、耐红霉素化脓性链球菌、耐青霉素类和头孢类，耐单酰胺类，对喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类有交叉耐药的产ESBLs大肠埃希菌、耐亚胺培南的铜绿假单胞菌(IPM-R株)）具有高效抑制作用（表3）。Ctryamp多肽对引起特异性感染的细菌（包括百日咳鲍特菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌、伤寒沙门菌和白喉棒状杆菌）具有高效抑制作用（表3）。
本发明还提供了外用凝胶抗菌制剂。抗菌结果表明其抗菌制剂对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、厌氧菌、及临床耐药细菌具有高效抑制作用。其对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌CCTCCAB94012的最小抑菌浓度MIC为6.25μg/mL，对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌CCTCCAB94004的最小抑菌浓度MIC为6.25μg/mL，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）最小抑菌浓度MIC为6.25μg/mL、对铜绿假单孢菌的最小抑菌浓度MIC为8μg/mL、对产气荚膜梭菌最小抑菌浓度MIC为25μg/mL（表4）（按照制剂中有效成分抗菌多肽Ctryamp多肽或其结构同源多肽计算）。
选用来医院治疗的各种外伤患者、体表慢性难愈合感染创面病人，所有病人随机分为实验组和对照组。实验组用制备的外用Ctryamp多肽抗菌凝胶制剂，对照组常规用药（给予5%的硫磺霜）。对于创面细菌感染，治疗组82例患者创面均一期愈合，未出现感染及创面延迟愈合，未出现过敏反应及其他不良反应。根据卫生部1988年颁布的抗菌药物临床试验技术标准分为四级：痊愈、显效，有效，无效。结果治疗组82例中显效80例，有效2例，有效率100%。对照组74例中显效50例，有效20例，无效4例，有效率95%，两组经统计学F检验，p＜0.05。两组促进创面愈合时间比较见表5，经过统计学F检验，p＜0.05。临床治疗结果表明，本发明提供的外用凝胶能有效的预防和治疗细菌感染，特别对MRSA和铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R株）有独特的杀菌作用，同时能显著的促进伤口的修复愈合。
痤疮治疗的临床观察，选择痤疮、青春痘、粉刺患者258例为对象，记录实验组（用Ctryamp多肽外用抗菌凝胶制剂治疗）、对照组两组患者面部痤疮皮损数目、变化和不良反应。按痤疮各种损害（粉刺、炎性疤疹、脓疮、结节、囊肿）减少的总百分率统计疗效。抗痤疮丙酸杆菌的抗菌制剂实验组有效率达到97%。而常规用药对照组有效率为41%。两组疗效差异有高度显著性，说明实验组对治疗痤疮疗效优于对照组。
湖北省人民医院烧伤整形外科用本发明的Ctryamp多肽外用抗菌凝胶制剂抗治疗了22例慢性湿疹患者，实验结果显示，蝎肽抗菌凝胶对湿疹有独特的疗效，治愈率100%，临床随访无复发，而实验组临床症状减轻，但随访复发严重。
本发明还提供了以传统中药材蝎的活性多肽为有效成分配制的更为有效的治疗创面细菌感染和痤疮、湿疹的新药剂，用于治疗创面细菌感染、体表慢性难愈合感染创面、痤疮、湿疹与促进组织修复和伤口愈合，治疗效果显著。本发明也涉及了一种预防细菌感染与促进组织修复的添加剂，用于制备预防细菌感染与促进组织修复的化妆品、保健品、饲料等，预防细菌感染与促进皮肤组织修复效果显著。本发明所采用的原料均为传统中药材蝎的活性成分，无毒副作用，不留后遗症。此药物或者添加剂能够真正达到见效快、无副作用、治愈后不复发的效果。
附图说明
图1示本发明提供的西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽Ctryamp基因及其氨基酸序列；
图2西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽Ctryamp的纯度；
图3西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽Ctryamp质谱。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽、编码该多肽的DNA分子、载体、制备方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽基因的制备
A：西藏特里豚蝎毒腺总RNA的提取（Trizol LS一步法:Trizol LS购自美国Invitrogen）
①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入l0mL TRIZOL试剂混匀，室温(20-25℃，以下相同)放置5分钟；②然后加入2mL氯仿混合15秒，室温放置2-3分钟，4℃下12000g离心15分钟；③取水相加1倍体积异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000g离心10分钟得RNA沉淀；④沉淀用5m 175％乙醇洗涤，7500g离心5分钟；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC处理水，55-60℃保温10分钟以彻底溶解RNA。整个过程参照TRlZOL(Total RNAIsolation)Reagent Kit推荐方法进行。制备的蝎毒腺总RNA采用甲醛变性凝胶电泳检测其质量。得到了高质量的蝎毒腺总RNA。
B:mRNA的分离纯化
采用PolyA Tract mRNA分离系统（Promega,USA）分离和纯化mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)与mRNA 3’端poly(A)尾的互补配对特性，用生物素标记Oligo(dT)，通过它与mRNA 3’端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo(dT)/mRNA杂交体，最后用无RNA酶的灭菌双蒸水（ddH2O）将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。①样品的制备：将RNA加入到含有32μL β-巯基乙醇的800μL的结合缓冲液中。②探针的退火：取250pM浓度Oligo(dT)5μL，加蒸馏水至50μL；加入1.6mL预热的dilution buffer（dilution buffer已加入32μL β-巯基乙醇），与RNA混匀，70℃温育5分钟。③磁珠的活化：取1.2mL的磁珠SA-PMPS(购自美Promega)于1.5mL的离心管中；用0.5×SSC重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS3次。④mRNA的获取：将70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟放磁架上吸附磁珠，弃上清液；2mL的0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC；加入无RNA酶的ddH2O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心（12000g×3分钟）或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA。通过电泳和紫外测定mRNA的浓度和纯度。⑤mRNA的沉淀：将④获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，mRNA将用于cDNA的合成。
C：第一链cDNA合成
①在1.5mL Ep管中加入2μL Not I Primer-adapter和6μL mRNA（含3μgmRNA），70℃温育10min，迅速放于冰上，离心后，加入下列成分：4μL 5Xfirst strand buffer；2μL 0.1M DTT；1μL 10mM dNTPs；1μL H2O。轻轻混匀后离心，37℃放至2min；②加入5μL逆转录酶，混匀后取2μL，加1μL[α-32P]dCTP（4μCi）（示踪管）。与上述反应组分（样品管）同时37℃温育1h，然后放入冰上终止反应；③对于示踪管，依次加入43μL 20 mM EDTA和5μL酵母tRNA，混匀后，分别取两份10μL点于两张滤膜上，1份用10%TCA洗3次，每次5min，95%乙醇洗1次，空气干燥后，放入1.5mL闪烁液中（为1#样品）；另1份空气干燥后，放入1.5mL闪烁液（为2#样品）。另30μL示踪液，加1.5μL7.5M醋酸氨（NH4Oac）和90μL无水乙醇（-20℃），混匀后立即14,000rpm离心20min，弃上清，加入0.5mL70%无水乙醇（-20℃），14,000rpm离心2min，弃上清，37℃干燥10min让乙醇挥发,溶于10μL TEN溶液，加入10μL 2X加样缓冲液，取10μL用于碱性凝胶电泳。用[α-32P]dCTP标记λDNA HindIII片段作分子量标记；④混匀后室温下放置15min，加入2μL0.2M EDTA终止反应。取6μL反应液和6mL 2X碱性电泳缓冲液混匀，电泳5h后，用7% TCA浸泡20min，直至溴酚兰变黄。然后用卫生纸吸干（8h左右），进行放射自显影；⑤对于样品管，用于第二链的合成。
Figure BDA00003524652800161
D：第二链cDNA合成
①冰上在样品管中依次加入下列成分；②轻轻混匀后，16℃温育2h；③加入2μL（10units）T4DNA聚合酶，继续16℃反应5min；④转入冰上，加入10μL 0.5 M EDTA；⑤加入等体积（150μL）酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），彻底涡旋后，室温下14,000rpm离心5min。将水相（140μL）转入另一1.5mLEp管；⑥加入70μL的7.5M NH4OAc和0.5mL无水乙醇（-20℃），涡旋后，室温下14,000rpm离心20min；⑦弃上清，加入0.5mL70%乙醇（-20℃），同上离心2min。弃上清，37℃干燥10min。
Figure BDA00003524652800162
Figure BDA00003524652800171
E：双链cDNA与Sal I衔接头的连接
①用25μL灭菌水溶解实D的cDNA样品，然后按下表依次加入；②轻轻混匀，16℃反应过夜（约20h）。③用酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）抽提和NH4Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。
Figure BDA00003524652800172
F：Not I消化双链cDNA
①将E的样品溶于41μL，然后按下表依次加入；②混匀后，37℃温育2h；③用酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉淀，37℃干燥10min。④溶于70μL TEN，取1μL用于定量，其余-20℃保存备用。
Figure BDA00003524652800173
G：去除双链cDNA分子中的过量Sal I衔接头和酶切小片段
用nucleon extraction and purification kit(Amersham,USA)去除过量Sal I衔接头和酶切小片段。①室温下悬浮树脂，然后取600μL加于离心柱中，2000rpm离心10s，去掉液体。在树脂中央加入40μL上述cDNA溶液。同上离心；②收集洗脱液用于连接反应。
H：双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化
①在1.5mL Ep管中依次加入下列成分；②室温下反应16h；③在②反应液中依次加入下列成分:5.0μL yeast tRNA,12.5μL 7.5 M NH4Oac，70μL无水乙醇（-20℃）。涡旋混匀后立即14000离心20min；④沉淀用70%乙醇（-20℃）洗涤，37℃干燥后溶于4μL；⑤取2μL电击转化50μL E.coli K12 MC1061。用PCR方法鉴定文库的质量，正向引物：5’TCGACCCACGCGTCCG3’（按SalI衔接头序列设计）；反向引物：5’GAGCGGCCGCCCT153’（按NotI引物-衔接头的序列设计）。
Figure BDA00003524652800181
I：随机测序策略筛选cDNA文库
随机从构建好的西藏特里豚蝎毒腺cDNA文库中挑选3000克隆子，送上海三博公司测序。序列录入软件为BioEdit v4.5.8(Tom Hall,1999)，同源性比较和信号肽切割位点预测软件分别为CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.,1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.,Switzerland)。序列分析表明克隆子2007为一个全新的抗菌肽基因，命名为Ctryamp。其序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列：ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa（图1）。Ctryamp的的前体组织形式编码68个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽（23个残基）、成熟肽（11个残基）和前体肽（34个残基）。因此，本发明提供一个西藏特里豚蝎抗菌肽：FIRIARLLRIF（SEQ ID NO:2）。
实施例2 Ctryamp多肽的结构分析及其同源结构双亲性多肽
根据实施例1提供的SEQ ID NO:2所示的Ctryamp的成熟肽序列（FIRIARLLRIF），使用在线NPSserver［DSC法（Discrimination of proteinSecondary structure Class）］对其进行二级结构预测，并利用软件AHTHEPROT2000显示其二级结构图像。结果表明，Ctryamp含有100%的α-Helix结构，具有典型的两亲性（amphiphilic）α-Helix结构，含有大量带净正电荷的碱性残基（Arg）。根据多肽序列的螺旋图，然后对Ctryamp多肽序列FIRIARLLRIF进行大量点突变，发现FIX1IAX2LLX3IF（X1，X2和X3为His、Arg和Lys的3个碱性氨基酸中任意一个氨基酸）（SEQ ID NO:1）序列并不影响其双亲性的特征（表1）。因此，本发明提供了一组西藏特里豚蝎Ctryamp多肽的同源结构多肽（SEQ ID NO：1）。
表1 西藏特里豚蝎Ctryamp多肽及其结构同源多肽
Figure BDA00003524652800191
Figure BDA00003524652800201
实施例3 多肽及其同源结构双亲性多肽
根据实施例1提供的Ctryamp(FIRIARLLRIF)及其同源结构双亲性多肽的氨基酸序列(FIX1IAX2LLX3IF，实施例2提供)进行人工合成。固相化学合成的办法获得了高纯度的Ctryamp多肽（如图2和图3所示）及其同源结构双亲性多肽（表1）。
实施例4 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的抑菌试验
对革兰氏阴性菌的抑制试验：
96孔板培养法：①分别将铜绿假单胞菌（包括标准株、临床分离株和耐药株）、大肠埃希菌（包括标准株CCTCC AB94012和ATCC25922、临床分离株和耐药株）、肺炎克雷伯菌、居泉沙雷菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、百日咳鲍特菌和流感嗜血杆菌培养到OD600＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的实施例1提供的Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例2提供），达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照和阳性对照孔分别加入20μl液体培养基和20μl的卡那霉素(终浓度为20μg/ml)；②37℃培养12小时后，用酶标仪检测96孔板中各孔的在600nm波长处的吸光值；③确定药物Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复试验的前①②步骤。最终确定抗菌肽Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对细菌的最低抑制浓度。
实施例1提供的Ctryamp多肽对对铜绿假单胞菌的MIC为8μg/ml、对大肠杆菌的MIC为6.25-12.5μg/ml、对肺炎克雷伯菌的MIC为25μg/ml、对居泉沙雷的MIC为12.5μg/ml、对沙门氏菌的MIC为12.5μg/ml、对志贺菌的MIC为6.25μg/ml、对鲍曼不动杆菌的MIC为6.25μg/ml、对脑膜炎奈瑟菌的MIC为6.25μg/ml、对淋病奈瑟菌的MIC为6.25μg/ml、对百日咳鲍特菌的MIC为3.13μg/ml、对流感嗜血杆菌的MIC为3.13μg/ml。对变形杆菌的MIC为6.25μg/ml。
对革兰氏阳性菌的抑制试验：
96孔板培养法：①分别将金黄色葡萄球菌（包括标准株CCTCC AB94004和ATCC25923、临床分离株）、甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSSCNS)、溶血性链球菌（包括标准株、临床分离株和耐药株）、肠球菌、白喉棒状杆菌、痤疮棒状杆菌培养到OD600＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的实施例1提供的Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例2提供），达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照和阳性对照孔分别加入20μl液体培养基和20μl的青霉素(终浓度为50μg/ml)；②37℃培养12小时后，用酶标仪检测96孔板中各孔的在600nm波长处的吸光值；③确定药物Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复试验的前①②步骤。最终确定抗菌肽Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对细菌的最低抑制浓度。
Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对金黄色葡萄球菌的MIC为1.63-6.25μg/ml、Ctryamp多肽对甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌的MIC为3.13-12.5μg/ml、对溶血性链球菌的MIC为8-16μg/ml、对白喉棒状杆菌的MIC均为3.13μg/ml、对痤疮棒状杆菌的MIC为3.13μg/ml、对肠球菌的MIC为6.25μg/ml。
对耐甲氧西林葡萄球菌的抑制试验：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCNS)：江苏省人民医院临床检验中心分离获得临床株、中南大学。
96孔板培养法：①将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌培养到OD600＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的实施例1提供的Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例2提供），达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照和阳性对照孔分别加入20μl培养基和20μl的万古霉素(终浓度为12μg/ml)；②37℃培养12小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在600nm波长处的吸光值；③确定药物Ctryamp多肽的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复试验的前①②步骤。最终确定抗菌肽Ctryamp多肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的最低抑制浓度为3.13-12.5μg/ml，或4-8μg/ml（第三方试验结果）。
对厌氧菌的抑制试验：
96孔板培养法：①分别将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌培养到OD600＝0.8时，稀释400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分别向多孔加入20μl经等比稀释的实施例1提供的Ctryamp多肽，达到终浓度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。阴性对照和阳性对照孔分别加入20μl液体培养基和20μl的青霉素(终浓度为400μg/ml)；②37℃培养12小时后，用酶标仪检测96孔板中各孔的在600nm波长处的吸光值；③确定药物Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复试验的前①②步骤。最终确定抗菌肽Ctryamp多肽对细菌的最低抑制浓度。
Ctryamp多肽对破伤风梭菌的MIC为25μg/ml、对产气荚膜梭菌的MIC为25μg/ml、对脆弱类杆菌的MIC为12.5μg/ml。
抗菌试验结果见表2、3、4。
表2 西藏特里豚蝎Ctryamp多肽及其结构同源多肽对标准大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC
表3 西藏特里豚蝎Ctryamp多肽对革兰氏阴性和阳性细菌、厌氧菌、临床耐药细菌的抑菌效果
Figure BDA00003524652800232
Figure BDA00003524652800241
Figure BDA00003524652800251
注：★表示该菌的最小抑菌浓度试验结果为委托第三方试验进行。
实施例4：Ctryamp多肽抗菌制剂的制作
1）处方：实施例1制备的西藏特里豚蝎抗菌多肽Ctryamp 0.01-1.5g、丙三醇5g、羟丙甲基纤维素7g、乙醇酸0.1g、EDTA0.1g，无菌水加至100g。
2）制备：将羟丙甲基纤维素洒于液面（60mL左右），隔夜后成为凝胶剂基质，静置后真空脱泡，将乙醇酸与其余药物混匀，逐渐加入到浆料中混匀，避免剧烈搅拌混入过多气泡。分装，即得抗菌凝胶制剂。
3）空白对照凝胶剂：制剂中除了不含有Ctryamp多肽外，其余处方和制备同以上制剂。
备注：羟丙甲基纤维素(Hydroxypropyl Methyl Cellulose，HPMC)。丙三醇、羟丙甲基纤维素、乙醇酸、EDTA均为药用规格。
实施例5：Ctryamp多肽抗菌制剂对标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、MRSA和铜绿假单孢菌的抑制作用
1）将实施例4提供的成品凝胶剂按照1:49的比例溶解在灭菌的生理盐水中，且进行等比稀释10个浓度，置于4℃冰箱。
2）将保种的标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、MRSA和铜绿假单孢菌接种到LB培养基中,37℃过夜培养。
3）将过夜培养的菌液用新鲜的LB培养基稀释到OD600=0.002。
4）96孔培养板中每孔加入80μL的上述菌液。
5）向菌液中加入20μL上述不同浓度的成品凝胶剂溶液。
6）同时做凝胶剂和生理盐水的阴性对照以及原料多肽和抗生素的阳性对照试验。
7）将96孔板置于37℃、250rpm的振荡仪上培养16小时。
8）16小时后取出96孔板，冷却至室温，置于酶标仪上630nm波长测其吸光值。
9）以完全没有光吸收的孔的溶液浓度作为最小抑制浓度。
10）抗菌结果表明，抗菌制剂对标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、MRSA和铜绿假单孢菌有高效抑制效应，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度MIC为6.25μg/mL（针对该制剂中有效成分多肽来计算），而与原料药多肽具有一致的最小抑菌浓度（原料药Ctryamp及其同源结构双亲性合成多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC为6.25μg/mL）；其抗菌制剂对MRSA的最小抑菌浓度MIC为6.25μg/mL、对铜绿假单孢菌的最小抑菌浓度MIC为8μg/mL（原料药Ctryamp及其同源结构双亲性合成多肽对MRSA和铜绿假单孢菌的MIC分别为6.25μg/mL、8μg/mL），而空白制剂没有抗菌活性。
抗菌试验结果见表4。
表4西藏特里豚蝎Ctryamp多肽外用凝胶制剂对革兰阴性、阳性和耐药菌的最小抑菌浓度MIC
Figure BDA00003524652800271
注明：按照制剂中有效成分Ctryamp多肽或其结构同源多肽计算。
实施例6：Ctryamp多肽抗菌制剂对创面细菌感染患者的临床治疗试验
1）病例一般资料：治疗组病人82例，男性38例，女性44例；年龄最小4岁，最大76岁；病种分类：擦伤创面28例，小型烫伤创面12例，烧伤残余创面10例，2级糖尿病慢性溃疡12例，皮瓣手术围手术期12例，面部大范围激光治疗术后创面8例。对照组病人74例，男性36例，女性38例；年龄最小5岁，最大78岁；病种分类：擦伤创面28例，小型烫伤创面13例，烧伤残余创面10例，2级糖尿病慢性溃疡8例，皮瓣手术围手术期10例，激光治疗术后5例。
2）实验组治疗方法：采用给予实施例4提供的Ctryamp多肽外用凝胶(简称蝎肽抗菌凝胶)的药剂外用。所有伤口或溃疡面用蝎肽抗菌凝胶外擦，厚度约1-2mm，每日1次，或使用蝎肽抗菌凝胶浸润纱布敷于创面，每3日换药1次。擦伤创面、浅Ⅱ度烫伤创面均先用3%过氧化氢溶液冲洗后，用灭菌生理盐水冲洗至创面清洁。清除坏死组织后再用灭菌生理盐水冲洗创面，0.2%活力碘消毒周围皮肤，以无菌棉球将创面拭干后，使用蝎肽抗菌凝胶均匀涂抹于创面，厚度约1-2mm；烧伤残余创面、2级糖尿病慢性溃疡留取标本做细菌培养，了解创面感染情况，按以上方法清创，先均匀涂抹蝎肽抗菌凝胶，待肉芽组织长出，点状植皮，再均匀涂擦蝎肽抗菌凝胶，厚度约1-2mm，网眼纱覆盖住，加压包扎，3天后第一次更换敷料。慢性糖尿病患者，长期监控调整血糖，使之接近正常值，最好空腹血糖(Fasting plasma glucose，FPG)在8mmol/L以内；皮瓣手术围手术期，清创后，直接均匀涂擦蝎肽抗菌凝胶保护创面，厚度约1-2mm；激光治疗术后，生理盐水清洗创面后直接均匀涂擦蝎肽抗菌凝胶，厚度约1-2mm。
3）对照组治疗方法：所有伤口或溃疡面清创后纱布包扎，3天后半暴露治疗，保持创面干燥。
4）疗效结果与比较：治疗组82例患者创面均一期愈合，未出现感染及创面延迟愈合，未出现过敏反应及其他不良反应。根据国家卫生部2007年颁布的抗菌药物临床试验指导原则判断疗效。结果治疗组82例中显效80例，有效2例，有效率100%。对照组74例中显效50例，有效20例，无效4例，有效率95%，两组经统计学F检验，P＜0.05。两组促进创面愈合时间比较见表1，经过统计学F检验，P＜0.05（表5）。临床治疗结果表明，本发明提供的外用凝胶能有效的预防和治疗细菌感染，同时能显著的促进伤口的修复愈合。蝎肽抗菌凝胶对MRSA和铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R株）有高效的杀菌作用，对体表慢性难愈合感染创面疗效独特（治疗组82例中，有8例细菌培养为MRSA感染，有5例细菌培养为铜绿假单胞菌IPM-R株，经蝎肽抗菌凝胶治疗均有效）。
表5 蝎肽抗菌凝胶和常规换药的平均愈合时间及其比较*
*：两组比较P＜0.05。
实施例7：多肽抗菌制剂对痤疮患者的临床治疗试验
1）病例选择：入选病人均来自武汉大学人民医院皮肤科门诊，经临床确诊的痤疮病人。排除对克林霉素、奎诺酮类有过敏史者，15天内使用过其他抗痤疮药物者，严重的肝肾功能不全者，以及孕妇哺乳期妇女。
2）实验分组：将258例病人采用多中心开放平行对照观察方法，分为实验组、对照组。实验组：168人，男性76人；女性92人，年龄20岁到38岁。对照组：90人，男性46人：女性44人，年龄22岁到39岁。2组间年龄性别、病期以及皮损程度等各项指标值相比，差异均无明显意义，具有可比性。
3）实验方法：实验组采用给予实施例4提供的Ctryamp多肽外用凝胶治疗痤疮的药剂外用；对照组：给予5％的硫磺霜（武汉大学人民医院制剂室制作）外用。用药方法：用温热水和皂液或硫磺药皂洗脸，将面部油灰充分洗净，再用手指蘸药，反复轻轻涂抹于患处，每日早晚各涂抹一次，连续2周为一疗程。
4）疗效观察和判断标准：258例参研者每1周随访观察一次，复诊时，详细填写观察表格，记录患者面部痤疮皮损数目、变化和不良反应。按痤疮各种损害（粉刺、炎性疤疹、脓疮、结节、囊肿）减少的总百分率统计疗效。痊愈：皮损消退100%；显效：皮损消退76-99%；有效：皮损消退50-70%；无效：皮损消退＜50％。疗程结束后，用计量方法计算治疗后痤疮的百分数，进行疗效评估。同时，对不良反应进行观察，观察有无局部刺激及全身症状，部分病人临床实验前后作血尿常规检查和肝、肾功能检查。
5）对照疗效统计分析：实验组168例，痊愈112例，占66.7%；显效51例，占30.4%；有效5例，占2.98%；无效0例，占0%；总有效率100％。对照组：90例，痊愈5例，占5.6%；显效14例，占15.6%；有效20例，占22.2%；无效51例，占4%；总有效率43%。对照疗效分析，实验组与对照组差异有高度显著性，说明实验组对治疗痤疮疗效优于对照组。
6）不良反应：实验组168例患者中无1例不良反应。对照组90例患者中有5例涂药后局部灼热感，潮红停药后，自行缓解，未作处理。此外，实验组治疗前后共观察了10例血尿常规、16例肝功，8例肾功能检查，均无异常改变。
实施例8：Ctryamp多肽抗菌制剂对湿疹患者的临床治疗试验
湖北省人民医院烧伤整形外科用实施例4提供的多肽外用抗菌凝胶制剂抗治疗了22例慢性湿疹患者，一日一次，对照组19例，用1%氢化可的松乳膏治疗，一日二次外用，临床观察时间为2周。实验结果显示，蝎肽抗菌凝胶对湿疹有独特的疗效，治愈率100%，临床随访无复发，而实验对照组临床症状减轻，但随访复发严重。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (34)

1.一种多肽，其特征在于，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述添加为添加1个、2个、3个、4个5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
6.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7任一项所述的多肽在制备抗菌剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂抑制细菌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分枝杆菌属、厌氧细菌或棒状杆菌属。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、肠道杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、鲍特菌属或嗜血杆菌属。
13.根据权利要求1至7任一项所述的多肽在制备预防和/或治疗细菌感染疾病和/或湿疹的药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分枝杆菌属、厌氧细菌或棒状杆菌属。
16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、肠道杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、鲍特菌属或嗜血杆菌属。
17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述感染为非特异性感染和/或特异性感染。
18.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述非特异性感染为疖、痈、丹毒、急性淋巴管炎、急性淋巴结炎、甲沟炎、脓性指头炎、手指侧化脓性腱鞘炎、滑囊炎、掌深间隙感染、脓血症、菌血症。
19.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述特异性感染为结核、破伤风、气性坏疽、炭疽、百日咳、流行性脑脊髓炎、淋病、伤寒、细菌性痢疾或白喉。
20.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述感染为MRSA、MRCNS、耐红霉素化脓性链球菌、产ESBLs大肠埃希菌、铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株引起的感染；
或所述感染为金黄色葡萄球菌引起的局部感染、全身感染或毒素性疾病；
或所述感染为凝固酶阴性葡萄球菌引起的泌尿系统感染、败血症或术后感染；
或所述感染为链球菌引起的化脓性炎症、风湿热与急性肾小球肾炎、猩红热、细菌性肺炎、龋齿、亚急性细菌性心内膜炎或新生儿感染；
或所述感染为肺炎链球菌引起的大叶性肺炎、气管炎、中耳炎、脑膜炎、胸膜炎、心内膜炎或败血症；
或所述感染为无乳链球菌引起的孕妇产褥期脓毒血症、新生儿脑膜炎、产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染或骨髓炎；
或所述感染为肠球菌引起的心血管系统感染或尿路感染；
或所述感染为屎肠球菌引起的尿路感染、化脓性腹部感染、败血症、心内膜炎或腹泻发烧；
或所述感染为粪肠球菌引起的心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染或伤口感染；
或所述感染为脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓炎；
或所述感染为淋病奈瑟菌引起的淋病；
或所述感染为埃希菌引起的泌尿系统感染、肠道外的化脓性感染、肠道感染或出血性结肠炎；
或所述感染为志贺氏菌引起的细菌性痢疾；
或所述感染为沙门菌引起的伤寒与副伤寒；
或所述感染为肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支气管炎泌尿道感染、创伤感染、脑膜炎或腹膜炎；
或所述感染为产酸克雷伯菌引起的抗生素相关性出血性结肠炎；
或所述感染为枸橼酸杆菌引起的肺炎或脑膜炎；
或所述感染为阴沟肠杆菌引起的皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸道感染、腹部感染、中枢神经系统感染、眼部感染、伤口感染、心内膜炎或败血症；
或所述感染为沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、菌血症或手术后感染；
或所述感染为破伤风梭菌引起的破伤风；
或所述感染为产气荚膜梭菌引起的气性坏疽或食物中毒；
或所述感染为无芽孢厌氧菌引起的腹部感染、女性生殖道、盆腔感染或菌血症；
或所述感染为白喉棒状杆菌引起的白喉；
或所述感染为痤疮棒状杆菌引起的痤疮、粉刺；
或所述感染为铜绿假单胞菌引起的伤口感染、烧伤组织感染、肺部感染、泌尿道感染、中耳炎、角膜炎、心膜炎或败血症；
或所述感染为鲍曼不动杆菌引起的呼吸道感染、菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染或呼吸机相关性肺炎；
或所述感染为百日咳鲍特菌引起的百日咳；
或所述感染为流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌引起的婴儿及孩童菌血病症、急性细菌性脑膜炎、蜂窝组织炎、骨髓炎或关节感染；
或所述感染为结核分枝杆菌引起的结核病；
或所述感染为慢性难愈合感染创面。
21.根据权利要求1至7任一项所述的多肽在制备促进组织修复和/或伤口愈合的药物中的应用。
22.根据权利要求1至7任一项所述的多肽在制备治疗烧伤、冷伤、挤压伤、战创伤、动物咬伤、核放射伤或复合伤的药物中的应用。
23.一种编码如权利要求1至7任一项所述的多肽的DNA分子，其特征在于，其具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Ⅱ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
24.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求23所述的DNA分子。
25.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；
取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导所述转化体表达蛋白，经分离纯化，即得；
所述的(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述的(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述DNA分子为具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Ⅱ 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。
28.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，所述原核系统宿主细胞为大肠杆菌。
29.一种治疗创面感染和/或促进组织修复愈合的药物制剂，其特征在于，由如权利要求1至7任一项所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
30.根据权利要求29所述的药物制剂，其特征在于，所述多肽占所述药物制剂的质量百分含量为0.01%～1.5%。
31.根据权利要求29所述的药物制剂，其特征在于，所述辅料包括羟丙甲基纤维素，所述羟丙甲基纤维素占所述药物制剂的质量百分含量为7.0%。
32.根据权利要求29所述的药物制剂，其特征在于，以重量百分数计，其由如权利要求1至7任一项所述的多肽0.01～1.5%、丙三醇5%、羟丙甲基纤维素7%、乙醇酸0.1%、EDTA0.1%，余量为水组成。
33.根据权利要求29所述的药物制剂，其特征在于，其为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、擦剂、膜剂、贴剂、膏剂、软膏剂、橡胶膏剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂、滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、气雾剂、吸入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、灌肠剂或栓剂。
34.根据权利要求1至7任一项所述的多肽在制备饲料添加剂、保健品添加剂、食品添加剂、化妆品添加剂中的应用。
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