CN111150835A - 猪β-防御素2肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染的药物组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及猪β‑防御素2肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染的药物组合物中的应用。猪β‑防御素2(PBD‑2)肽段在体外无细胞毒性并对猪链球菌生长有显著抑制作用。通过PBD‑2处理能够显著降低小鼠感染猪链球菌后的死亡率，炎性细胞因子水平，组织载菌量和病理损伤程度。本发明为PBD‑2肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染中的药学应用提供了基础候选药物。

Description

猪β-防御素2肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染的药物组 合物中的应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及猪β-防御素2(PBD-2)肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染的药物组合物中的应用。PBD-2短肽能在体外能抑制猪链球菌的生长，并且能够预防和治疗猪链球菌对动物的感染。

背景技术

猪链球菌病是由多种致病性链球菌引起的一类人畜共患的急性热性传染病，给养猪业带来了巨大的损失，并且严重威胁人类健康。猪链球菌(Streptococcus suis)属于革兰氏阳性菌，在猪的扁桃体和鼻腔中能长期定植。猪链球菌感染的临床症状受猪群日龄以及血清型影响，主要表现为淋巴结脓肿、脑膜炎、败血症以及关节炎等。各个年龄的猪都可发病，其中败血症型和脑膜脑炎型多见于仔猪，淋巴结脓肿型多见于中猪，哺乳仔猪发病率和病死率较高，中猪次之，大猪较少。根据荚膜抗原(CPS)的不同可分为33个血清型，其中最常见和危害最大的是血清2型(SS2)。人可通过伤口感染猪链球菌，1968年在丹麦首次发现人类感染SS2脑膜炎病例，1998年和2005在中国也爆发大规模的人感染SS2，于此同时猪群中也爆发了猪链球菌病。自从发现该病原体以来，世界上30多个国家或地区已报告了约1600多例猪链球菌感染病例。

猪链球菌病的防控措施主要包括猪场的综合管理、疫苗预防和抗菌药物治疗。加强猪场的综合管理包括严格控制引种，合理的饲养方式，做好环境卫生工作，加强生物安全防控等 (巫廷建，2017)。临床上针对猪链球菌病主要使用的是灭活疫苗，灭活苗能对特定血清型有良好的预防效果，但是需要提高免疫剂量和免疫次数，而且无法针对其他血清型。短肽工程亚单位疫苗、亚单位疫苗以及传代致弱的弱毒疫苗等也有一定的效果(Li etal.2017；Wang et al.2017；Su et al.2018)，但实际应用时亚单位疫苗存在成本高，免疫效力不够等诸多限制；弱毒疫苗存在毒力返强的风险。针对猪链球菌的常用抗菌药物有β-内酰胺类(青霉素，头孢噻呋)、氨基糖苷类(庆大霉素)、苯甲酚(氟苯尼考)和氟喹诺酮类，但近年来猪链球菌在我国猪场中的分离率逐渐上升且多产生广谱耐药性。王晓旭等人测定了临床分离的150 多种猪链球菌对8种常见抗菌药物的耐药情况，结果发现95％的猪链球菌对8种抗菌药物产生了不同程度的耐药性，耐药率为16.67％～90.00％，46％的菌株为多重耐药，其中10.7％的菌株为8重耐药(王晓旭，2018)。日益普遍的耐药性给猪链球菌的防治带来了困难。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)主要存在于哺乳动物的上皮细胞、组织、体液以及身体表面，是机体抵御病原体入侵的第一道防线。AMPs因具有广谱的抗菌、抗炎、免疫调节作用而在抗菌药物的应用上已取得了良好效果。Toray Industries公司发现猪抗菌肽-39 (porcine cathelicidin-39，PR-39)具有抗幽门螺杆菌的特性，给小鼠腹腔注射PR-39可以促进大鼠胃溃疡的愈合(Yang et al，2001)。Protegrin-1(PG1)是从猪白细胞中分离的化合物，能够穿透细胞膜而具有广谱抗菌活性(Gidalevitz et al，2003)。有人发现人β防御素-3(human beta-defensin，HBD-3)对金黄色肠球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不杆菌等耐药菌株具有抗菌活性(Hoover et al，2003)。2008年生物制药公司OctoPlus N.V研制的化合物OP-145可以有效治疗对抗生素耐药的慢性化脓性中耳炎。在小鼠感染模型中，富含脯氨酸的肽Bac7降低了鼠伤寒沙门氏菌的死亡率(Benincasa et al，2010)。天然防御肽IDR-1002和IDR-HH2可以有效抑制肺结核杆菌的生长和减轻肺部病理变化(Rivas et al.，2013)。2018年赵飞等人发现抗菌肽NZ2114能够有效提高小鼠猪链球菌感染后的存活率(Zhao et al.2018)。翟振亚等人发现天蚕素通过调节小鼠的肠道菌群来减轻炎症性肠病感染引起的炎症(Zhai et al.2019)。抗菌肽也可作为饲料添加剂，在提高动物生长性能以及抗病性方面起到了良好效果。研究发现从蚕蛹中分离的抗菌肽应用于饲喂肉鸡有提高生长性能和免疫力的作用(黄永彤，2004)。日粮中添加抗菌肽制剂能够降低奶牛乳体细胞数，从而提高牛奶的品质(徐名能，2011)。抗菌肽饲喂也可降低大马哈鱼感染弧菌后的死亡率(Jia X et al.2000)。在母猪饲料中添加抗菌肽，可以有效降低母猪产死胎率和提高仔猪免疫力(朱海军，2014)。

防御素是一种广泛分布于动植物体内的小分子阳离子抗菌肽，具有广谱的抗菌、抗病毒和抗真菌活性，在哺乳动物先天免疫中起重要作用。大多由18-45个氨基酸残基组成，包含6 个高度保守的半胱氨酸残基和3个分子内二硫键，根据半胱氨酸残基的空白分布和二硫键的连通性可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素3类。目前在猪中只发现了β-防御素，2006年 Sang等人通过生物信息学方法首次发现了PBD-2，证明了其在肝、肠、肺、骨髓中广泛表达 (Sang et al.2006)。Veldhuizen等人通过体外抑菌实验发现的PBD-2对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等常见革兰氏阴性菌和阳性菌的生长有一定抑制作用，并发现PBD-2能够抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在MA-104细胞中的增殖(Veldhuizen et al.2008)。Peng等人通过测定经酵母表达的rPBD2对金黄色葡萄球菌、猪链球菌和霍乱链球菌等九种微生物菌株(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌和酵母菌)的MIC，发现rPBD2 具有广泛的抗菌谱(Peng et al.2014)。PBD-2作为饲料添加剂，具有促生长和降低仔猪腹泻的效果(Peng et al，2016)。申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室齐燕华等人利用显微注射法制备的PBD-2质粒过表达转短肽小鼠对伪狂犬病毒的抵抗力增强(齐燕华，2016)，黄超等人发现PBD-2片段用于过表达转短肽小鼠显著降低了鼠伤寒沙门氏菌和脂多糖(LPS)诱导的炎症反应，并且证明了PBD-2是通过NF-κB炎症信号通路下调LPS 导致的炎症反应(Huang et al.，2019)。杨希等人制备的PBD-2片段用于过表达转短肽猪增强了对胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌以及猪流感病毒的抵抗力(Yang et al.2015；周锐et al. 2019a；周锐et al.2019b)。

迄今为止，尚未发现国内外有关人工合成的PBD-2肽段在制备预防和治疗猪链球菌病的药物组合物中的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工合成的PBD-2肽段(在本发明中有时简称为肽段，短肽或直接简称为PBD-2均为SEQ ID NO:1所示序列的DNA片段)在制备预防和治疗猪链球菌感染药物组合物中的应用。本发明通过人工合成的PBD-2肽段处理小鼠降低了小鼠感染猪链球菌后的死亡率，炎性细胞因子水平以及组织载菌量和病理变化程度。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明根据已报到的PBD-2肽段(短肽)的氨基酸序列(见序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)人工合成一段PBD-2的DNA片段，该片段的氨基酸序列如下所述(其蛋白质序列如SEQ ID NO:1所示)：

DHYICAKKGGTCNFSPCPLFNRIEGTCYSGKAKCCIR

利用PBD-2肽段在体外进行细胞毒性和抑菌活性的验证，同时在小鼠模型上评价PBD-2 对猪链球菌病的预防和治疗效果。PBD-2在制备预防和治疗猪链球菌感染药物组合物中的应用，包括用于非诊断目的的降低小鼠感染猪链球菌后的死亡率，降低小鼠感染猪链球菌后的炎性细胞因子水平，降低小鼠感染猪链球菌后的组织和血液中的细菌载量，以及降低小鼠感染猪链球菌后的组织病理变化程度的方面的应用验证。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明首次发现了通过PBD-2肽段(短肽)在预防和治疗小鼠显著降低小鼠感染猪链球菌后的死亡率、炎性细胞因子水平、组织载菌量和病理变化程度。

(2)本发明发现了PBD-2肽段(短肽)在抗猪链球菌感染中的药学用途。

附图说明

图1：PBD-2肽段(短肽)对猪链球菌生长的影响。附图标记说明：图1中的A图为不同浓度的PBD-2短肽对猪链球菌活菌数量的影响的示意图；图1中的B图为不同浓度的PBD-2对猪链球菌存活率影响的示意图。其中：*表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.05，**表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.01，***表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.001。

图2：PBD-2肽段(短肽)对细胞活性的影响。附图标记说明：图2中的A图为不同浓度的 PBD-2短肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7存活率影响的示意图。图2中的B图为不同浓度的PBD-2 短肽对猪肺巨噬细胞3D4/21存活率影响的示意图。图2中的C图为不同浓度的PBD-2短肽对猪肾细胞PK-15细胞存活率影响的示意图。

图3：PBD-2肽段(短肽)处理对小鼠感染高剂量猪链球菌后的存活率的影响。附图标记说明：图3中的A图为PBD-2短肽预防和治疗对小鼠感染猪链球菌后的存活率的影响，图3中的 B图为PBD-2短肽治疗次数对小鼠感染猪链球菌后的存活率的影响。

图4：PBD-2肽段(短肽)治疗对小鼠感染低剂量猪链球菌后的组织载菌量的影响。附图标记说明：图4中的A图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后的脑组织细菌载量的统计学分析。图4中的B图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后的脾组织细菌载量的统计学分析。图 4中的C图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后的肺组织细菌载量的统计学分析。图4中的D 图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后的血液细菌载量的统计学分析。其中：*表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.05，**表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.01，***和**** 表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.001。

图5：PBD-2肽段(短肽)治疗对小鼠感染低剂量猪链球菌后的炎性细胞因子水平的影响。附图标记说明：图5中的A图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后IL-6水平的统计学分析。图5中的B图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后IL-12水平的统计学分析；图5中的C图为对照组和治疗组小鼠感染猪链球菌后TNF-α水平的统计学分析。其中：*表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.05，**表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.01，***和****表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.001。

图6：PBD-2肽段(短肽)治疗对小鼠感染高剂量猪链球菌3h后的脑组织病理变化的影响。附图标记说明：图6中的A、B、C分别表示空白对照组小鼠的脑组织切片图；图6中的D、E、 F分别表示阴性对照组小鼠的脑组织切片图；图6中的G、H、I分别表示治疗组小鼠的脑组织切片图；图6中的J表示脑组织损伤打分图。其中：*表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.05，**表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.01，***表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.001。图7：PBD-2短肽治疗对小鼠感染高剂量猪链球菌3h后的肺组织病理变化的影响。附图标记说明：图7中的A、B、C分别表示空白对照组小鼠的肺组织切片图；图7中的D、E、 F分别表示阴性对照组小鼠的肺组织切片图；图7中的G、H、I分别表示治疗组小鼠的肺组织切片图；图7中的J表示肺组织损伤打分图。其中：*表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.05，**表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.01，***表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.001。

图8：PBD-2肽段(短肽)治疗对小鼠感染低剂量猪链球菌21h后的肺组织病理变化的影响。附图标记说明：图8中的A、B、C分别表示空白对照组小鼠的肺组织切片图；图8中的D、 E、F分别表示阴性对照组小鼠的肺组织切片图；图8中的G、H、I分别表示治疗组小鼠的肺组织切片图；图8中的J表示肺组织损伤打分图。其中：*表示数据的统计学差异的显著性达到 P<0.05，**表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.01，***表示数据的统计学差异的显著性达到P<0.001。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是猪β-防御素2(PBD-2)肽段(短肽)编码的蛋白质序列。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例是将PBD-2在体外的细胞毒性、抑菌活性和对感染猪链球菌小鼠的保护效果进行说明。

实施例1：PBD-2肽段对猪链球菌生长的影响

将猪链球菌2型菌株(CVCC606菌株，购自中国北京，中国兽医药品监察所，一个商业菌株；文献引自：华中农业大学，专利申请公开说明书，专利申请号2008102253466，公开号 101412984A)在含有5％(体积比)牛血清的TSA平板上培养12h，挑取平板上的单菌落，接种于5mL TSB液体培养基(BD液体培养基，购自美国)中，置于37℃摇床中，180r/min过夜培养。次日按照1％(体积比)比例转接于新的TSB液体培养基中，大约到4.5-5h可至对数生长中期，取对数生长中期的菌液稀释至5×10⁵CFU/ml。然后取10μL菌液与90μL不同浓度的PBD-2溶液(25-120μg/mL)在灭菌的EP管中混合，37℃下孵育1小时，每种浓度做3次重复。孵育后，进一步稀释至10-1000倍，取100μL涂布TSA平板，然后在37℃恒温培养箱中培养20h后计数。结果见图1，当PBD-2肽段浓度为25-200μg/ml时，PBD-2肽段对猪链球菌的生长有明显抑制作用并且呈剂量依赖性增加。

实施例2：PBD-2肽段对细胞活性的影响

采用鼠源小鼠巨噬细胞(RAW264.7，

TIB-71^TM)，猪源猪肺泡巨噬细胞(3D4/21，

CRL-2843^TM)、猪肾细胞(PK-15，

CCL-33^TM)检测PBD-2对细胞活性的影响。

鼠源小鼠巨噬细胞(RAW264.7)在含有10％胎牛血清和1％青链霉素的1640培养基(Gibco，美国))中于37℃、5％CO₂条件下培养；3D4/21细胞在含有10％胎牛血清、1％丙酮酸和非必需氨基酸的DMEM培养基(购自Gibco公司，美国))中于37℃、5％CO₂条件下培养； PK-15在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5％CO₂条件下培养。将细胞连续传至3 代后，通过细胞计数板法对细胞进行计数。将细胞按8000个每孔的比例在96孔板中布板，每孔100μl，将培养板在培养箱中预培养8h(37℃，5％CO₂)。再向培养板中加入10μl不同浓度的PBD-2溶液，每种浓度做8个重复，同时设置对照组(细胞培养基+细胞，不含PBD-2)和空白组(只含细胞培养基)。将培养板在培养箱中继续孵育16h后，向每孔中加入10μl CCK-8溶液(东仁化学，上海)，再将培养板在培养箱中孵育3h后，用酶标仪测定在OD₄₅₀处的吸光度。结果见图2，可见不同浓度的PBD-2对细胞生长均无明显抑制。

实施例3：PBD-2肽段对感染高剂量猪链球菌小鼠存活率的影响

1、PBD-2短肽预防和治疗对感染猪链球菌小鼠存活率的影响试验

试验设计：将30只4-6周龄C57小鼠(购自湖北省预防医学科学院实验动物中心)随机分为0.5mg/kg PBD-2治疗组、0.5mg/kg PBD-2预防组0.1mg/kgPBD-2治疗组、0.1mg/kgPBD-2预防组和PBS对照组，每组数量6只。所有小鼠腹腔注射8×10⁸CFU的猪链球菌，注射量为0.2ml。 0.5mg/kg PBD-2预防组和0.1mg/kg PBD-2预防组分别在感染前2h腹腔注射0.5mg/kg和 0.1mg/kg的PBD-2；0.5mg/kg PBD-2治疗组和0.1mg/kg PBD-2治疗组分别在感染后1h腹腔注射 0.5mg/kg和0.1mg/kg的PBD-2；对照组注射相同体积的磷酸盐缓冲液(PBS，塞维尔，武汉)。连续观察小鼠60h，统计存活率。结果见图3中的A图，PBS对照组小鼠存活率为16.7％；0.5mg/kg PBD-2治疗组小鼠存活率为66.7％；0.5mg/kg PBD-2预防组小鼠存活率为50％；0.1mg/kg PBD-2 治疗组小鼠存活率为33.3％6；0.1mg/kg PBD-2预防组小鼠存活率为16.7％。表明与0.1mg/kg PBD-2治疗组相比，0.5mg/kgPBD-2治疗组和预防组降低小鼠死亡率效果明显，且治疗组效果优于预防组。

2、PBD-2肽段治疗次数对感染猪链球菌小鼠存活率的影响

将24只4-6周龄C57小鼠((购自湖北省预防医学科学院实验动物中心))随机分为0.5mg/kg PBD-2三次治疗组、0.5mg/kg PBD-2两次治疗组、0.5mg/kg PBD-2一次治疗组和PBS对照组，每组6只。所有小鼠腹腔注射9×10⁸CFU的猪链球菌，注射剂量为0.2ml。0.5mg/kg PBD-2三次治疗组分别在感染前2h、感染后1h和感染后4h腹腔注射0.5mg/kg PBD-2；0.5mg/kg PBD-2两次治疗组分别在感染前2h和感染后1h腹腔注射0.5mg/kg PBD-2；0.5mg/kg PBD-2一次治疗组在感染后1h腹腔注射0.5mg/kg PBD-2；对照组在感染后1h注射相同体积的PBS。结果见图3中的B图，PBS对照组小鼠存活率为0％；0.5mg/kg PBD-2三次治疗组小鼠存活率为50％；0.5mg/kg PBD-2两次治疗组小鼠存活率为33.3％；0.5mg/kg PBD-2一次治疗组小鼠存活率为16.7％。表明增加PBD-2的治疗次数，小鼠死亡率降低的更多。

实施例4：PBD-2肽段对感染低剂量猪链球菌小鼠组织载菌量的影响

将48只4-6周龄C57小鼠随机分为0.1mg/kg PBD-2治疗组、0.5mg/kg PBD-2治疗组和PBS 对照组，每组16只。所有小鼠腹腔注射2×10⁸CFU的猪链球菌，注射量为0.2ml。0.1mg/kg PBD-2 治疗组在感染后1h用0.1mg/kg PBD-2进行治疗；0.5mg/kg PBD-2治疗组在感染后1h用0.5mg/kg PBD-2进行治疗；PBS对照组在感染后1h用相同体积的PBS处理。在感染后8h和21h每组取8只小鼠眼球采取抗凝血，取脑和肺部组织于3倍体积的的生理盐水中，脾部组织于4倍体积的的生理盐水中，将组织加入到组织研磨仪内研磨成浆液。分别取100μl组织匀浆液和血液梯度稀释至10-10⁶倍，选10^-4、10^-5和10^-6三个稀释度进行活菌计数，每个稀释度取100μL的菌液进行计数，并依次做三个重复，然后在37℃恒温培养箱中培养20h后计数。试验结果见图4所述， 0.1mg/kg PBD-2治疗组小鼠在感染后8h脑组织、脾组织和血液中的细菌负荷显著降低； 0.5mg/kgPBD-2治疗组小鼠在感染后8h、21h脑组织、脾组织、肺组织和血液中的细菌负荷显著降低。表明PBD-2治疗明显降低了小鼠感染猪猪链球菌后的组织和血液中的细菌载量。

实施例5：PBD-2肽段对感染低剂量猪链球菌小鼠炎性细胞因子的影响

将56只4-6周龄C57小鼠随机分为0.1mg/kg PBD-2治疗组16只、0.5mg/kg PBD-2治疗组16 只、PBS对照组16只和空白对照组8只。0.1mg/kg PBD-2治疗组、0.5mg/kg PBD-2治疗组和PBS 对照组小鼠腹腔注射2×10⁸CFU的猪链球菌，注射量为0.2ml，空白对照组注射相同体积的 PBS。0.1mg/kg PBD-2治疗组在感染后1h用0.1mg/kgPBD-2进行治疗；0.5mg/kgPBD-2治疗组在感染后1h用0.5mg/kg PBD-2进行治疗；PBS对照组和空白对照组在感染后1h相同体积的PBS 处理。在感染后8h和21h每组取8只小鼠眼球采取非抗凝血，4℃静止12h后，1000rpm离心10min，取血清备用。根据EILSA试剂盒检测血清中的IL-6、IL-12和TNF-a含量。检测步骤： (1)检测前所有试剂恢复室温，板条加入300μl 1×洗液静置浸泡30秒。(2)标准品孔加入100μl 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μl标准品稀释液。(3)样本孔加入90μl 1×检测缓冲液和10μl血清样本。(4)每孔加入50μl 1:100稀释的检测抗体，步骤2、3、4在15分钟内完成。 (5)封膜，室温孵育1.5小时。(6)孵育完成后，300μl 1×洗液洗涤6次。(7)每孔加入100μl 1:100 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。(8)封膜，室温孵育30分钟。(9)孵育完成后，300μl 1×洗液洗涤6次。(10)每孔加入100μl显色底物，避光，室温孵育5-30分钟。(11)每孔加入100μl 终止液。(12)30分钟内，在450nm波长检测OD值，参考波长630nm。(12)计算标准曲线，通过标曲得出炎性细胞因子浓度。结果见图5，与对照组相比，0.1mg/kgPBD-2治疗组小鼠在感染后8h血清中IL-6和IL-12水平含量显著降低；0.5mg/kgPBD-2治疗组小鼠在感染后8h血清中 IL-6、IL-12和TNF-a水平含量显著降低，在感染后21h血清中IL-6和IL-12水平含量显著降低。表明PBD-2治疗明显降低了小鼠感染猪链球菌后的炎性细胞因子水平。

实施例6：PBD-2短肽对感染不同剂量猪链球菌小鼠组织病理变化的影响

1.PBD-2对感染高剂量猪链球菌小鼠组织病理变化的影响

将30只4-6周龄C57小鼠随机分为0.5mg/kg PBD-2治疗组12只、阴性对照组12只和空白对照组6只。除空白对照组所有小鼠腹腔感染8×10⁸CFU的猪链球菌，注射量为0.2ml。0.5mg/kg PBD-2治疗组在感染后1h用0.5mg/kg PBD-2进行治疗，PBS对照组和空白对照组在感染后1h相同体积的PBS处理。分别在感染后3h和8h每组剖杀3只小鼠，取脑组织、脾组织、肺部组织于 4％多聚甲醛溶液中固定，固定24h后用于制作石蜡切片。石蜡切片制作：(1)组织冲洗：从固定液中取出组织进行修块，之后脑组织、脾组织和肺组织放于脱水框内，流水冲洗24h。(2) 组织脱水：将脱水框依次放在不同浓度的酒精溶液中梯度脱水：70％(2h)，75％(1h)，85％(1h)， 95％(1h)，100％I(1h)，100％II(1h)。(3)组织透明：梯度酒精脱水后的组织放在无水乙醇和二甲苯1：1体积的混合液中30min，二甲苯I溶液10min,二甲苯II溶液10min。(4)组织浸蜡与包埋：蜡油的处理，白蜡和蜂蜡8：1体积在60℃融化混合，滤纸过滤两次。二甲苯与蜡油1：1体积混合液中浸泡30min，蜡油I浸泡2h，蜡油II浸泡2h。然后不锈钢包埋框中倒入蜡油，把组织块修理平整的横截面朝下放置，贴上标签。(5)切片：使用莱卡旋转式切片机(型号RM2245/ RM2235，购自德国徕卡公司)，设置切片厚度4μm，获得连续切片。在40℃水浴锅中展片，防脱片载玻片捞片。晾干水分，放置在60℃烘箱中烘烤30min，最后切片放在4℃冰箱中保存。图6和图7显示的是PBD-2治疗对小鼠感染高剂量猪链球菌3h后的脑组织和肺组织影响的切片图及病理打分图。小鼠感染猪链球菌后从脑组织切片可以观察到海马区神经元固缩深染，纤维缠节的现象，从肺组织切片可以观察到肺泡壁增厚、炎性细胞浸润和肺泡腔内充满红细胞的现象，每只小鼠的组织取十个视野，根据病变程度对其打分。肺组织打分标准为：肺泡壁增厚、炎性细胞浸润、肺泡腔内充满红细胞。脑组织打分标准为：海马区神经元固缩深染，皮层神经元肿胀，纤维缠节，每种病变根据严重程度计为0-3分。结果表明PBD-2治疗明显降低了小鼠感染猪链球菌3h后的脑组织和肺组织病变程度。

2.PBD-2短肽对感染低剂量猪链球菌小鼠组织病理变化的影响

将30只4-6周龄C57小鼠随机分为0.5mg/kg PBD-2治疗组12只、PBS对照组12只和空白对照组6只。0.5mg/kg PBD-2治疗组和PBS对照组小鼠腹腔注射2×10⁸CFU的猪链球菌，注射量为 0.2ml,空白对照组注射相同体积的PBS。0.5mg/kgPBD-2治疗组在感染后1h用0.5mg/kgPBD-2 进行治疗，PBS对照组和空白对照组在感染后1h相同体积的PBS处理。分别在感染后3h和8h 每组剖杀3只小鼠，取脑组织、脾组织、肺部组织于4％多聚甲醛溶液中固定，固定24h后用于制作石蜡切片，石蜡切片制作方法同上。图8显示的是PBD-2治疗对小鼠感染猪链球菌21h后的肺组织影响的切片图及病理打分图。小鼠感染猪链球菌后从肺组织切片可以观察到肺泡壁增厚、炎性细胞浸润和肺泡腔内充满红细胞的现象。每只小鼠的组织取十个视野，根据病变程度对其打分，肺组织打分标准同上。使用四点分级系统来评估，每种病变根据严重程度计为0-3分。结果表明PBD-2短肽治疗明显降低了小鼠感染猪链球菌21h后的肺组织病变程度。

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 猪β-防御素2肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染的药物中的应用

<141> 2020-01-11

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 111

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(111)

<400> 1

gac cac tac ata tgt gcc aag aaa ggg ggg acc tgc aac ttc tcc ccc 48

Asp His Tyr Ile Cys Ala Lys Lys Gly Gly Thr Cys Asn Phe Ser Pro

1 5 10 15

tgc ccg ctc ttc aac agg att gaa ggg acc tgt tac agt ggc aag gcc 96

Cys Pro Leu Phe Asn Arg Ile Glu Gly Thr Cys Tyr Ser Gly Lys Ala

20 25 30

aag tgc tgc atc cgc 111

Lys Cys Cys Ile Arg

35

<210> 2

<211> 37

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 2

Asp His Tyr Ile Cys Ala Lys Lys Gly Gly Thr Cys Asn Phe Ser Pro

1 5 10 15

Cys Pro Leu Phe Asn Arg Ile Glu Gly Thr Cys Tyr Ser Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Cys Cys Ile Arg

35

Claims (5)

1.猪β-防御素2(PBD-2)肽段在制备预防和治疗猪链球菌感染的药物组合物中的应用，其特征在于，所述PBD-2片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.PBD-2肽段在制备降低动物感染猪链球菌后的死亡率的药物组合物中的应用，其特征在于，所述PBD-2片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

3.PBD-2肽段在制备降低动物感染猪链球菌后组织和血液中细菌载量的药物组合物中的应用，其特征在于，所述的PBD-2片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

4.PBD-2肽段在制备降低动物感染猪链球菌后炎性细胞因子水平的药物组合物中的应用，其特征在于，所述PBD-2片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

5.PBD-2肽段在制备降低动物感染猪链球菌后的组织病变的药物组合物中的应用，所述PBD-2片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

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