CN114748606A - 抗菌肽nz2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。本发明首次发现抗菌肽NZ2114对无乳链球菌具有抑制作用。实验表明，NZ2114对无乳链球菌具有高效、快速杀菌、低耐药的作用。抗菌肽NZ2114对无乳链球菌的抗菌活性和杀菌速率明显优于氟苯尼考，溶血率较低，血浆和血清稳定性较高。NZ2114通过抑制细菌细胞壁合成来杀灭细菌。注射和饲喂NZ2114均对S.agalactiae感染的罗非鱼有较好的保护作用，均可降低感染罗非鱼的存活率、抑制其脏器荷菌量。保护脏器组织损伤，NZ2114具备成为链球菌病新型治疗剂的临床应用潜力。

Description

抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus.agalactiae)是一种引发人畜共患疾病的革兰氏阳性菌，可引发孕妇阴道感染、新生儿败血症和脑膜炎、可造成奶牛乳腺炎，还可诱发鱼类链球菌病，是罗非鱼链球菌病的主要致病菌之一。无乳链球菌躲避吞噬细胞的免疫防御并随巨噬细胞在全身游走，扩散感染其他组织，甚至透过血－脑屏障，临床表现症状为败血症、脑膜脑炎和眼球突出，发病率和死亡率非常高，对罗非鱼产业的经济影响超过4000万美元，是罗非鱼养殖的一大障碍。主要防治手段抗生素的滥用，导致耐药性越来越普遍，大量研究表明临床分离的无乳链球菌对氨基糖苷类、磺胺类等已产生高水平耐药，新兴防控手段如疫苗、中草药等研发成本高，药理作用不明，难以大规模推广应用，因此，开发低耐药性和高杀菌活性的新型抗菌药物势在必行。

抗菌肽(AMPs)是近年来替抗产品中的热点之一，作为一种天然活性小分子，具备广谱抗菌、低毒性和低耐药等特点。

菌丝霉素是从腐生子囊菌Pseudoplectania nigrella中分离出来的第一例防御素类阳离子抗菌肽，对革兰氏阳性细菌(如金黄色葡萄球菌、链球菌)具有强大的活性，在此基础上将Plectasin的第9、13及14位氨基酸的D、M及Q突变为N、L及得到新型抗菌肽(Raventos et al.,2010)NZ2114。体外研究表明，NZ2114对金黄色葡萄球菌的抗菌活性比母体肽提高了10倍左右，在胞内和胞外对VRSA、MSSA和MRSA等抗菌活性与达托霉素相当。尚未见抗菌肽NZ2114对罗非鱼来源的无乳链球菌抗菌方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供提供抗菌肽NZ2114在抑制无乳链球菌方面的新用途。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌(Streptococcus.agalactiae)抗菌药物或组合物中的应用。

本发明中，抗菌肽NZ2114包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

第三方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在治疗或预防无乳链球菌感染，以及治疗或预防由其感染所致相关疾病中的应用。

所述疾病是指由无乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病，如链球菌病(罗非鱼链球菌病)。

第四方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在抑制无乳链球菌引起的生物膜方面的应用，包括对初期生物膜的抑制作用，

本发明中，无乳链球菌可以是从患链球菌病的罗非鱼体内分离获得的临床菌株，也可以是标准株。

所述无乳链球菌包括但不限于如下菌株：ACCC 61733、ATCC 13813、CAU-FRI 1、CAU-FRI 2、CAU-FRI 3、CAU-FRI 4、PBSA0903。

第五方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在制备停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)抗菌药物或组合物中的应用。

第六方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防停乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

第七方面，本发明提供抗菌肽NZ2114在治疗或预防停乳链球菌感染，以及治疗或预防由其感染所致相关疾病中的应用。

所述疾病是指由停乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病，如奶牛乳房炎。

所述停乳链球菌包括但不限于菌株CVCC 3938。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现抗菌肽NZ2114对鱼源无乳链球菌的高抗菌活性及对罗非鱼链球菌病的防治作用。实验表明，NZ2114对无乳链球菌具有高效、快速杀菌、低耐药的作用。与氟苯尼考(Ff)相比，NZ2114显示出了对S.agalactiae ACCC 61733更好的抗菌活性，MIC值为0.11μM，远低于Ff的5.59μM，NZ2114的MPC(Mutantpreventi On concentration)为3.64μM，选择指数SI为32，低于Ff，表明NZ2114的预防耐药能力低于后者，此外在256×MIC下的溶血率仅为0.81％，在与25％血清和血浆共孵育60min 后，NZ2114分别保留99.3％和98.6％的活性。此外，在罗非鱼感染无乳链球菌模型中， NZ2114可提高感染罗非鱼的存活率、抑制其脏器荷菌量、保护脏器组织损伤，对S. agalactiae感染的罗非鱼有较好的保护作用，NZ2114显示出成为治疗由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病新型制剂的潜力。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中NZ2114对无乳链球菌ACCC 61733杀菌动力学曲线。

图2为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114对罗非鱼红细胞的溶血性测定结果。

图3为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114在罗非鱼血清中的稳定性。

图4为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114在罗非鱼血浆中的稳定性。

图5为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733细胞膜完整性的影响。

图6为本发明较佳实施例中扫描电镜观察抗菌肽NZ2114对S.agalactiae ACCC61733的细胞形态的影响。

图7为本发明较佳实施例中孵育环境对抗菌肽NZ2114杀菌能力的影响。

图8为本发明较佳实施例中超分辨显微镜观察抗菌肽NZ2114在S.agalactiaeACCC 61733中的定位。

图9为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114治疗S.agalactiae ACCC 61733感染罗非鱼的存活率。

图10为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114治疗S.agalactiae ACCC 61733感染罗非鱼的脏器荷菌量。

图11为本发明较佳实施例中抗菌肽NZ2114治疗S.agalactiae ACCC 61733感染罗非鱼的组织病理学切片。

具体实施方式

本发明提供菌丝霉素衍生肽NZ2114在杀灭无乳链球菌(如临床分离菌株无乳链球菌ACCC 61733)中的应用。以抗菌肽NZ2114为研究对象，以无乳链球菌ACCC 61733 为指示菌，检测了NZ2114对无乳链球菌的抗菌活性、在血清/血浆中的稳定性、对红细胞的溶血性。并通过使用流式、扫描、超分辨等技术阐明其作用机制和靶点，最后通过人工感染建立罗非鱼链球菌病模型，从存活率、脏器荷菌数、组织病理学切片等实验初步评价不同给药方式和剂量的NZ2114对无乳链球菌感染的体内治疗效果。实验表明，NZ2114对无乳链球菌具有快速、高效杀菌、低耐药的特点。NZ2114通过抑制细菌细胞壁合成来杀灭细菌；在256×MIC下的溶血率仅为0.81％；在与25％血清和血浆共孵育60min后，分别保留99.3％和98.6％的活性。注射和饲喂NZ2114均对S.agalactiae 感染的罗非鱼有较好的保护作用，均可降低感染罗非鱼的存活率、抑制其脏器荷菌量。保护脏器组织损伤，结果表明NZ2114具备成为罗非鱼链球菌病新型治疗剂的临床应用潜力。

本发明的抗菌肽NZ2114对无乳链球菌的抗菌活性和杀菌速率优于Ff，且溶血率低、血浆和血清稳定高，具备独特的靶向细胞壁的杀菌机制，对无乳链球菌具有较强的体外杀菌作用，具有较高的血清和血浆的稳定性具有极低的溶血性。此外，NZ2114 对S.agalactiae感染的罗非鱼有较好的保护作用，可降低感染罗非鱼的存活率、抑制其脏器荷菌量、保护脏器组织损伤。NZ2114有望被开发成为治疗由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病的新型制剂。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。

本发明还提供抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

进一步地，所述疾病是指由无乳链球菌所导致的相关疾病。

所述疾病包括罗非鱼链球菌病。

本发明还提供抗菌肽NZ2114抑制无乳链球菌的机理。

本发明中，无乳链球菌可以是从患链球菌病的罗非鱼体内分离获得的临床菌株，也可以是标准株，如ATCC 13813。

以下实施例中使用的动物、菌株、培养基及主要仪器如下：

健康罗非鱼(体重为50±5g)购自天津早春市水产养殖有限公司。无乳链球菌(S.agalactiae)ACCC 61733来自中国水产科学研究院南海渔业研究所，保存于中国农业培养物保藏中心(ACCC)，并被选为以下研究的目标病原体。S.agalactiae ATCC 13813 购自美国菌种保藏中心(ATCC)。从牛乳腺炎组织中分离的S.agalactiae CAU-FRI 1、 CAU-FRI 2、CAU-FRI 3和CAU-FRI 4来自中国农业大学。从罗非鱼中分离得到的S. agalactiaePBSA0903来自海南大学。停乳链球菌CVCC 3938购自中国兽医培养物保藏中心(CVCC)。抗菌肽NZ2114由中国农业科学院饲料研究所基因工程室经毕赤酵母重组表达制备，纯度＞95％。使用的所有其他化学试剂均为分析级。

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基购自北京奥博星生物科技有限公司；氟苯尼考(Ff)购自中国兽医药品监察所；其它试剂均属于国产分析纯级别。高速冷冻台式离心机(Sigma 3K15)购自Sigma公司；振荡培养箱 (ZQZY-85BN)购自上海精宏实验设备有限公司；超净工作台(SWCJ-2FD)购自苏净集团设备有限公司；FACSalibur流式细胞仪购自BD公司；扫描电镜(QUANTA 2100PRO)购自荷兰Philips公司；超分辨显微镜(N-SIMS)购自日本Nikon公司。

抗菌肽LF5的氨基酸序列为：FKAFRWAWRWKKLAAPS。

抗菌肽N2的氨基酸序列为：AFCWNVCVYRNAVRVCHRRCN。

实施例1抗菌肽NZ2114、LF5、N2对S.agalactiae最小抑菌浓度的测定

微量肉汤稀释法测定NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733的抑菌活性。将指数生长期的S.agalactiae菌液用培养基制备成浓度为1×10⁵CFU/mL的菌悬液，NZ2114粉末溶解于0.01mol/L PBS(pH 7.4)并按2倍梯度浓度配置成0.0625-128μg/mL的肽溶液；按照1:9的体积比在96孔板中分别加入肽溶液和菌悬液，然后静置于37℃培养箱中无菌培养18-24h，空白对照、阳性对照、阴性对照分别为无菌TSB肉汤、Ff和PBS，每个浓度设3个重复，以肉眼看不到浑浊的最小药物浓度为MIC数值。结果如表1所示：

表1 NZ2114对细菌的MIC值

实施例2抗菌肽NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733最低预防耐药抑菌浓度(MPC)的测定

以实施例1中MIC为基础，将PBS溶解的NZ2114溶液与灭菌后的固体培养基TSA 混合后2倍梯度配制药物平板，药物终浓度从1×MIC到64×MIC，另将指数生长期的S.agalactiae ACCC 61733菌液浓度浓缩至3.0×10¹⁰CFU/mL。取100μL菌液均匀涂布于制备好的NZ2114药物平板上。并置于37℃恒温孵育。以72h不出现菌落生长的最低药物浓度为MPC。结果如表1所示。MPC与MIC的比值为(Selection index)SI，SI值反映抗菌药物限制耐药突变株选择的能力，SI值越低预防耐药的能力越强，NZ2114 的选择指数为32，Ff>64，说明NZ2114的预防耐药突变能力大于Ff。

表2 NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733的MPC和SI值

实施例3抗菌肽NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733的杀菌动力学曲线

将指数生长期的S.agalactiae ACCC 61733浓度稀释为1×10⁵CFU/ml，然后与终浓度为1×MIC～4×MIC的NZ2114溶液混合振荡培养，条件为37℃、250rpm；空白对照、阳性对照分别为PBS和Ff，在不同的时间点(0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、 24h)取100μl细菌样本，用固体培养基TSA进行菌落计数，并绘制NZ2114的时间杀菌曲线。结果如图1所示，NZ2114的杀菌速率均呈浓度依赖性，并且NZ2114对S. agalactiae ACCC 61733杀菌速率远高于Ff，2h内，1×MIC～4×MIC的NZ2114对病原菌的杀菌率为99％，且不发生反弹，而1×MIC的Ff仅能发挥抑制作用，在2×MIC下孵育 6h才能达到99％的杀灭率，表明NZ2114比Ff具有显著的杀菌速率和杀菌效果优势。

实施例4抗菌肽NZ2114对罗非鱼红细胞的溶血性试验

NZ2114溶解于0.01M PBS(pH7.4)中，并配制成2-512μg/ml的肽溶液备用，健康吉富罗非鱼尾静脉采血，抗凝管收集全血，4℃、1500rpm条件下离心5min，弃去上清并用0.9％的生理盐水轻洗红细胞两到三次直至上清无色透明，用生理盐水制备成红细胞浓度为8％的悬浮液。将红细胞悬浮液与不同浓度的NZ2114溶液等体积混合加入96孔板，以生理盐水和0.1％Triton X-100作为空白对照和100％溶血的阳性对照， 37℃下静置孵育1h，然后在4℃、1500rpm条件下离心5min，将上清转移至96孔板中，用酶标仪检测紫外吸光值(540nm)。溶血率计算公式为：

溶血率(％)＝[(Abs540nm_NZ2114－Abs540nm_生理盐水)/(Abs540nm0.1％_{Triton X-100}－Abs540nm_生理盐水)]×100％

结果如图2所示，NZ2114在1～256μg/ml浓度下对罗非鱼红细胞几乎无溶血作用；当肽浓度达到256μg/ml时，溶血率仅为0.81％，表明NZ2114作为腹腔和静脉注射药物使用是相对安全的。

实施例5抗菌肽NZ2114在罗非鱼血清和血浆中的稳定性

MHA固体培养基灭菌后冷却至50-60℃，加入指数生长期的S.agalactiae ACCC61733，制备成菌终浓度为1×10⁶CFU/ml的平板。吉富罗非鱼尾静脉采血，抗凝管/ 促凝管收集全血，1500rpm、4℃条件下离心5min，分别获得罗非鱼血清和血浆。 NZ2114溶解于0.01M PBS并与罗非鱼血清和血浆混合，制备成血清血浆终浓度为 25％、NZ2114终浓度为100μg/mL的混合溶液。混合溶液静置于37℃培养箱中孵育，在不同的时间点(0、0.5、1、1.5、2h)，取30μL混合液悬滴至制备好的MHA平板上，37℃培养16-24h，培养结束后测定抑菌圈直径。PBS制备的NZ2114(100μg/mL)、 25％血清/血浆分别为阳性对照，和阴性对照。结果如图3、图4所示，NZ2114与25％血清和血浆共孵育60min后，NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733分别保留99.3％和 98.6％的活性，表明NZ2114在罗非鱼血清和血浆中具有极高的稳定性。

实施例6抗菌肽NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733细胞膜完整性分析

将对数生长期的S.agalactiae菌液浓度调整为1×10⁸CFU/mL，加入NZ2114至终浓度为1×MIC～4×MIC，于37℃条件下分别孵育30min和2h，Ff和PBS分别作为阳性对照和阴性对照，孵育结束后将样品4000rpm离心5min，弃去上清；加入PBS反复洗涤3次，最后一次加入PBS(用0.22μM滤膜过滤)重悬，然后加入终浓度为50μg/mL 碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)染液，室温静置孵育15min，最后上流式细胞仪检测。结果如图5所示，经PBS、4×MIC Ff、4×MIC NZ2114处理2h后，PI对S.agalactiae ACCC 61733的细胞质膜穿透率分别为0.88％、1.57％、1.29％，表明细菌细胞质膜完整，NZ2114对无乳链球菌细胞膜无穿透作用，其杀菌机制为非破膜机制。

实施例7抗菌肽NZ2114对S.agalactiae ACCC 61733细胞形态的影响

将对数生长期的S.agalactiae浓度调整为1×10⁸CFU/mL，加入NZ2114至终浓度为4×MIC，以等体积PBS、Ff分别作为为空白对照和阳性对照，37℃条件下孵育2h，孵育结束后4000rpm离心5min，弃上清；用0.01mol/L PBS轻洗菌体三次，弃尽上清后缓慢加入0.01mol/L PBS配置的2.5％的戊二醛缓冲液，重悬菌体，4℃放置固定过夜。次日先后用50％-70％-85％-95％-2次-100％的乙醇梯度脱水漂洗，每次15min，脱水后样品经过临界点干燥仪干燥，然后用离子溅射仪使样品表面镀膜，最后用 S-4800型扫描电子显微镜进行观察。结果如图6所示，空白处理组S.agalactiae细胞形态表面饱满光滑，无内容物泄出；S.agalactiae在Ff作用下，细胞表面肿胀变形，细胞表面出现一些丝状粘连，细胞不能正常分裂，经NZ2114处理后，细菌数量有所减少，但细胞形态无明显变化，说明NZ2114的杀菌靶点不在胞内。

实施例8孵育环境对NZ2114杀菌能力的影响

将对数生长期的S.agalactiae ACCC 61733分别用PBS和TSB培养基稀释至1×10⁶CFU/mL，加入NZ2114、Ff、青霉素、庆大霉素、链霉素、乳链菌肽至药物终浓度为 4×MIC，37℃培养2h，孵育结束后取样品100μL在TSA平板上进行菌落计数。结果如图7所示，庆大霉素、链霉素和乳链菌肽等为非靶向细胞壁机制的药物，它们在PBS 和TSB中对S.agalactiae表现出相似的杀菌能力。NZ2114在PBS溶液中与S.agalactiae 共孵育时，细菌数量几乎没有变化，而当NZ2114处于在TSB环境中，其杀菌能力显著提高，菌落数浓度与CK组相比降低了5.3个数量级，与作用机制为靶向细胞壁的青霉素处理组结果相似(PBS中不杀菌，在TSB环境中降低了3.9个数量级)，说明NZ2114 的作用靶点可能为细胞壁。

实施例9抗菌肽NZ2114在S.agalactiae ACCC 61733中的定位

将指数期S.agalactiae ACCC 61733浓度调整为1×10⁸CFU/mL，加入FITC-NZ2114至终浓度为4×MIC，37℃下共孵育30min。孵育结束后先用0.01M PBS洗涤两次，再用10μg/mL DAPI和PI在4℃下染色15min，PBS洗涤2次后重悬。取5μL样品和2μL 防荧光淬灭剂滴加至多聚TM显微镜载玻片上，并用盖玻片密封，以未加FITC-肽处理的细胞作为空白对照，最后上N-SIMS(超分辨显微镜)观察。结果如图8所示，在空白对照组中仅观察到蓝色荧光(DAPI)染色的细胞核。FITC-NZ2114处理组观察到绿色荧光(FITC-NZ2114)环状分布于分裂的子细胞的细胞壁上，表明NZ2114可以与 S.agalactiae的细胞壁结合阻止其继续分裂，结合实施例8结果，说明细胞壁是NZ2114 的主要靶点。

实施例10 NZ2114治疗S.agalactiae ACCC 61733感染罗非鱼存活率测定

S.agalactiae ACCC 61733培养至对数生长期，通过设置S.agalactiae梯度攻毒浓度，确定S.agalactiae对罗非鱼的半致死剂量LD₅₀。将312尾健康罗非鱼随机分为8组 (无攻毒无治疗组；攻毒不治疗组；5mg/kg、10mg/kg、20mg/kgNZ2114注射组； 15mg/kg Ff注射组；50mg/kgNZ2114饲喂组以及20mg/kg Ff饲喂组)，每组39尾，并设上、中、下三个重复，每个重复13尾。攻毒前暂养于循环过滤水箱中，待鱼体状态稳定后以腹腔注射方式对所有处理组进行S.agalactiae攻毒，攻毒剂量为半致死浓度LD₅₀，空白对照组注射等体积的0.9％NaCl。攻毒1h后，以腹腔注射方式分别进行 NZ2114低、中、高(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)与10mg/kg Ff给药，阴性对照组、空白对照组为腹腔注射等体积0.9％NaCl。饲喂组(NZ2114饲喂组，50mg/kg，Ff饲喂组，15mg/kg)在攻毒后的1h开始根据鱼的体重给投喂实验药，一天投喂3次，投喂7 天，连续14天观察每组鱼的存活率。结果如图9所示，攻毒不治疗组中的罗非鱼14天内的存活率在所有处理组中死亡率最低，仅为66.7％；15mg/kg Ff饲喂组，高、中剂量NZ2114注射组存活率达到100％，低剂量NZ2114注射组、50mg/kg NZ2114饲喂组存活率96.9％，10mg/kg Ff注射组存活率为93.9％。说明注射和饲喂NZ2114均对无乳链球菌感染的罗非鱼有较好的保护作用，高中剂量注射效果最好，饲喂和低剂量注射次之。

实施例11抗菌肽NZ2114治疗S.agalactiae ACCC 61733感染罗非鱼脏器荷菌量测定

按照实施例10方法对罗非鱼进行攻毒和给药，在攻毒后的第7d及14d，各处理组每个重复随机取3尾鱼，用鱼安定(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐800mg/L)进行麻醉，解剖后采集肝脏、肾、脾脏、脑等脏器组织，称重后进行组织匀浆，涂板后置于37℃过夜培养，次日进行菌落计数。统计各处理组中单位质量的鱼脏器荷菌量。结果如图10所示。

7d取样单位质量器官的荷菌量显示，经高、中、低剂量NZ2114注射组以及NZ2114饲喂组治疗，罗非鱼体内肝脏、脑、肾脏、脾脏的荷菌量均显著下降；其中，NZ2114 饲喂组肝、脑、脾、肾脏器荷菌量分别下降2.14、3.03、2.49和3.06个数量级(攻菌未治疗组为5.08LgCFU/g)；高剂量NZ2114注射组下降2.74、2.88、2.76、2.91个数量级；中剂量NZ2114注射组下降2.64、2.97、2.07、2.74个数量级；低剂量NZ2114注射组下降2.07、2.49、1.98、2.42个数量级。NZ2114各处理组与Ff饲喂组(肝、脑、脾、肾荷菌量下降3.05、2.82、2.63、2.94个数量级)、Ff注射组(2.26、2.52、2.21、2.55个数量级)基本相当。在第14d取样时，仅在阴性对照和低剂量NZ2114注射组中检测到病原菌，且低剂量NZ2114注射组相较于对照组肝脏、脑、脾、肾脏器荷菌量下降1.54、 2.07、1.55、2.19个数量级，表明在NZ2114治疗干预下，感染病原菌被有效抑制，且注射和饲喂NZ2114均对罗非鱼有较好的保护作用。

实施例12抗菌肽NZ2114治疗S.agalactiae ACCC 61733感染罗非鱼组织病理学观察

按照实施例10方法对罗非鱼进行攻毒和给药，在攻毒后的第7d，各处理组每个重复随机取3尾鱼，用鱼安定(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐800mg/L)进行麻醉，解剖后采集肝脏、肾、脾脏、肠等组织，将样品固定在浓度为4％的多聚甲醛中，4℃下脱水，然后先后进行(1)脱水包埋：切片(4μM)、烤片(55℃)；(2)二甲苯脱蜡：五道，每道10min；(3)水化：Harris苏木素液染色5-10min；(4)伊红液染色(95％乙醇溶液)30s；(5)中性树胶封片，最后用OLYMPUS BX43显微镜观察。结果如图11所示：空白处理组罗非鱼各脏器组织形态健康，组织细胞饱满、排列均匀。阴性处理组各脏器组织均出现一定程度的病理特征：肝组织间质弥漫性炎症细胞浸润，炎症病变累及范围广泛，肝小叶结构不清晰，肝细胞排列紊乱；肠组织炎症病变明显，局部可见透壁性炎症，肠组织间质可见大量粒细胞浸润，局部肠隐窝消失，粘膜上皮受损；脾组织肿胀、充血，白髓明显(反应性)扩大；可见大量的衰老血细胞碎片沉积；肾组织间质弥漫性炎症细胞浸润，炎症病变累及范围广泛，大量肾小管萎缩，局部纤维组织增生。高、中、低剂量NZ2114注射组炎症程度呈现一定的剂量效应，高剂量处理组各脏器组织健康无炎性症状，中剂量组局部肝组织和肾组织存在少量炎症细胞浸润，低剂量组肠组织局部炎症明显部位粒细胞数量增多，局部肠隐窝消失，肾组织间质存在弥漫性炎症细胞浸润，Ff注射组，存在肝细胞空泡和少量炎症细胞浸润，脾组织存在局部肿胀、充血，动脉周围淋巴细胞密度、数量有一定降低； NZ2114饲喂组，肠粘膜固有层存在少量炎症细胞浸润，局部脾组织生发中心明显，白髓轻度反应性扩大，Ff饲喂组，局部肝组织中央静脉及汇管区周围明显有炎症细胞浸润，局部肝细胞空泡样变性，局部肾组织间质可见少量散在淋巴细胞浸润。与阴性处理组相比，注射和饲喂NZ2114组组织形态和炎症表征均显著改善。表明注射和饲喂NZ2114均可有效抑制脏器组织病变。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用

<130> KHP221114859.3

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asn Glu Asp Asp Leu Arg Cys His

1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

35 40

Claims (10)

1.抗菌肽NZ2114在制备无乳链球菌(Streptococcus.agalactiae)抗菌药物或组合物中的应用；

抗菌肽NZ2114包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

2.抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用；其中，抗菌肽NZ2114同权利要求1中所述。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病是指由无乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病包括链球菌病。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述无乳链球菌包括如下菌株：ACCC 61733、ATCC 13813、CAU-FRI 1、CAU-FRI 2、CAU-FRI 3、CAU-FRI 4、PBSA0903。

6.抗菌肽NZ2114在制备停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)抗菌药物或组合物中的应用；其中，抗菌肽NZ2114同权利要求1中所述。

7.抗菌肽NZ2114在制备治疗或预防停乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用；其中，抗菌肽NZ2114同权利要求1中所述。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疾病是指由停乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疾病包括奶牛乳房炎。

10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述停乳链球菌包括菌株CVCC3938。

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