CN109678944A - 一种抗菌多肽hf-18及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗菌多肽hf-18及其制备方法和应用 Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种抗菌多肽HF‑18及其制备方法和应用，该抗菌多肽HF‑18的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明从八目鳗鱼多肽HFIAP‑1出发，通过构效关系研究，获得α螺旋程度较好的18个氨基酸的多肽，并将其第12位的组氨酸替换为赖氨酸及第14位的甘氨酸替换为疏水性的苯丙氨酸，得到多肽HF‑18(GFFKKAWRKVKKAFRRVL)。本发明制备所得的多肽HF‑18，α螺旋程度和疏水性提高，合成成本降低，具有良好的体内外抗菌活性，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

Description

一种抗菌多肽HF-18及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种抗菌多肽HF-18及其制备方法和应用。
背景技术
感染性疾病作为一种高发病率与高致死率的疾病严重威胁人类健康，抗生素一直以来是人类对抗细菌感染的首选药物。但是研究数据表明抗感染新实体药物在九十年代达到了顶峰随后急剧下降，抗菌药物发现迟缓。全球每年约有2000万人死于耐药细菌感染，但近几十年来临床抗生素的滥用导致全世界范围内耐药性细菌的出现，给抗生素临床用药增加了困难。
多肽是机体先天免疫系统的一个重要组成部分，在自然界中普遍存在，来源于广泛：比如：动物、植物、细菌和真菌等。尽管它们来源及序列不同，但多肽的结构特征还存在一些共性：①它们一般由10～50个氨基酸组成，②具有两亲性和阳离子性，③多肽发挥抗菌活性的二级结构通常为α螺旋。大多数多肽具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、原虫、真菌甚至病毒都有良好的杀伤作用。除对病原菌直接杀伤作用外，一些多肽还具有免疫调节作用。由于阳离子多肽对生物被膜具有物理破坏作用，细菌较难通过靶点的突变对多肽产生耐药性，这是其相对于抗生素最大的优势所在。目前，多肽因其抗菌谱广、不易产生耐药性等优势有望成为临床治疗感染性疾病的新型替代物；近年来，引起了国内外研究人员的广泛重视。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种抗菌多肽HF-18，本发明的多肽具有良好的体内外抗菌活性，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。
本发明还提供抗菌多肽HF-18的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种抗菌多肽HF-18，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
Gly-Phe-Phe-Lys-Lys-Ala-Trp-Arg-Lys-Val-Lys-Lys-Ala-Phe-Arg-Arg-Val-Leu。
其中，所述多肽氨基酸序列短，其中第12位由模板肽的组氨酸突变为正电荷的赖氨基和第14位的甘氨酸突变为疏水性的苯丙氨酸，提高了多肽HF-18整体的正电荷和疏水性并降低了多肽合成成本。
本发明所述的抗菌多肽HF-18的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)以多肽HFIAP-1为模板，对其序列保守且α螺旋高度集中的区域进行截取，从N端第1位开始截取将多肽氨基酸个数由37个减少为18个；
(2)再以截取的18个氨基酸为模板，将其第12位的组氨酸替换为正电荷的赖氨酸及第14位不利于α螺旋形成的甘氨酸替换成疏水性的苯丙氨酸，其整体的正电荷由7提高为8，疏水性值由0.207提高为0.244；再将HF-18的氨基酸序列合成多肽HF-18。
其中抗菌多肽HF-18的合成采用常规的多肽固相合成法合成。
本发明所述的多肽HF-18在制备抗病原菌感染药物中的应用。
其中，所述抗病原菌感染药物包括抗细菌和真菌感染药物。
进一步地，所述细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌，幽门螺旋杆菌；真菌为新生隐球菌。
本发明所述的一种药物组合物，包含权利要求1所述的抗菌多肽HF-18及其药学上所接受的载体。
本发明涉及的病原性细菌和病原性真菌以及幽门螺旋杆菌SS1，包括：ATCC来源的标准菌株和临床分离的菌株。
本发明的抗菌多肽HF-18以多肽HFIAP-1(SEQ ID NO:2GFFKKAWRKVKHAGRRVLDTAKGVGRHYVNNWLNRYR)为模板，HFIAPs是由八目鳗肠壁结缔组织中提取的一类阳离子多肽，HFIAP-1是源于HFIAPs的一种衍生肽，由37个氨基酸组成，具有抗菌效果。本发明对其α螺旋程度较好的N端的18个氨基酸进行截取，并将其中不利于α螺旋形成的第12位的组氨酸替换为赖氨酸及第14位的甘氨酸替换为疏水性的苯丙氨酸。设计所得的多肽HF-18，α螺旋程度、正电荷和疏水性提高，氨基酸数量大幅减少，合成成本降低，同时相比HFIAP-1具有更强的抗菌。本发明中的多肽具有良好的体内外抗菌活性，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。
本发明的抗菌多肽HF-18以多肽HFIAP-1为模板，对其N端氨基酸进行截取并进行定点突变，采用固相合成法获得具有广谱抗菌活性的多肽HF-18。本发明抗菌多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。全序列为甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-色氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-亮氨酸。
本发明的抗菌多肽HF-18的改造是以HFIAP-1为模板进行的设计，截取了HFIAP-1N末端的18个氨基酸，并将其第12位的组氨酸替换为正电荷的赖氨酸及第14位不利于α螺旋形成的甘氨酸替换成疏水性的苯丙氨酸，最终达到减少多肽氨基酸个数从而降低成本，并且达到维持抗菌活性的目的。
本发明制备的抗菌多肽HF-18体外抗菌试验结果表明，本发明的抗菌多肽HF-18在截掉HFIAP-1N末端的18个氨基酸并进行定点突变的条件下仍能保持较广的抗菌谱，但是相对于母肽HFIAP-1的成本大大降低。同时杀菌曲线结果表明，多肽HF-18对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和新生隐球菌的临床菌株均显示出良好的杀菌活性，能在12h内将试验用菌几乎杀灭，而且对金黄色葡萄球菌的杀菌效果更为显著，能在1h内将其全部杀灭。
本发明制备的抗菌多肽HF-18体外毒性研究表明，本发明的抗菌多肽HF-18对绵羊红细胞溶血活性低，在HF-18的有效作用范围内溶血活性可以忽略。
小鼠腹腔感染细菌构建菌血症模型研究本发明制备的抗菌多肽HF-18体内抗菌活性，结果表明，本发明的多肽HF-18能够显著提高耐药金黄色葡萄球菌感染的小鼠的生存率，对其体重维持有一定程度的保护，降低感染小鼠的血液和肺、肾、脾和肝组织的菌载量。且对感染小鼠的炎症反应有一定的缓解作用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明制备的抗菌多肽HF-18具有氨基酸序列短、正电荷和疏水性高、合成成本降低的优点，同时还具有广谱抗菌活性，相对于模板肽HFIAP-1抗菌活性明显提高。
2、本发明抗菌多肽HF-18的设计制备方法简单方便，设计新颖，原料来源易得，可以工业化生产应用。
3、本发明制备的抗菌多肽HF-18可以应用在制备抗病原菌感染药物中，具有良好的体内外抗菌活性，可以应用于各种普通感染及顽固感染性疾病，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。
附图说明
图1是本发明抗菌多肽HF-18的HPLC图谱；
图2是HF-18的Mass图谱；
图3是HF-18对表皮葡萄球菌的杀菌曲线图；
图4是HF-18对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线图；
图5是HF-18对大肠埃希菌的杀菌曲线图；
图6是HF-18对铜绿假单胞菌的杀菌曲线图；
图7是HF-18对新生隐球菌的杀菌曲线图；
图8是HF-18对绵羊红细胞的溶血活性；
图9是HF-18对菌血症小鼠的生存保护作用；
图10是HF-18对菌血症小鼠的体重保护作用；
图11是HF-18对菌血症小鼠血液中细菌数的影响；
图12是HF-18对菌血症小鼠肺组织细菌数的影响；
图13是HF-18对菌血症小鼠肝组织细菌数的影响；
图14是HF-18对菌血症小鼠脾脏中细菌数的影响；
图15是HF-18对菌血症小鼠肾脏中细菌数的影响。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
抗菌多肽HF-18制备：
(1)以多肽HFIAP-1为模板，对其序列保守且α螺旋高度集中的区域进行截取，从N端第1位开始截取将多肽氨基酸个数由37个减少为18个，降低合成成本；
(2)再以截取的18个氨基酸为模板，将其第12位的组氨酸替换为正电荷的赖氨酸及第14位不利于α螺旋形成的甘氨酸替换成疏水性的苯丙氨酸，其整体的正电荷由7提高为8，疏水性值由0.207提高为0.244，从而得到多肽HF-18氨基酸序列。
(3)固相合成法合成多肽HF-18
制备的HF-18的氨基酸序列为：甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-色氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-亮氨酸。
多肽的合成：多肽HF-18的合成从C端到N端逐个进行后。将Fmoc-Val-Wang Resin用二氯甲烷浸泡15min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液(每克树脂10ml)，使用氮气鼓动，反应2次，时间为5min和15min，反应结束后用DMF洗涤树脂9次。取20～40颗树脂加入验色剂ABC各2-3滴(A液：茚三酮/无水乙醇溶液；B液：吡啶；C液：苯酚/无水乙醇溶液，A、B、C液均加2-3滴即可)在100℃下共热3min，溶液及树脂颜色变为蓝色，以脱除氨基保护。加入过量反应两倍摩尔数的Fmoc-Val-OH和HOBT，用每克树脂10ml的DMF溶解，加入两倍摩尔数的DIC和Collidine，氮气鼓动，反应1h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各Fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入TFA，在恒温摇床中反应2h，摇床转速110r/min，温度25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得HF-18粗品多肽。
多肽的纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质。同时过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。
实施例2
多肽HF-18的纯度测定(HPLC法)及质谱分析结果：
实施例1多肽HF-18合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。
液相色谱分析条件：C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1％三氟乙酸的纯净水。检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；进样量20μl，进行梯度洗脱。梯度洗脱条件见表1。
表2梯度洗脱条件
由图1以看出，本发明实施例1制备的多肽HF-18的纯度大于98％。
由图2以确定，HF-18的分子量为2265.85，与理论值相吻合。
实施例3
本发明多肽HF-18体外抗菌活性的测定
(1)菌种的复苏与活化
将冻存于-20℃的实验用菌种从甘油管转接至相应的琼脂斜面培养基(细菌转接至营养琼脂斜面、真菌至沙氏葡萄糖琼脂斜面)中。细菌置于37℃培养24h，真菌置于25℃培养48h，放置4℃的冰箱中备用。
(2)菌液的制备
将斜面中的菌体接种少许，转接至2ml相应的液体培养基中，37℃或25℃培养8h，用液体培养基稀释成105CFU/ml的菌悬液，备用。
(3)药物的配制
称取实施例1制备的多肽HF-18，以及HFIAP-1分别溶解于生理盐水，将其均配制成1024μg/ml的母液，经0.22μm的水相滤头过滤除菌，EP管分装，保存于-20℃，备用。
(4)多肽HF-18和HFIAP-1对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定。
两个多肽的MIC和MBC检测方法相同。即多肽药物用液体培养基倍比稀释成不同浓度梯度后，各取100μl于96孔板中，并等体积接种100μl的105CFU/ml的菌悬液，使药物终浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，同时200μl的液体培养基空白对照组，100μl菌悬液加入等体积的液体培养基作为阳性对照组。细菌置37℃培养16～18h，真菌置25℃培养48h，酶标仪在595nm处检测各孔的吸光度值。以完全能够抑制菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
取上述MIC测定的96孔板中未见菌落生长的培养物100μl，加入900μl无菌培养基稀释后，转移至无菌平皿中，加入约10.0ml温度55℃培养基，细菌置37℃培养24h，真菌置28℃培养48h，观察并记录平板上的菌落数，菌落数小于5个的最低药物浓度，记为MBC值，结果见表2：
表2多肽HF-18对细菌和真菌的MIC值和MBC值
a临床分离的菌株。幽门螺旋杆菌SS1为幽门螺旋杆菌悉尼株Hp SS1。
由表2可看出，HF-18具有广谱的抗菌活性，对标准及临床细菌均表现出较好的抗菌活性，MIC值在4～16μg/ml的范围内，MBC值在8～16μg/ml的范围内；对临床新生隐球菌的MIC值仅为4μg/ml，MBC值为8μg/ml；对幽门螺旋杆菌的MIC值仅为16μg/ml，MBC值为64μg/ml。而多肽HFIAP-1对标准及临床细菌的MIC和MBC均值在8～>512μg/ml；对幽门螺旋杆菌的MIC和MBC值均是>512μg/ml，表2结果说明多肽HF-18具有比HFIAP-1更好的抗细菌和真菌的活性。
(5)多肽HF-18的杀菌曲线
将营养肉汤或沙氏葡萄糖液体培养基稀释菌悬液至细菌浓度约105CFU/ml，加入多肽HF-18(浓度：4×MIC)，细菌置37℃恒温培养，真菌则置25℃恒温培养。在0、30、60、120、240、480、720min时取出200μl混合培养液进行梯度稀释，然后倒平板进行活菌计数。生理盐水组设为空白对照组，每个稀释梯度均设三个平行，以菌落对数的值为纵坐标，多肽的作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见附图3-7。
附图3-7分别是HF-18对各实验菌株的杀菌作用，杀菌效果显著，12h内可使表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜绿假单胞菌和新生隐球菌临床株下降约5个lgCFU。细菌及真菌可被完全杀死。且对金黄色葡萄球菌的杀灭速度最快，可在1h内将其全部杀死，表明抗菌多肽HF-18具有良好的杀伤作用。
实施例4
抗菌多肽HF-18对绵羊红细胞溶血活性的影响
抗菌多肽HF-18对绵羊红细胞溶血活性的影响：用注射器吸取脱纤维的绵羊血8.0ml加至无菌EP管中，冷冻离心机3000rpm离心，时间为10min，弃上清，PBS(pH7.4)洗3次。沉淀红细胞用PBS重悬，制成3％体积分数的红细胞悬液。分别吸取100μl的绵羊红细胞悬液加入96孔板中，并等体积加入倍比稀释好的多肽药物，使多肽的终浓度为512、256、128、64、32、16、8μg/ml。加入等体积1％Triton X-100的红细胞组为阳性对照组，PBS处理的绵羊红细胞设为阴性对照组，每组3个复孔。96孔板置于37℃恒温培养1h后取出，在4℃温度下，3000rpm/min离心10min。吸取上清，用酶标仪读取在450nm处各孔的OD值，并计算溶血率，公式如下：
溶血率＝(加药组OD450-阴性对照组OD450)/(阳性对照组OD450-阴性对照组OD450)×100％
由附图8可看出，绵羊红细胞的溶血率随多肽浓度的增加略有所增加。但在最高浓度512μg/ml时，绵羊红细胞的溶血率不超过10％。综合多肽MIC值的范围可看出：HF-18在有效的作用范围内，其溶血活性低。
实施例5
本发明抗菌多肽HF-18对菌血症模型小鼠的保护作用
取健康体重在20～22g的ICR小鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组16只。5组小鼠腹腔接种MLD浓度的细菌悬液(0.5ml/只)进行感染，建立菌血症模型；同时等体积生理盐水腹腔注射的小鼠为正常对照组。其余造模组分为10mg/kg HF-18(高剂量组)(实施例1制备)、5.0mg/kg HF-18(中剂量组)(实施例1制备)、2.5mg/kg HF-18(低剂量组)(实施例1制备)、5mg/kg多粘菌素(阳性对照组)、生理盐水(模型对照)。多肽HF-18给药组和生理盐水组分别在感染0.5h、2h之后腹腔给药两次，多粘菌素组在感染2h之后尾静脉给药一次。连续观察7天并记录小鼠的死亡情况及体重变化情况。
小鼠在感染8h后，眼眶取血约400μl，用肝素钠抗凝。无菌生理盐水分别按×5，×10，×20倍稀释样品，得到不同浓度梯度的血浆稀释液，并且在感染8h后取小鼠的肝、肺、肾和肾脏组织，置于无菌的EP管中，加入相应的9倍体积的生理盐水，电动匀浆仪在4℃条件下制备匀浆液。取组织匀浆液，分别以×2,×5,×10,×15倍进行稀释，得到不同浓度梯度的组织匀浆稀释液。再取各稀释液1.0ml加入无菌平板中，倒平板法加入恒温的56℃左右的营养琼脂培养基约10ml，混匀充分，凝固后，置于37℃恒温培养18～24h，观察并且记录平板上的菌落数。每个稀释梯度有三个对照，最后以平均值表示各组小鼠血液和组织匀浆液中细菌的存活数量。结果见附图9-13。
由附图9可以看出，模型组小鼠因为细菌感染大部分死亡，而多肽的中、高剂量给药组相较于模型组，小鼠存活率分别提高了35％和50％，而多粘菌素组的小鼠存活率虽然也是相对提高了50％，但是比多粘菌素高剂量组的小鼠提前1天死亡，证明多肽HF-18对细菌感染小鼠有一定的保护作用，并且在一定浓度范围内多肽的体内药效呈剂量依赖性变化。
由附图10可以看出，模型组小鼠感染细菌后体重下降明显，而未死亡的小鼠体重有缓慢程度的恢复。而多肽HF-18和多粘菌素给药组，小鼠的体重相对于模型组恢复的更快，说明多肽HF-18对小鼠的体重也有一定的保护作用。
由附图11可以看出，感染8h后，小鼠血液中细菌数目约为106CFU/ml，多粘菌素能显著降低小鼠血液中的细菌数目，多肽HF-18中剂量组相对于模型组细菌数降低了1.5个log值，而高剂量组降低了将近1.6个log值，与模型组相比较有显著性差异(P<0.01)，等同于阳性药多粘菌素的杀菌效果，说明多肽HF-18能显著性地清除感染小鼠血液中的细菌。
附图12-15分别表示感染小鼠肝、脾、肺、肾组织中的细菌数，从图中可得出，虽然HF-18低剂量(2.5mg/kg)对细菌的清除效果并不是很显著，但高剂量(10mg/kg)可以明显的降低感染小鼠组织脏器中的活细菌数目，下降了约2～3个log值，且与模型组相比较有显著性的差异(P<0.001)，而多粘菌素组对各器官的杀菌效率均不如多肽高剂量组，说明抗菌多肽HF-18能显著性地清除感染小鼠各脏器中的细菌。
所以从附图9-15可以看出，抗菌多肽HF-18表现出强烈的细菌清除能力，与提高感染小鼠的生存率有一定的关系。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种抗菌多肽HF-18及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Phe Lys Lys Ala Trp Arg Lys Val Lys Lys Ala Phe Arg Arg
1 5 10 15
Val Leu
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> HFIAP-1(HFIAP-1)
<400> 2
Gly Phe Phe Lys Lys Ala Trp Arg Lys Val Lys His Ala Gly Arg Arg
1 5 10 15
Val Leu Asp Thr Ala Lys Gly Val Gly Arg His Tyr Val Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Arg Tyr Arg
35

Claims (6)

1.一种抗菌多肽HF-18，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
Gly-Phe-Phe-Lys-Lys-Ala-Trp-Arg-Lys-Val-Lys-Lys-Ala-Phe-Arg-Arg-Val-Leu。
2.一种权利要求1所述的抗菌多肽HF-18的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)以多肽HFIAP-1为模板，对其序列保守且α螺旋高度集中的区域进行截取，从N端第1位开始截取将多肽氨基酸个数由37个减少为18个；
(2)再以截取的18个氨基酸为模板，将其第12位的组氨酸替换为正电荷的赖氨酸及第14位甘氨酸替换成疏水性的苯丙氨酸；再合成多肽HF-18。
3.一种权利要求1所述的抗菌多肽HF-18在制备抗病原菌感染药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的多肽HF-18在制备抗病原菌感染药物中的应用，其特征在于，所述抗病原菌感染药物优选包括抗细菌和真菌感染药物。
5.根据权利要求4所述的抗菌多肽HF-18在制备抗病原菌感染药物中的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和幽门螺旋杆菌；真菌为新生隐球菌。
6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗菌多肽HF-18及其药学上所接受的载体。
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