CN102382186B - 衍生自线性鸡β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制备方法 - Google Patents

衍生自线性鸡β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是一种衍生自线性鸡β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制备方法。本发明采用定点氨基酸片段截取和氨基酸替代的方法，简化线性鸡β-防御素4得到两条多肽。对其抗菌和溶血活性进行测定，计算其治疗指数，评价两条肽对细胞的选择性。研究发现，截取肽GL23和氨基酸替换后的肽GLI23都具有明显的杀菌活性。并且与鸡β-防御素4相比，二者的溶血活性显著降低。尤其是GLI23，其治疗指数高达76.1。通过该方法在不降低抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。

Description

衍生自线性鸡β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制备方法
技术领域
本项发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种衍生自线性鸡β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制备方法。
背景技术
抗菌肽是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，具有广谱抗菌和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性。抗菌肽由于其主要通过物理渗透作用于细菌胞膜而产生抑菌或者杀菌作用，而细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构，因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。
目前，上千种抗菌肽已经从各种动植物体中提取出来，但作为抗生素替代品用于医疗领域的天然抗菌肽却很少。限制天然抗菌肽成为抗生素替代物的一个重要原因是：天然抗菌肽对于正常细胞，比如红细胞等也造成溶血作用，那么，寻找一种提高抗菌肽细胞选择性的方法势在必行。细胞选择性是抗菌肽对不同细胞的不同选择性作用而言的。对有害微生物有抑制或杀伤作用，而对正常细胞没有毒性的抗菌肽具有较高的细胞选择性。抗菌肽的细胞选择性越高，说明成为抗生素替代品的可行性越大。细胞选择性可以用抗菌肽的治疗指数来评价。
防御素是参与机体最初防御活动的小分子多肽，是一类极为重要的内源性抗菌肽，具有广谱的抗菌活性，能有效地杀灭细菌、真菌、螺旋体和囊膜病毒，在机体的先天性免疫及获得性免疫中均发挥着重要的作用。鸡抗菌肽属β-防御素，为防御素的一个亚类。与其它动物抗菌肽类似，鸡β-防御素在禽类的先天性免疫及获得性免疫中也发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的在于公开一种衍生自线性鸡β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
线性鸡β-防御素4(RL38)的氨基酸序列为：
Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro
1               5                   10                  15
Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro；
                20                  25                  30
Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu-NH2
                35          38
通过截取线性鸡β-防御素4(RL38)的羧基末端的23个氨基酸，得到含有4个正电荷，疏水值为-0.3的两条多肽。
获得的一条肽GL23，其氨基酸序列为：
Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro
1               6                   10                15；
Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu--NH2
             20          23
GL23的第一个氨基酸是甘氨酸以提高其稳定性。
再将GL23肽链中的四个半胱氨酸替换成异亮氨酸，
得到GLI23，其氨基酸序列为：
Gly Lys Ile Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Arg Pro
1                6                   10                  15；
Lys Tyr Ser Ile Ile Arg Trp Leu--NH2
                20          23
其正电荷含量为4个，疏水值提高到0.03。
三条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。通过截取或替代的方法简化鸡β-防御素4并提高其细胞选择性，使其具有成为抗生素替代物的发展潜力。
通过该方法在不降低抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。
具体实施方式
实施例1：抗菌肽的设计
线性鸡β-防御素4的氨基酸序列为：
Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro
1               5                   10                  15
Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro；
                20                  25                  30
Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu-NH2
                35          38
通过截取线性鸡β-防御素4(RL38)的羧基末端的23个氨基酸，得到含有4个正电荷，疏水值为-0.3，的两条多肽。
获得的一条肽GL23，其氨基酸序列为：
Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro
1               6               10                    15；
Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu--NH2
            20            23
GL23的第一个氨基酸是甘氨酸以提高其稳定性。
再将GL23肽链中的四个半胱氨酸替换成异亮氨酸，
得到GLI23，其氨基酸序列为：
Gly Lys Ile Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Arg Pro
1                6                   10                 15；
Lys Tyr Ser Ile Ile Arg Trp Leu--NH2
                20          23
其正电荷含量为4个，疏水值提高到0.03。
通过改造获得的GL23和GLI23均具有较高的细胞选择性。三条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。
实施例2：
抗菌肽的合成和生物活性测定
使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽，并对抗菌肽的生物学活性进行鉴定分析。
2.1抗菌活性
将肽配置成为一定储存液以备使用。利用平板计数法测定几种抗菌肽的最小杀菌浓度。以10mM磷酸钠溶液(pH 7.4)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(106个/ml)于各孔中。37℃恒温培养2h。然后取适量上述液体稀释涂于琼脂板上，37℃恒温培养18h后计数。以肽杀菌的最小肽的浓度作为最小杀菌浓度(LC)。
2.2溶血活性
采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μl PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μl 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度。
2.3治疗指数
细胞选择性可以用抗菌肽的治疗指数来评价。治疗指数定义为抗菌肽的最小溶血浓度与最小杀菌浓度的几何平均数的比值。例如：当肽的浓度在128μM仍然没有溶血，那么通常用256μM(128μM×2)作为其最小溶血浓度用于计算。治疗指数值越大，该抗菌肽对细菌微生物具有更高的抑菌活性而同时又保持较低的细胞毒性，说明抗菌肽具有更高的细胞选择性。
表1为RL38及GL23和GLI23的氨基酸组成及物理特征。经过质谱法对分子量进行分析，理论分子量和实际分子量吻合。
表2为抗菌肽的细胞选择性。通过表2可以看出3条抗菌肽对革兰氏阴性和阳性菌都表现出了较高的抑菌活性，其中总体上抑菌活性的高低顺序是：RL38＝GLI23＞GL23。RL38最小溶血浓度为16uM，说明其具有较高的溶血活性，而GL23和GLI23在128μM时仍没有表现出溶血活性，说明二者在细菌细胞和哺乳动物细胞之间具有一定选择性。
表1抗菌肽的氨基酸片段、分子量、电荷和疏水值
Figure BSA00000591280400041
表2抗菌肽的最小杀菌浓度、最小溶血浓度和治疗指数
Figure BSA00000591280400042
Figure ISA00000591280500021

Claims (2)

1.一种衍生自线性鸡β-防御素4的抗菌肽GLI23的制备方法，其特征在于，方法如下：线性鸡β-防御素4的氨基酸序列为：
Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro
1              5                10              15
Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro           ；
              20                25              30
Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu-NH2
              35        38
通过截取线性鸡β-防御素4的羧基末端的23个氨基酸，得到含有4个正电荷，疏水值为-0.3的两条多肽；
其中获得的一条肽GL23，其氨基酸序列为：
Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro
1             6               10               15             ；
Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu--NH2
            20        23
再将GL23肽链中的四个半胱氨酸替换成异亮氨酸，
得到GLI23，其氨基酸序列为：
Gly Lys Ile Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Arg Pro
1             6               10                15             。
Lys Tyr Ser Ile Ile Arg Trp Leu--NH2
            20        23
2.根据权利要求1所述的一种衍生自线性鸡β-防御素4的抗菌肽GLI23的制备方法制得的一种抗菌肽GLI23，其特征在于，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所示。 
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