CN101851276A - 一种抗菌肽的制备方法及活性检测 - Google Patents

一种抗菌肽的制备方法及活性检测 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗菌肽的制备方法及活性检测。本发明利用蛋白质的螺旋轮模型，制备出了只含有少数几个氨基酸残基的系列抗菌肽，并在对其抗菌、溶血、细胞毒性等活性进行了检测。得到的4条抗菌肽都具有明显的抑菌活性，并且含有多个缬氨酸的2个抗菌肽没有溶血活性和较小的细胞毒性，其中尤其以含有3个甘氨酸、5个精氨酸和8个缬氨酸的抗菌肽具有最大的潜力。本发明为进一步解释抗菌肽作用机制，合理设计抗菌肽等具有重要的理论与实践意义。

Description

一种抗菌肽的制备方法及活性检测
(一)技术领域
本发明涉及分子生物学，具体说就是一种抗菌肽的制备方法及活性检测。
(二)背景技术
抗生素由于具有药物残留及细菌耐药性问题，因此迫切需要发现一种绿色、无污染和无细菌耐药性的抗生素替代物。抗菌肽是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，具有广谱抗菌活性，不仅可以抑制多种细菌或真菌，甚至可以抑制肿瘤细胞的生长。抗菌肽由于其主要通过物理渗透作用于细菌胞膜而产生抑菌或者杀菌作用，而细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构，因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。然而抗微生物肽的研究中也存在着一些问题和瓶颈，主要表现为：第一，虽然许多抗菌肽具有光谱抗菌性，但是对于正常细胞，比如红细胞等也造成溶血作用；第二，许多抗菌肽由20个以上氨基酸组成，使用固相合成法生产成本太高；第三，盲目使用基因工程的方法表达抗菌肽，而没有对抗菌肽的结构和功能以及体外试验进行全面的摸索，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性和细胞毒性。为了避免这些问题的产生，采用α-螺旋抗菌肽设计得到溶血活性低的抗菌肽。α-螺旋抗菌肽在研究抗菌肽作用机理、抗菌肽结构和功能方面发挥着巨大的作用。其中螺旋论模型是根据已知的蛋白质二级结构--α-螺旋的结构特征发展而来的。国内外也有很多关于α-螺旋结构和特征方面的报道和研究。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌肽的制备方法及活性检测。
本发明的目的是这样实现的：所述的抗菌肽的制备方法如下：采用蛋白质的螺旋轮模型设计4种具有抗菌活性的抗菌肽，其中在极性面，使用了5个精氨酸或者赖氨酸为抗菌肽提供正电荷，使得抗菌肽能与细菌细胞膜表面的负电荷相吸引，而在非极性面，使用了8个亮氨酸或者缬氨酸为抗菌肽提供疏水基团，使得抗菌肽能够与细菌细胞膜的脂质双分子层相互作用，进而在细菌细胞膜上形成孔洞，最终使得菌体受到抑制或者死亡，为了降低抗菌肽的溶血活性，还通过引入3个甘氨酸来增加抗菌肽结构的柔韧性；使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽，对抗菌肽的生物学活性进行鉴定分析。
本发明利用螺旋论设计得到的4条α-螺旋抗菌肽均展示出较高的抗革兰氏阴性和阳性菌活性，其中含有亮氨酸的抗菌肽要优于含有缬氨酸的抗菌肽；试验结果还惊奇的发现，含有缬氨酸的两条抗菌肽即AMP3和AMP4，在1024μg/ml的时候都未检测到溶血活性，这使得设计得到的含有多个缬氨酸的抗菌肽具有了应用的巨大潜力，为将来更多衍生物的设计提供了模板；另外，含有8个缬氨酸的抗菌肽还具有非常低的细胞毒性，综上可以看出，利用螺旋论设计α-螺旋抗菌肽是可行和合理的，并且发现由缬氨酸提供主要疏水性的抗菌肽具有较高的抗菌活性，较低的溶血和细胞毒性，显示出了应用的巨大空间。
(四)附图说明
图1为本发明的抗菌肽的细胞毒性曲线图。
(五)具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
实施例1：本发明一种抗菌肽的制备方法及活性检测，制备方法如下：采用蛋白质的螺旋轮模型设计4种具有抗菌活性的抗菌肽，其中在极性面，使用了5个精氨酸或者赖氨酸为抗菌肽提供正电荷，使得抗菌肽能与细菌细胞膜表面的负电荷相吸引，而在非极性面，使用了8个亮氨酸或者缬氨酸为抗菌肽提供疏水基团，使得抗菌肽能够与细菌细胞膜的脂质双分子层相互作用，进而在细菌细胞膜上形成孔洞，最终使得菌体受到抑制或者死亡，为了降低抗菌肽的溶血活性，还通过引入3个甘氨酸来增加抗菌肽结构的柔韧性；使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽，对抗菌肽的生物学活性进行鉴定分析。
实施例2：抗菌肽的制备
根据螺旋轮模型，采用5个精氨酸或者赖氨酸作为极性端来提供正电荷，使之与细菌膜表面的负电荷通过物理吸引发生作用；采用8个亮氨酸或者缬氨酸作为非极性端的残基，使之与细菌细胞膜脂质双分子层的非极性基团相互作用，从而破坏细菌的细胞膜，使之瓦解而死亡。同时为了降低抗菌肽对正常细胞(如血红细胞或者哺乳动物细胞)的毒性，增加此模型的柔韧性，还另外在结构中添加了3个甘氨酸。
抗菌肽的合成和生物活性测定
使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽，并对抗菌肽的生物学活性进行鉴定分析。
抗菌活性
将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(106个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。
溶血活性
采集人或者兔的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取100μL红细胞悬液与100μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在540nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中100μl PBS作为阴性对照；100μl0.2％Tritonx-100作为阳性对照。
细胞毒性
取传代的非洲猴肾细胞进行培养，直至覆盖96孔底部80％以上。然后将肽用DMEM培养基中进行溶解，并稀释成为不同的梯度放到生长有肾细胞的96孔板中，37℃5％CO2的条件下培养24h，然后用CCK-8试剂盒对细胞活性进行测定。取出上清液用酶标仪在450nm处测光吸收值。
表1抗菌肽的制备
Figure GSA00000103431200041
表2抗菌肽的抑菌活性
Figure GSA00000103431200042

Claims (1)

1.一种抗菌肽的制备方法及活性检测，其特征在于：所述的抗菌肽的制备方法如下：采用蛋白质的螺旋轮模型设计4种具有抗菌活性的抗菌肽，其中在极性面，使用了5个精氨酸或者赖氨酸为抗菌肽提供正电荷，使得抗菌肽能与细菌细胞膜表面的负电荷相吸引，而在非极性面，使用了8个亮氨酸或者缬氨酸为抗菌肽提供疏水基团，使得抗菌肽能够与细菌细胞膜的脂质双分子层相互作用，进而在细菌细胞膜上形成孔洞，最终使得菌体受到抑制或者死亡，为了降低抗菌肽的溶血活性，还通过引入3个甘氨酸来增加抗菌肽结构的柔韧性；使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽，对抗菌肽的生物学活性进行鉴定分析。
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