CN103288924B - 鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法 - Google Patents
鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103288924B CN103288924B CN201210406610.2A CN201210406610A CN103288924B CN 103288924 B CN103288924 B CN 103288924B CN 201210406610 A CN201210406610 A CN 201210406610A CN 103288924 B CN103288924 B CN 103288924B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fmoc
- resin
- peptide
- mutant
- antimicrobial peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/141—Feedstock
Abstract
本发明公开了一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS，鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法包括取料、反应、纯化、质谱分析鉴定等步骤。本发明鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法具有较高抗菌活性且安全无毒。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别是涉及一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法。
背景技术
自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染疾病的有力武器，但是随着“传统抗生素”的大量使用，致病菌的耐药性逐渐增强，“抗生素时代”正逐渐走到尽头，目前最好的抗生素也逐渐失去效果，所以寻找新的抗菌资源已成为备受关注的焦点。
阳离子抗菌肽(cationic antibacterial peptides)一般由12～50个氨基酸残基组成的阳离子型(含过多的赖氨酸和精氨酸)的两亲性分子，其在广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子阳离子多肽。阳离子抗菌肽是由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类多肽。目前为止，世界上已知的抗菌肽共有1200多种，而以天然阳离子抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽有数千种。
多数阳离子抗菌肽由12～50个氨基酸残基组成，相对分子质量小(4kDa左右)，水溶性好，且等电点在8.9～10.7之间，具有较强的阳离子特征，具有两亲α螺旋和(或)两亲β-折叠结构。这些阳离子抗菌肽N端多富含碱性氨基酸，呈强碱性，C端均酰胺化且C端中性疏水性，它对杀菌活性至关重要。有些阳离子抗菌肽在121℃、1.5×105Pa的高温高压下处理30min仍能保持原有活性，说明抗菌肽具有热稳定性。阳离子抗菌肽在较大的离子强度和较低或较高的pH值下仍可保持较强的活性。此外，部分阳离子抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。
鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)是鲶鱼受伤的上皮黏膜细胞分泌的一种抗菌肽，含有19个氨基酸残基，它是鲶鱼非特异性免疫系统的重要组成部分，分子量为2004Da，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的最小抑制浓度(MIC)都在0.5～2mmol/L之间，且没有溶血现象。其抗菌活性是蛙皮素(magainin)的12～100倍。研究发现，鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)是鱼体受到损伤时，金属蛋白酶水解鲶鱼皮肤黏液中的前体蛋白Procathepin D产生Cathepin D(组织蛋白酶D)，通过它可切断未酰化的组蛋白H2A中Ser19-Arg20间的肽键，产生的19个氨基酸残基，其序列为：Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Gln-Gly-Gly-Lys-Val-Arg-Ala-Lys-Ala-Lys-Thr-Arg-Ser-Ser。
天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，部分对真核生物有一定的毒性，对病原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性和最大程度降低其毒性成为其分子改造的目的，也是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法，其具有较高抗菌活性且安全无毒。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种鲶鱼抗菌肽突变体，其特征在于，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS。
优选地，所述鲶鱼抗菌肽突变体的N端形成阳离子的双亲性的α螺旋结构，C端为中性疏水性氨基酸。
本发明还提供一种鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；
S2、精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入2～3倍Fmoc-AA-Resin体积的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
S3、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
S4、再次加入2倍Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
S5、称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
S6、将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
S7、调节氮气的流量，使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
S8、反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin两次；
S9、重复步骤S3至步骤S8，直到多肽序列偶联完为止；
S10、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20％哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin两次，最后一次洗完后，将Fmoc-AA-Resin尽量抽干，得肽树脂；
S11、配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
S12、将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
S13、反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
S14、将冰箱中的无水乙醚取出，选择容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚：裂解液＝10：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
S15、将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
S16、将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重，得到粗肽；
S17、NH4HCO3自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3(pH8.2)溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥，称重备用；
S18、将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，得到鲶鱼抗菌肽ParasinI突变体；
S19、将纯化并经质谱分析鉴定合格的鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
优选地，所述步骤S18中的纯化使用Hypersil BDS C18型反相柱进行纯化的。
本发明的积极进步效果在于：本发明鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)突变体经过抗菌活性检测，对Gram+菌、Gram—菌及真菌等均有明显的抑制作用，比抗菌肽Parasin I减少了5个氨基酸残基并且获得更优的抗菌活性，为大规模合成该突变体并且应用于抗感染药物、化妆品和抗病毒药物等领域奠定了基础，显示出良好的应用前景。
附图说明
图1是固相化学合成的鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体的质谱分析图，经分析测得鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体的分子量与理论值相符合；
图2是鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体对金黄色葡萄球菌的抗菌实验结果，图中：Ck为为阴性对照；1为溶解突变体肽100ug/ml；2为溶解突变体肽200ug/ml；3为溶解突变体肽500ug/ml。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
抗菌肽由于自身的优良特性显示出在食品储存、饲料安全和医药产业中广泛的应用前景。抗菌肽是一种健康安全产品，在动物消化道中具有良好稳定性，同时具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌甚至能够杀真菌、原虫且不产生耐药性菌株等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ具有其他许多抗菌肽所共有的两亲性结构，鲶鱼抗菌肽(ParasinⅠ很强的抗菌活性可能和其两性a螺旋以及很强的正电性有很大的关系。
根据鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)的核心功能序列，将鲶鱼抗菌肽(ParasinⅠ)的氨基酸数目减少为14个，第12位的丙氨酸改为碱性的赖氨酸，第13位和14位改为疏水性的丝氨酸，成为本发明鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)突变体，该抗菌肽突变体分子N端形成阳离子的双亲性的α螺旋结构，能够与带负电荷的细胞膜结合，C端为中性疏水性氨基酸，能够插入细胞膜内部，它对保持杀菌活性至关重要。本发明鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)突变体的氨基酸序列为：KGRGKQGGKVRKSS。
经酶标仪梯度稀释法检测，鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)突变体对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌四种细菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration,MIC)分别为0.5、1、2和2μg·mL-1，在抑菌浓度范围内未表现出溶血活性。获得了一种具有较高抗菌活性且安全无毒的新型抗菌肽，为研究开发理想的新型抗菌肽分子提供了新思路。本发明鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)突变体经过抗菌活性检测，对Gram+菌、Gram—菌及真菌等均有明显的抑制作用，比抗菌肽Parasin I减少了5个氨基酸残基并且获得更优的抗菌活性，为大规模合成该突变体并且应用于抗感染药物、化妆品和抗病毒药物等领域奠定了基础，显示出良好的应用前景。
本发明鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)突变体是采用固相化学合成技术合成的多肽产品。采用Fmoc保护的氨基酸固相合成法，以Rink Amide MBH树脂作载体，HBTU/HOBt作缩合剂，肽从树脂上的切割试剂为三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1,2-二巯基乙醇(体积比8∶0.5∶0.5∶0.5∶0.25)，于室温反应4～6h，旋转蒸发除去大部分三氟乙酸后，在0℃滴加乙醚得絮状沉淀，离心后得粗肽，用Sephadex G-15柱初步分离，柱用5％醋酸平衡，上样后在流速为1mL/min下用5％醋酸洗脱，280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥。用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰。粗肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)和氨基酸分析确定，最后用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法的具体操作步骤如下：
(1)取料，将存放于冰箱中的原料试剂(如：氨基酸、乙醚、苯酚等试剂)取出，置于干燥器中复温待用；
(2)精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF(Dimethyl Fumarate，富马酸二甲酯)冲洗六次，然后加入2～3倍Fmoc-AA-Resin体积的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
(3)加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
(4)再次加入2倍Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
(5)称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT(NHydroxybenzotrizole，1-羟基苯并三唑)及HBTU(O(7Azabenzotriazol1yl)NNN'N'tetramethyluronium hexafluophosphate，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯)，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
(6)将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
(7)调节氮气的流量，使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
(8)反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin两次；
(9)重复步骤(3)至(8)，直到多肽序列偶联完为止；
(10)加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20％哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin两次，最后一次洗完后，将Fmoc-AA-Resin尽量抽干，得Peptide-Resin(肽树脂)，即采用固相化学合成法从C-端到N-端逐个氨基酸偶联合成至反应完全为止；
(11)配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
(12)将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
(13)反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
(14)将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚：裂解液＝10：1(体积比)的比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
(15)将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
(16)将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重，得到粗肽。
(17)NH4HCO3自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3(pH8.2)溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜。之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
(18)将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，并得到鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体；使用Hypersil BDS C18型反相柱(5μm,4.6mm×300mm)进行纯化。将氧化后的粗肽样品溶于2mL超纯水中，10000g离心5min，加载到已用Buffer A(0.1％TFA)平衡好的反相柱上。用Buffer B(含0.1％TFA的乙腈)梯度洗脱(见表1)。流速为1ml/min，215nm及254nm双通道检测，收集洗脱峰，用MOLDI-TOF质谱分析，鉴定结果见图1所示，质谱分析的突变体的分子量与理论值相符合，即鉴定合格。粗肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)和氨基酸分析确定。
表1反相高效液相色谱洗脱梯度
A:0.1％TFA，B:乙腈(含0.1％TFA)
(19)将纯化并经质谱分析鉴定合格的鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
二、鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体的抗菌活性检测
2.1鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体的抗菌活性测定
琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸取60μL的生测菌(OD600＝0.3)，加入20mL琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9cm的无菌平面皿内，厚度约为1.5mm，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2.7mm的圆孔，分别在孔中加入已纯化的鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体样品各10μL，用无菌水做阴性对照，用Amp做阳性对照。加样后将平皿放入4℃冰箱中，待样品充分扩散到琼脂后，将平皿倒置于37℃培养过夜，次日观察结果如图2所示。本试验中供试细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌K12D31，可以看出本发明具有较高抗菌活性。
2.2鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体最小抑菌浓度(MIC)的测定
MIC：将测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为约5×106CFU/mL，加入96孔培养板中，测试孔每孔加入菌液90uL，然后加入倍比稀释的不同浓度的杂合抗菌肽溶液，10uL/孔。阳性对照为100uL/孔的菌液，阴性对照为相应的100uL培养基。然后于37℃慢摇培养约16h，用酶标仪测OD630。抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果见表2。
表2鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体的MIC
| 菌株 | MIC(ug/mL) |
| 金黄色葡萄球菌 | 0.5 |
| 大肠杆菌K12D31 | 1 |
| 葡萄球菌 | 2 |
| 沙门氏菌 | 2 |
| 溶血葡萄球菌 | 2 |
| 大肠埃希菌 | 4 |
| 腐生葡萄球菌 | 4 |
| 沃氏葡萄球菌 | 5 |
| 尿肠球菌(耐药) | 5 |
| 摩根氏菌 | 10 |
| 创伤弧菌 | 100 |
2.3溶血活性实验
将人血红细胞用PBS缓冲液(35mmol/L磷酸盐缓冲液，含150mmol/LNaCl，pH＝7.4)洗4次后悬浮在PBS缓冲液中，得血红细胞悬浮液(体积分数2.5％)。将杂合抗菌肽溶解在PBS缓冲液中，配成储备液，取不同体积的多肽储备液于0.5mL 2.5％血红细胞悬浮液中，补加PBS缓冲液至终体积1mL，摇匀，于37℃保温60min后，以4000r/min离心10min，取上清夜在414nm下比色，以血红细胞悬浮在PBS缓冲液中为空白，以血红细胞悬浮在TritonX 100中为100％溶血。经试验检测，制备的杂合抗菌肽无明显溶血活性。
三、鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体的小鼠急性毒性试验
选取健康NIH小鼠40只，雌雄不拘，体重30g左右，随机分成2组，分别为空白对照组和鲶鱼抗菌肽(Parasin I)突变体干粉组，每组20只小鼠。实验前先记录一次小鼠的体重，实验开始时，各组小鼠按0.8ml的最大给药体积一次性给予受试样品，给药后连续观察7天，观察7天内小鼠是否出现精神，活动，饮食异常情况及死亡情况。对于死亡的小鼠应立即解剖观察心，肝，脾，肺，肾等，记录病变情况。于第8d将各组小鼠记录体重，比较组间差异；然后处死全部小鼠，对重要器官进行观察，记录病变情况。
试验结果：小鼠单次给药最大浓度和最大体积的当天，未见小鼠出现死亡，且小鼠毛色光洁、活动正常、饮食正常；给药后连续观察7天，各组小鼠精神活跃，活动正常，摄食及饮水正常，且未见死亡情况发生。各组小鼠给药前后的体重和观察结果分别见表3、表4所示，受试样品对小鼠的体重无明显的影响，实验结束后，处死所有的小鼠，肉眼对重要脏器包括心、肝、脾、肺、肾、脑等进行检查，未发现明显的器质性病变；由此提示在当前剂量下，受试样品未见明显毒性反应。
表3小鼠给药前后体重变化表
表4给药后连续观察7d实验记录
实验结论：由小鼠单次给药最大耐受量实验结果可得，小鼠一次给予样品的最大浓度和最大体积19.2g/kg时，未见明显毒性反应，按体重换算相当于70kg成人服用剂量为1344g，受试样品为低毒且安全的样品。
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改型和改变。因此，本发明覆盖了落入所附的权利要求书及其等同物的范围内的各种改型和改变。
< 110> 广州格拉姆生物科技有限公司
< 120> 鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法
< 160> 1
< 210> １
< 211> 14
< 212> PRT
< 213> 人工序列
< 220>
< 222>（1）…（14）
< 400> 1
Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Lys Ser Ser
1 5 10 14
Claims (3)
1.一种鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS，所述鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法包括以下步骤：
S1、将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；
S2、精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入2～3倍Fmoc-AA-Resin体积的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
S3、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
S4、再次加入2倍Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
S5、称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
S6、将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
S7、调节氮气的流量，使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
S8、反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin两次；
S9、重复步骤S3至步骤S8，直到多肽序列偶联完为止；
S10、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20％哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin两次，最后一次洗完后，将Fmoc-AA-Resin尽量抽干，得肽树脂；
S11、配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
S12、将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
S13、反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
S14、将冰箱中的无水乙醚取出，选择容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚：裂解液＝10：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
S15、将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
S16、将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重，得到粗肽；
S17、NH4HCO3自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3(pH8.2)溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥，称重备用；
S18、将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，得到鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体；
S19、将纯化并经质谱分析鉴定合格的鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
2.如权利要求1所述的鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，所述鲶鱼抗菌肽突变体的N端形成阳离子的双亲性的α螺旋结构，C端为中性疏水性氨基酸。
3.根据权利要求3所述的鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤S18中的纯化使用Hypersil BDS C18型反相柱进行纯化的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210406610.2A CN103288924B (zh) | 2012-10-23 | 2012-10-23 | 鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210406610.2A CN103288924B (zh) | 2012-10-23 | 2012-10-23 | 鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103288924A CN103288924A (zh) | 2013-09-11 |
| CN103288924B true CN103288924B (zh) | 2014-12-31 |
Family
ID=49090499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210406610.2A Expired - Fee Related CN103288924B (zh) | 2012-10-23 | 2012-10-23 | 鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103288924B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103408668A (zh) * | 2012-10-25 | 2013-11-27 | 广州格拉姆生物科技有限公司 | 一种杂合抗菌肽及其制备方法 |
| CN105753958B (zh) * | 2016-05-11 | 2017-07-11 | 青岛农业大学 | 一种新型鱼源抗菌肽突变体及其制备方法和应用 |
| CN106260594B (zh) * | 2016-08-12 | 2018-06-05 | 江苏尚宝牧业有限公司 | 一种提高母猪繁殖性能的预混合饲料添加剂 |
| CN106636176B (zh) * | 2016-12-20 | 2018-05-04 | 广州格拉姆生物科技有限公司 | 一种生产低聚木糖和抗菌肽的益生饲用酿酒酵母 |
-
2012
- 2012-10-23 CN CN201210406610.2A patent/CN103288924B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 仿生鲶鱼抗菌肽编码序列的设计及克隆;谢慧 等;《食品与生物技术学报》;20050630;全文 * |
| 王庆丰 韩跃武.鲶鱼抗菌肽Parasin Ⅰ原核表达载体的构建与鉴定.《国外医药(抗生素分册)》.2011, * |
| 鲶鱼抗菌肽ParasinⅠ及突变体在大肠杆菌中融合表达;王庆丰;《兰州大学 硕士学位论文》;20071231;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103288924A (zh) | 2013-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4037525B2 (ja) | 新規抗菌性ペプチド | |
| CN103288924B (zh) | 鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法 | |
| WO2015161820A1 (zh) | 两亲性合成抗菌肽、其药物组合物及其用途 | |
| CN109810178B (zh) | 一种抗酶解抗菌肽i9h12及其制备方法和应用 | |
| CN109553657B (zh) | 一种非完美两亲性肽w4及其制备方法和应用 | |
| CN105566452A (zh) | 一种具有环状结构的抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| KR20170007312A (ko) | 미생물 성장 매체 및 이를 이용하는 방법 | |
| CN112778401B (zh) | 一种辛酸酰化修饰抗菌肽及其应用 | |
| CN103288925A (zh) | 一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法 | |
| CN102391362B (zh) | 一组动物源性阳离子抗菌肽及其应用 | |
| CN113214355B (zh) | 一种专杀真菌的抗菌肽gl4w及其制备方法和应用 | |
| CN111423493B (zh) | 一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN107235894B (zh) | 具有抗耐药菌活性的季铵查尔酮衍生物、其制备方法及应用 | |
| CN113880933B (zh) | 一种抗菌肽SsNKL27及其应用 | |
| CN114805495B (zh) | 一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP及其制备方法和应用 | |
| CN112625092B (zh) | 一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物及其合成与应用 | |
| CN110437305B (zh) | 一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用 | |
| WO2022104863A1 (zh) | 太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用 | |
| CN114940701A (zh) | 一种靶向抗真菌肽li及其制备方法和应用 | |
| CN101775067B (zh) | 一种人工合成的新抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN112724198A (zh) | 一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN105837674A (zh) | 一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用 | |
| CN103408668A (zh) | 一种杂合抗菌肽及其制备方法 | |
| CN113024634B (zh) | 类肽化合物及其在制备抗生素中的应用 | |
| CN110627891B (zh) | 一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Li Inventor before: He Hongxuan Inventor before: Li Bentao Inventor before: Yin Yulong Inventor before: Xia Xinjie Inventor before: Wang Congfeng Inventor before: Li Aike Inventor before: She Ruiping Inventor before: Li Gang Inventor before: Li Shuaiwei |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141231 Termination date: 20211023 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |