CN113880933B - 一种抗菌肽SsNKL27及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗菌肽SsNKL27及其应用，具体涉及一种抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示。该抗菌肽可有效杀伤副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌这几种鱼类致病菌。

Description

一种抗菌肽SsNKL27及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及微生物学领域，具体的说是一种许氏平鮋NK-lysin衍生抗菌肽SsNKL27及其应用。
背景技术
随着水产养殖业高密度和集约化养殖模式的迅速发展，水产动物的患病率随之上升，对疾病防治要求也随之升高。抗生素是目前防治水产疾病的有效手段之一，抗生素的滥用引发养殖环境的污染，使病害细菌产生耐药性。寻找绿色、高效的新型药物以减小对抗生素的依赖迫在眉急。抗菌肽是一种天然广谱抗菌剂，具有独特的抗菌机制，具有无毒副作用、不易产生耐药性、无残留和无污染等优点。已成为国内外研究和开发的热点
NK-lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-likeprotein,SAPLIP)家族的成员，与人类颗粒溶素是同源多肽，具有鞘脂激活蛋白B(saposin B)结构域和6个保守的半胱氨酸，且富含带正电荷的氨基酸。具有与膜结合的能力，并能够改变细胞膜的完整性，能够杀灭细菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞等。
发明内容
本发明首先涉及一种抗菌肽SsNKL27，所述抗菌肽SsNKL27的序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：KLKSKLMSICDQIGLLKSLCRKFVKVH；
本发明还涉及所述的抗菌肽SsNKL27在制备抑制药物中的应用。
优选的，所述的药物为防治鱼类感染致病细菌的药物；
更优选的，所述鱼类致病菌为：副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌或金黄色葡萄球菌。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的抗菌肽具有高效抑菌作用，可以有效抑制多种鱼类致病菌，因此可以应用于鱼类病害防治；
(2)相比与其他的同源短肽而言，本发明涉及的抗菌肽抑菌效果更好，抑菌谱更宽。
附图说明
图1、抗菌肽SsNKL27的纯度检测结果；1A、MS质谱分析结果；1B、HPLC纯度分析结果。
图2、抗菌肽SsNKL27对不同种类的细菌的作用曲线；2A、SsNKL27对鳗弧菌的作用曲线，2B、SsNKL27对金黄色葡萄球菌的作用曲线。
图3、SsNKL27与红霉素、利福平的协同作用曲线。
图4、SsNKL27在大菱鲆体内的抗感染作用。
具体实施方式
实施例1、抗菌肽SsNKL27的人工合成
抗菌肽SsNKL27的序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：KLKSKLMSICDQIGLLKSLCRKFVKVH；
序列特征：
(1)长度：27AA
(2)链型：单链
(3)拓扑结构：线性
本实施例合成的抗菌肽SsNKL27按照Fmoc固相多肽合成法，最终得到纯度大于98％的抗菌肽SsNKL27。合成时将一个Fmoc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，经过树脂溶胀，脱保护，称料，投料，反应后洗涤，检测，合成完毕后的洗涤和干燥后再连接下一个氨基酸，直至连完最后一个氨基酸，即得到抗菌肽SsNKL27的序列，最后脱除N端Fmoc保护的氨基酸上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来，并切除树脂，即得到纯化的抗菌肽SsNKL27。经验证为如SEQ ID NO.1所示的序列，具体的质谱检测结果见图1A，HPLC分析结果见图1B。
实施例2、抗菌肽SsNKL27的抗菌谱
在LB培养基中培养副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌分别至OD600为0.6,然后室温离心(5000g)2min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5x106CFU/ml。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na2HPO4.12H2O，0.024％NaH2PO4。
抗菌肽SsNKL27的杀菌效应检测过程如下：
(1)将50μl上述终浓度为5x106CFU/ml的菌液加入96孔细胞培养板中；
(2)与用PBS按比例稀释的SsNKL27终浓度(256μM、128μM、64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM)或纯PBS混合(阴性对照)；
(3)对于副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌样本，28℃下孵育，对于金黄色葡萄球菌样本，37℃下孵育。
杀菌/抑菌分析结果显示：
(1)SsNKL27对副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的最小抑菌浓度分别为：64μM、16μM、16μM和128μM；
(2)SsNKL27对副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的最小杀菌浓度为：64μM、32μM、16μM和128μM；
(3)SsNKL27对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为：16μM；
(4)SsNKL27对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度为：64μM；而PBS组则完全不能抑制细菌生长。
部分结果如图2所示。
实施例3、抗菌肽SsNKL27对鳗弧菌外膜通透性的影响
(1)按照实例2中MIC测定方法侧出利福平和红霉素的MIC值。将鳗弧菌培养至对数生长中期，用无菌PBS清洗至5x106CFU/ml；
(2)在96孔板中依次加入180μl鳗弧菌溶液，10μl终浓度为8μM，梯度稀释利福平和好红霉素溶液，将三者混合均匀；
(3)以无菌PBS溶液为空白对照，将96孔板放置在28℃培养12h后，用酶标仪在630nm处测定OD值。
结果表明，当红霉素浓度为1.25～40μg/ml时，利福平浓度的为0.625～20μg/ml时，抗生素与SsNKL27之间存在协同增效作用(图3)。
实施例4、抗菌肽SsNKL27在大菱鲆体内的抗感染作用
(1)将鳗弧菌培育到对数生长中期，用PBS进行洗涤三次后，用分光光度计测量菌落浓度然后进行计算和稀释将菌落浓度稀释到106CFU/ml。
(2)大菱鲆随机分为三组，每组15条，将浓度为300μM SsNKL27、P86P15(对照组多肽)和PBS的溶液分别进行腹腔注射。在注射SsNKL71h后，将稀释好的细菌取100μl进行腹腔注射。
(3)在细菌感染后12h和24h后进行取样，样品肝脾肾在超净工作台中取出，放入离心管中进行称量。
结果表明，感染后12h和24h，SsNKL27实验组的肝肾脾组织中创伤弧菌数量明显低于对照组。相比之下，从P86P15组的鱼肝脾肾中的鳗弧菌与对照组没有差别。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 一种抗菌肽SsNKL27及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Leu Lys Ser Lys Leu Met Ser Ile Cys Asp Gln Ile Gly Leu Leu
1 5 10 15
Lys Ser Leu Cys Arg Lys Phe Val Lys Val His
20 25

Claims (2)

1.一种抗菌肽SsNKL27，所述抗菌肽SsNKL27的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的抗菌肽SsNKL27在制备抑制药物中的应用，所述的药物为防治鱼类感染致病细菌的药物，所述致病细菌为：副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌或金黄色葡萄球菌。
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