CN114702598B

CN114702598B - 一种重组抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN114702598B
Application number: CN202210350495.5A
Authority: CN
Inventors: 汝少国; 刘一凡; 崔鹏飞; 谭蓉
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-04-02
Also published as: CN114702598A

Abstract

本发明提供一种重组抗菌肽，由假单胞菌信息素与氨基酸序列为SEQIDNO:2的肽段连接构成。本发明还提供了该重组抗菌肽的应用。具有更强广谱抗菌效果的重组抗菌肽，对于耐药菌的杀伤效果也得到了提升，具有优异的稳定性，并且对于哺乳动物细胞无细胞毒性。

Description

一种重组抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种重组抗菌肽及其应用。

背景技术

一直以来，细菌引发的侵入性感染是困扰人类的一大医学难题，各种病原体能引起脓肿、脓毒症、败血症等疾病，严重者可危及生命，耐药细菌导致的感染性疾病成为危害全人类健康的严重灾难,由耐药菌引起的死亡人数相当于HIV、乳腺癌和前列腺癌致死人数的总和。不仅如此，在水产养殖业中，由细菌性疾病引发的水产动物病害问题也愈发常见。自从20世纪30年代初抗生素被发现以来，各种新型抗生素逐渐被发现并投入医疗及养殖生产使用，但在取得良好治疗效果的同时，带来的细菌耐药、药物残留及水环境污染等问题也引起了国际社会的高度关注。因此寻找有效控制耐药细菌的新策略，开发安全可靠、无毒无害的新型抗菌剂来对耐药菌进行有效杀伤，克服耐药细菌带来的难题，开发抗生素的替代品是当下紧迫的研究目标。

在众多抗生素替代物中，抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)因其抗菌活性强、作用机制新而受到广泛关注。抗菌肽的抗菌机理与抗生素完全不同，通过破坏细菌细胞膜结构，使细菌内容物外渗而死亡，细菌不易对这类破膜机制产生耐药性。此外，抗菌肽能抑制细菌特异性酶或者DNA转录和蛋白质翻译，影响胞内蛋白质相互作用及酶促级联和胞质溶胶信号传导途径，这些作用机制都不容易引起细菌的耐药性。对于耐药菌来说，抗菌肽的杀菌机制可以规避大多耐药机制，可以对耐药菌进行有效杀伤。因此，抗菌肽有望解决耐药菌问题并替代抗生素，为应对抗生素滥用导致的一系列问题具有重要意义。

然而，天然抗菌肽存在生产成本高、抗菌活性普遍不强、稳定性低等问题，且部分抗菌肽所带的正电荷使其仍然具有一定的细胞毒性。为解决这些问题，必须对天然抗菌肽分子进行结构优化和改造修饰，方法有序列截断、氨基酸替换、环化、N-端乙酰化或C-端酰胺化等。基于抗菌肽构效关系，利用生物信息学技术和计算机辅助药物设计技术，优化组合各种参数，改变抗菌肽的氨基酸组成和结构，经过结构优化和改造修饰后的抗菌肽将会具有更强的抗菌活性和细胞选择性。

发明内容

本发明针对现有技术中因抗生素导致的病菌耐药性等技术问题提供一种具有更强广谱抗菌效果的重组抗菌肽，对于耐药菌的杀伤效果也得到了提升，具有优异的稳定性，并且对于哺乳动物细胞无细胞毒性。

本发明首先提供了一种重组抗菌肽，由假单胞菌信息素与氨基酸序列为SEQ IDNO:2的肽段连接构成。

在根据本发明的一个实施方案中，所述假单胞菌信息素的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。

在根据本发明的一个实施方案中，氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明还提供了上述的重组抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抗菌药物为用于治疗对抗生素具有耐药性的细菌感染的药物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述具有耐药性的细菌为对多种抗生素具有耐药性的细菌。

本发明进一步提供了一种用于治疗细菌感染的药物组合物，其包含上述的重组抗菌肽，以及药学上可接受的辅料。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

抗菌肽P-4能够通过引起细胞膜破坏、氧化损伤等机制杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，以及常见的耐药菌，具有优异的抗菌活性，但却对哺乳动物细胞没有毒性，这就为设计新的抗菌肽分子提供了模板。为抗生素替代品的创制及关联新药的开发提供检验指标和方案。

附图说明

图1为本发明提供的抗菌肽P-4、P-6和S-4具有的α-螺旋结构示意图。

图2为本发明所提供的抗菌肽P-4、P-6和S-4具有的两亲性结构螺旋轮结构示意图。

图3为抗菌肽P-4、P-6、S-4对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的杀菌活性示意图。

图4抗菌肽P-4对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)生长的抑制曲线。

图5a为抗菌肽1-4、P-4对小鼠巨噬细胞RAW264.7存活率影响的检测结果示意图。

图5b为抗菌肽P-4对于多药耐药的鲍曼不动杆菌(MDR-Acinetobacterbaumannii)以及多药耐药的大肠杆菌(MDR-Escherichia coli)的杀菌活性的稳定性结果示意图。

图6为抗菌肽P-4将藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)处理前后的透射电子显微镜照片。

图7为抗菌肽1-4、P-4处理前后鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等细菌内ROS探针荧光照片。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明的发明人首先鉴定得到了一个具有α-螺旋结构的文昌鱼抗菌肽mBjAMP1(SEQ ID NO:1NLCASLRARHTIPQCKKFGRR)，该天然抗菌肽由21个氨基酸残基组成，具有广谱抑菌作用，通过氨基酸替换得到的AMP1-4(1-4)(SEQ ID NO:2WKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR)，AMP1-4的抗菌活性相对天然抗菌肽有了明显提升，但针对一些致病菌以及耐药菌的杀菌活性仍还有不尽人意之处。因此在研究中，尝试将AMP1-4与一些具有特异性的肽段进行连接和重组，具体如下：

方案1：

将假单胞菌信息素KKHRKHRKHRKH(SEQ ID NO:3)片段与AMP1-4嵌合成得到的AMPP-4(P-4)(SEQ ID NO:4KKHRKHRKHRKHWKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR)。

方案2：

将假单胞菌信息素与抗菌肽1-6(SEQ ID NO:5WKKWSKKWKHWIPQCKKFGKK)嵌合形成的重组肽段P-6(SEQ ID NO:6KKHRKHRKHRKHWKKWSKKWKHWIPQCKKFGKK)。

方案3：

将金黄色葡萄球菌信息素(SEQ ID NO:7YSTCDFIM)与抗菌肽AMP1-4嵌合成抗菌肽S-4(SEQ ID NO:8YSTCDFIMWKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR)。

利用分析信息学技术和计算机辅助药物分子设计软件分析其理化性质，如表1所示。

表1抗菌肽序列及理化性质

另外，通过三维结构预测网站(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)，对所设计的抗菌肽进行三维结构建模分析。图1显示的三维结构表明该重组抗菌肽P-4、P-6、S-4均具有α-螺旋结构，其中，浅色部分是添加的信息素片段，深色部分是AMP 1-4部分。如图2所示，表明了所设计的抗菌肽(P-4、P-6、S-4)具有两亲性结构，其中，在螺旋轮投影中，亲水残基以圆圈形式出现，疏水残基以菱形形式出现，可能带负电的残基以三角形形式出现，可能带正电的残基以正方形形式出现。

本实施例中的抗菌肽均由GL生化(上海)有限公司，使用经典的固相合成法合成，所有抗菌肽都经过了末端酰胺化修饰，纯度大于95％。

实验例1.杀菌实验：

调整菌浓度到4×10⁴个/ml，用于后续的实验。肽的作用终浓度分别为2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml，PBS作为空白对照。将细菌与肽37℃共孵育0.5h之后，将混合液平均分为三份，涂布在三个含有LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜。接下来对菌落进行计数，记录每个平板上的菌落数量，统计抗菌肽的杀菌率。最小杀菌浓度(minimum bactericidalconcentration，MBC)：杀死99.9％的细菌所需的最低药物浓度。

选用革兰氏阴性菌副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和革兰氏阳性菌李斯特菌(Listeria monocytogenes)，以及多药耐药的鲍曼不动杆菌(MDR-Acinetobacterbaumannii)和多药耐药的大肠杆菌(MDR-Escherichia coli)来研究抗菌肽的杀菌活性，表2和表3的杀菌实验结果表明，所设计的P-4抗菌肽能直接杀死细菌和多药耐药菌，且杀菌率较高，比抗菌肽1-4的杀菌效果更强。

表2抗菌肽的最小杀菌浓度(MBC)

表3抗菌肽对耐药菌的最小杀菌浓度(MBC)

通过比较抗菌肽P-4、S-4、P-6对于藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、假单胞菌(Pseudomonas adaceae)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)的最小杀菌浓度来确定三者的杀菌活性。结果如表3、图4所示：抗菌肽P-4的杀菌活性要高于另外两者，说明以假单胞菌信息素KKHRKHRKHRKH片段修饰抗菌肽1-4(WKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR)上形成的P-4(KKHRKHRKHRKHWKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR)具备可靠的抗菌活性。

表4抗菌肽的最小杀菌浓度(MBC)

实验例2.抑菌实验

调整菌浓度到10⁶个/ml，用于后续的实验。将LB液体培养基、细菌、不同浓度的抗菌肽稀释液混合后培养8h，期间每1小时取出用酶标仪测定595nm波长的吸光值。根据所得结果绘制细菌生长曲线，能完全抑制细菌生长的最小浓度即为最小抑菌浓度(MinimumInhibitory Concentration，MIC)，统计抗菌肽对不同细菌的抑菌活性和最小抑菌浓度(MIC)。

表5抗菌肽对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)

表5为两条抗菌肽对三种细菌的最小抑菌浓度MIC，图4为抗菌肽P-4对三种细菌的额生长抑制曲线。如表5、图4所示，重组抗菌肽P-4对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)都有明显的抑制作用，抑制作用强于抗菌肽1-4，且都优于未改造前的天然抗菌肽mBjAMP1。

实验例3 细胞毒性实验

本实验用来检验抗菌肽对哺乳动物细胞的毒性，选用小鼠巨噬细胞RAW264.7，将细胞培养至对数生长期备用。将对数生长期的细胞转移至96孔板培养稳定后，向细胞中添加12.5μg/ml、25μg/ml以及50μg/ml不同浓度的抗菌肽溶液，孵育24h之后，添加MTT溶液，继续培养4h。最后吸掉孔中的液体，加入DMSO溶剂，用酶标仪检测样品在492nm波长时的吸光值。计算细胞的存活率。

细胞毒性实验表明(图5a)，实验中设置的不同浓度的抗菌肽P-4对小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率均没有明显影响，而抗菌肽1-4在25μg/ml以及50μg/ml时对细胞的存活均表现出一定的抑制作用，实验结果初步说明所设计的P-4抗菌肽对哺乳动物细胞没有毒性，安全性高于1-4。

实验例4 稳定性检测

调整菌浓度到4×10⁴个/ml，用于后续的实验。将肽提前在37℃模拟生理条件下孵育0h、6h、24h，然后稀释至作用终浓度为6μg/ml，PBS作为空白对照，将细菌与肽37℃共孵育0.5h之后，将混合液平均分为三份，涂布在三个含有LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜。接下来对菌落进行计数，记录每个平板上的菌落数量，统计抗菌肽的杀菌率，比较在模拟生理条件下处理抗菌肽是否会影响其杀菌活性以判定其生理条件下的稳定性。

稳定性检测实验结果如图5b所示，抗菌肽P-4在模拟生理条件下处理至24h后，杀菌活性没有降低，具备良好的生理条件稳定性，比抗菌肽1-4活性高。

实验例5 透射电子显微镜实验

将藤黄微球菌、鳗弧菌和李斯特菌培养到对数增长期。室温5000×g离心3分钟，去掉上层培养基，用灭过菌的PBS分别洗细菌，重复三次，最后将细菌重悬，调整菌浓度到10⁹个/ml，用于后续的实验。将50μl藤黄微球菌菌液，与50μl的抗菌肽结合，设置抗菌肽的终浓度为25μg/ml。PBS组作为空白对照。抗菌肽和菌液在37℃孵育半小时。把混合液与等体积的2.5％的戊二醛(用PBS配制)溶液混合，以固定细菌细胞。之后，吸取50μl细菌固定液在平板上，把载网浸入混合液，等待10分钟，让细菌吸附在载网上。随后，把用滤纸吸掉多余的液体，静置。把载网放到透射电镜中观察，拍照。

透射电镜实验结果如图6所示，抗菌肽P-4孵育后都能够对细菌形态造成明显的改变，细菌菌体形状变得不规则，细胞内容物流出，还有的细菌细胞表面出现孔洞，这都是造成细菌死亡的重要机制。

实验例6 细菌活性氧水平检测：

非荧光的2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)是一种细胞透性探针，对氧化性物质具有灵敏的反应，是一种常见的ROS荧光探针。PBS作为空白对照，将细菌与肽37℃共孵育0.5h之后，装载ROS探针，37℃孵育半小时后用PBS充分清洗细菌，最后将菌液滴于载玻片上，覆上盖玻片，用荧光显微镜成像。

荧光成像结果如图7所示，在与抗菌肽P-4作用后鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)等细菌内ROS水平均有大幅度提升，比抗菌肽1-4作用后的ROS水平高很多，表明抗菌肽P-4可以通过引发细菌内强烈的氧化应激反应引发细菌死亡。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种重组抗菌肽及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Leu Cys Ala Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile Pro Gln Cys Lys

1 5 10 15

Lys Phe Gly Arg Arg

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Lys Lys Trp Ser Lys Arg Trp Arg His Trp Ile Pro Gln Cys Lys

1 5 10 15

Lys Phe Gly Arg Arg

20

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Lys His Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His

1 5 10

<210> 4

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Lys His Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His Trp Lys Lys Trp

1 5 10 15

Ser Lys Arg Trp Arg His Trp Ile Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg

20 25 30

Arg

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Lys Lys Trp Ser Lys Lys Trp Lys His Trp Ile Pro Gln Cys Lys

1 5 10 15

Lys Phe Gly Lys Lys

20

<210> 6

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Lys Lys His Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His Trp Lys Lys Trp

1 5 10 15

Ser Lys Lys Trp Lys His Trp Ile Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Lys

20 25 30

Lys

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Tyr Ser Thr Cys Asp Phe Ile Met

1 5

<210> 8

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Ser Thr Cys Asp Phe Ile Met Trp Lys Lys Trp Ser Lys Arg Trp

1 5 10 15

Arg His Trp Ile Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg

20 25

Claims

1.一种重组抗菌肽，其特征在于，由假单胞菌信息素与氨基酸序列为WKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR(SEQ ID NO:2)的肽段连接构成；

所述假单胞菌信息素的氨基酸序列为KKHRKHRKHRKH(SEQ ID NO:3)，获得的重组抗菌肽氨基酸序列为P-4 KKHRKHRKHRKHWKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR(SEQ ID NO：4)。

2.如权利要求1所述的重组抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物为用于治疗对抗生素具有耐药性的细菌感染的药物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述具有耐药性的细菌为对多种抗生素具有耐药性的细菌。

5.一种用于治疗细菌感染的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的重组抗菌肽，以及药学上可接受的辅料。