CN107266547A

CN107266547A - 海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n2及其应用

Info

Publication number: CN107266547A
Application number: CN201710495924.7A
Authority: CN
Inventors: 王建华; 杨娜; 王秀敏; 滕达; 毛若雨; 郝娅
Original assignee: Beijing Sheng Tai Yun Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Sheng Tai Yun Technology Co Ltd
Priority date: 2017-06-26
Filing date: 2017-06-26
Publication date: 2017-10-20

Abstract

本发明提供海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用。通过对抗菌肽NZ17074分子结构进行优化设计，得到一个新型衍生肽N2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的抗菌肽N2对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果，并且显著降低了对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。小鼠毒血症模型试验结果表明，抗菌肽N2还具有抗内毒素血症作用，能够显著提高小鼠的存活率，并且优于抗生素多黏菌素。抗菌肽N2分子量小，易于人工合成，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物等，具有良好的应用前景。

Description

海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽及其应用，具体地说，涉及海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用。

背景技术

抗菌肽是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解形成的具有生物学活性的小分子多肽，主要构成了机体防御的第一道防线(ZASLOFF，Antimicrobial peptides ofmulticellular organisms.Nature，2002，415：389-395)。抗菌肽对细菌的作用机制主要是以膜作为靶位点，通过静电力和受体介导的细胞膜作用力，引起膜通透性改变，降低细胞膜稳定性，或插入细胞膜中形成跨膜的孔洞，最终导致细菌内容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用机制，使其不易产生耐药性，并且对许多临床耐药菌同样具有杀菌作用。因此，抗菌肽被认为可以替代传统抗生素，应用于饲料添加剂、医药卫生和食品防腐等领域。

虽然天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足，例如，部分抗菌肽活性相对较低，临床应用中对真核细胞具有强毒性、选择性差，对真核生物体内的正常菌群起到一定的杀伤作用，造成代谢的紊乱，这些都是限制抗菌肽发展的瓶颈。因此，以抗菌肽的结构与功能的关系研究为基础，通过生物信息学方法，对现有抗菌肽进行全新设计和结构改造，以期获得高抗菌活性、低毒性的抗菌肽衍生物。

Arenicin是海洋无脊椎动物海蚯蚓体内的一种具有β-折叠构象的抗菌肽，它结构简单，具有广谱抗菌活性，可以抑制多种革兰氏阴性菌、阳性菌和真菌，并且能够有效抑制耐药性大肠杆菌引起的尿路感染。但是在其进一步的临床应用中由于溶血性和细胞毒性而受到制约。因此，通过对抗菌肽的设计改造，保持高的抑菌活性，同时能够显著地降低溶血活性和细胞毒性，是本发明所要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高抗菌活性、极低细胞毒性和低溶血性的海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用。

为了实现本发明目的，发明人通过对抗菌肽NZ17074分子结构进行优化设计，用丙氨酸(A)替代海蚯蚓抗菌肽NZ17074氨基酸序列中第1和12位的甘氨酸(G)，得到一个突变体抗菌肽N2。突变体N2由21个氨基酸组成，分子量为2570Da，等电点为9.38。该突变体保持了与母体肽相似的杀菌活性的同时，显著降低了溶血性以及细胞毒性，具有良好的应用前景。

本发明的海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供编码所述衍生肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有所述衍生肽编码基因的表达盒。

本发明还提供含有所述衍生肽编码基因、表达盒的载体。

本发明还提供含有所述衍生肽编码基因、表达盒、载体的转基因细胞系或工程菌。

本发明还提供所述衍生肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌。

本发明还提供所述衍生肽在制备抗内毒素血症药物或组合物中的应用。

本发明还提供由所述衍生肽制备的治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物或组合物。

本发明进一步提供由所述衍生肽制备的抗内毒素血症药物或组合物。

本发明的抗菌肽N2对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果，并且显著降低了对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。小鼠毒血症模型试验结果表明，抗菌肽N2还具有抗内毒素血症作用，能够显著提高小鼠的存活率，并且优于抗生素多黏菌素。抗菌肽N2分子量小，易于人工合成，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物等，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的溶血性实验结果。

图2为本发明实施例3中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽的细胞毒性实验结果。

图3为本发明实施例4中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2对毒血症小鼠的保护实验结果。

图4为本发明实施例4中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽对毒血症小鼠肺组织的保护实验结果；其中，①：LPS注射组，30mg/kg；②：空白对照；③：5mg/kg N2治疗组；④：7.5mg/kgN2治疗组；⑤：15mg/kg粘杆菌素治疗组。图中，T:气道；V:血管；A：肺泡；1：气道上皮增生；2：气道基底膜增厚及出现明显的纤维化；3：大部分肺泡细胞出现塌陷与融合现象；4：气道与血管周围的肺泡细胞内有炎性细胞浸润。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的设计与合成

1、以NZ17074母体肽序列为基础，通过替换和增减氨基酸残基，通过适当增加抗菌肽疏水性和改变二硫键对数进行多肽的改造，最终确定了一个突变体抗菌肽N2，试图提高抗菌肽对革兰氏阴性菌的抑菌活性，抗菌肽N2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2、抗菌肽合成采用固相合成法，通过十二通道半自动多肽合成仪进行合成。反向高效液相色谱C18柱测定合成肽纯度(>90％)，ESI-MS质谱确认衍生肽N2和N6的分子量。

实施例2海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的抑菌实验

本实施例中的病原菌来自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)以及中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，具体菌株如表1所示。

衍生肽的最小抑菌浓度(MIC，minimum inhibitory concentration)的测定参照临床和实验室标准协会(CLSI，Clinical andLaboratory Standards Institute)制定的方法(WIEGAND等，Agar and broth dilution methods to determine the minimalinhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances.Nature protocols,2008,3(2):163-175)，根据具体情况略有改动，操作细节如下：

将受试菌株的单菌落挑至MH液体培养基中，37℃250rpm振荡过夜培养活化后，转接至MH液体培养基中培养至对数生长期(OD_600nm＝0.4～0.6)，然后制备成10⁵CFU/mL的菌液，加入96孔无菌细胞培养板内，每孔90μL。

用PBS通过2倍倍比稀释法对NZ17074及其衍生肽进行稀释，每孔10μL抗菌肽，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL，阴性对照组为PBS代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌MH培养基。每个处理做三个平行样。

将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16～18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌肽对受试菌株的MIC值。如果出现跳孔或平行样间结果不一致的情况，则重新测试。

结果如表1所示，抗菌肽对各革兰氏阴性菌种均体现出不同程度的较好抑菌效果。

表1海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽的MIC值测定

实施例3海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的细胞毒性研究

1、溶血性测定

溶血性是衡量抗菌肽是否适用于静脉注射治疗的重要指标，具体操作如下：

取6周龄SPF级的ICR雌鼠，眼球取血，使用肝素钠抗凝管收集。采集的血液于4℃，1500rpm离心10min，用10mM PBS(pH7.3)重复洗涤红细胞三次，至上清无色透明，制成8％的红细胞悬浮液。

将样品肽溶解于无菌0.9％生理盐水中，配制成浓度为512μg/mL的母液，2倍倍比稀释至终浓度为1μg/mL。各取100μL红细胞悬浮液和抗菌肽溶液加入到96孔板中，红细胞终浓度为4％。

将混合液至于37℃恒温培养箱静置孵育，1h后，4℃，1500rpm离心5min，将上清吸取至96孔板中，使用酶标仪在540nm下检测紫外吸光值。在相同条件下测定生理盐水和0.1％Triton X-100，分别为0％和100％溶血对照实验。溶血程度计算公式如下：

溶血度(％)＝[(Abs_540nm抗菌肽－Abs_540nm生理盐水)/(Abs_540nm0.1％TritonX-100－Abs_540nm生理盐水)]×100％

实验结果如图1所示。抗菌肽N2在256μg/mL浓度下溶血率为3.8％，具有极低的溶血性，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解而产生伤害，因此十分有利于在医药领域中进一步的开发应用。

2、MTT细胞毒性试验

通过对鼠源腹腔巨噬细胞RAW264.7存活率的影响来评价衍生肽对哺乳动物免疫细胞的毒害程度。

将RAW264.7细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下的培养箱中培养。细胞生长到对数期，用0.25％胰酶消化单层细胞；用含10％小牛血清的DMEM培养基重悬细胞，以5×l0⁴个/mL密度接种于96孔板中，每孔100μL；设置3～5个副孔，放入CO₂恒温培养箱中培养24h后移除培养基。

用PBS清洗两遍后，每孔按浓度梯度加入100μL浓度为2、4、8、16、32、64、256μg/mL样品肽，同时以加细胞而不加抗菌肽的孔为阳性对照，不加抗菌肽和细胞的孔为阴性对照。将细胞继续孵育24h后，吸取孔内培养基，用PBS洗两遍，每孔中加入20μL浓度为5mg/mL的MTT(MTT操作需避光进行)，然后放到培养箱继续培养4h。轻轻吸弃MTT液，加入150μL DMSO，微量振荡器振荡10min后，待孔底结晶完全溶解，酶标仪570nm波长处测各孔吸光度(OD值)。根据下面公式计算细胞增殖抑制指数(IR)：

存活率(％)＝OD加药/OD阴性×100％

测定结果如图2所示。抗菌肽对RAW264.7细胞的存活无影响，在抗菌肽浓度为2～128μg/mL的范围内，细胞的存活率都维持在90％以上，说明抗菌肽对动物真核细胞无细胞毒副作用，能够很好地区分哺乳动物细胞和细菌细胞。

实施例4海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽对LPS引起的小鼠毒血症的治疗效果

1、毒血症模型的建立

8周龄SPF级C57BL/6雄鼠10只，体重20g左右，购于北京维通利华实验动物有限公司。用PBS配制30mg/kg来源于E.coli 0111:B4的LPS(脂多糖)，进行腹腔注射。模型组动物12h内均呈现相应病态，蜷缩少动，精神萎靡，48h全部死亡，确定建模成功。

2、给药及治疗情况

将小鼠随机分组给药治疗，每组6只小鼠，共分六组：①未攻毒组CK；②生理盐水治疗组；③10mg/kg粘杆菌素阳性对照组；④15mg/kg粘杆菌素阳性对照组；⑤2.5mg/kg衍生肽N2；⑥5mg/kg衍生肽N2。小鼠用LPS攻毒30min后，进行腹腔注射治疗，每只小鼠200μL。8h后再次进行治疗，连续观察7天，记录小鼠存活率。

小鼠存活率如图3所示。阳性对照组和抗菌肽组均能有效提高小鼠存活率，仅5mg/kg的抗菌肽N2对毒血症小鼠保护率即达100％，治疗效果明显高于同浓度的阳性对照组。

3、肺组织切片的观察

取上述未治疗以及治疗存活组小鼠的肺组织置于4％多聚甲醛中过夜固定。水冲洗后进行脱水包埋，将凝固的蜡块进行切片粘附于载玻片上，再次脱水后进行苏木精染细胞核，伊红染细胞质，梯度脱水后，中性树胶封片，置于35～38℃烘干，即可对肺组织切片进行观察。

观察结果如图4所示，空白对照组小鼠肺组织的肺泡、血管和气道组织形态学结构完整，注射了LPS的感染组小鼠在肺泡、血管和气道等处均发生了显著的病变。衍生肽N2治疗组对LPS引起的病症现象均有所缓解，当治疗剂量为7.5mg/kg时，肺组织病变几乎完全消失，恢复到正常肺组织形态，说明抗菌肽N2能有效改善小鼠的病变组织，治疗效果优于相同剂量的粘杆菌素。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京生泰云科技有限公司

<120> 海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用

<130> KHP171112325.3

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Phe Cys Trp Asn Val Cys Val Tyr Arg Asn Ala Val Arg Val Cys

1 5 10 15

His Arg Arg Cys Asn

20

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctttctgtt ggaacgtttg tgtttacaga aacgctgtta gagtttgtca cagaagatgt 60

aac 63

Claims

1.海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述衍生肽的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达盒的载体。

6.含有权利要求2或3所述基因、权利要求4所述表达盒或权利要求5所述载体的转基因细胞系或工程菌。

7.权利要求1所述衍生肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。

8.权利要求1所述衍生肽在制备抗内毒素血症药物或组合物中的应用。

9.由权利要求1所述衍生肽制备的治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物或组合物。

10.由权利要求1所述衍生肽制备的抗内毒素血症药物或组合物。