CN107141338A - 一种抗菌肽rw‑p及其制作方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗菌肽RW‑P及其制作方法和应用，抗菌肽RW‑P的序列如SEQ ID No.2所示。制作方法如下：以简单的两种氨基酸为基本的氨基酸组成，以XXYY的序列形式重复三次得到α‑螺旋型抗菌肽RW，其中，X为精氨酸，Y为色氨酸。将RW抗菌肽第5位的精氨酸和第8位的色氨酸进行定点的氨基酸残基替代，引入脯氨酸，得到抗菌肽RW‑P。计算机结构预测和圆二色谱结构测定表明，RW为α‑螺旋结构，引入脯氨酸，RW‑P的螺旋含量降低。研究发现，RW‑P保持了RW的高抗菌活性，同时降低了细胞毒性，提高了细胞选择性。此方法为设计高效低度的抗菌肽应用于动物生产提供了理论依据。

Description

一种抗菌肽RW-P及其制作方法和应用

技术领域

本发明归属于农业畜牧兽医领域，提供了一种抗菌肽RW-P及其制作方法和应用。

背景技术

抗生素作为饲料添加剂应用于动物生产已经有半个多世纪，但是随着抗生素的大量使用，尤其是滥用，其英法德问题也越来越严重。细菌抗生素耐药型问题和抗生素在动物产品内的残留都严重影响着与牧业的发展，同时也威胁着人类的健康。因此寻找新型绿色的抗生素替代品作为新型的饲料添加剂应用于动物生产是现代畜牧业发展亟待解决的问题。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是存在生物体免疫系统中的一类小分子多肽，是机体抵御病原微生物入侵的第一道屏障。由于其分子量小，具有广谱的抗菌活性，特殊的膜作用方式细菌不易产生耐药性，由氨基酸组成在动物体内无残留等优点，近年来已经成为医药卫生、食品、畜牧生产等领域的研究热点。但是在抗菌肽的研究过程中，科学家也遇到了一些难题，其中细胞毒性就是制约抗菌肽应用的重要障碍之一。寻找设计高抗菌活性低细胞毒性抗菌肽的方法是能否实现其替代抗生素应用于动物生产中至关重要的环节。目前对于抗菌肽的研究，很多集中在天然抗菌肽的改造上，但是通过此种方法得到的抗菌肽衍生物通常并没有很好的抗菌活性，同时，由于其氨基酸序列与体内原有抗菌肽的序列相似，其在体内的稳定性不好，容易被机体内的酶代谢，失去活性。

发明内容

基于以上不足之处，本发明是为了提供一种抗菌肽RW-P及其制作方法和应用，打破原有的α-螺旋结构，提高抗菌肽的灵活性，降低抗菌肽细胞毒性。

本发明所采用的技术如下：一种抗菌肽RW-P，其序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种抗菌肽RW-P的制作方法，如下：

1)首先，选择带正电荷的精氨酸Arg和芳香族的色氨酸Trp作为基本结构单元，通过重复XXYY序列三次得到12个氨基酸残疾序列如SEQ ID No.1所示的α-螺旋抗菌肽RW，其中，X为精氨酸，Y为色氨酸；

2)然后，将得到的α-螺旋抗菌肽进行定点的氨基酸残基替代，分别将RW抗菌肽第5位的精氨酸和第8位的色氨酸替代为脯氨酸Pro，将原有的完整的α-螺旋结构打破得到抗菌肽RW-P，序列如SEQ ID No.2所示；

3)设计的抗菌肽采用固相化学合成法合成，经反相高效液相色谱纯化和电喷雾质谱法的鉴定，得到纯度大于95％的多肽纯品。

2、如上所述的一种抗菌肽RW-P，在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明具有如下有益效果及优点：

本发明从抗菌肽的结构功能关系入手，提出了一种全新设计高活性低毒性抗菌肽的方法。本方法只采用简单的几种氨基酸组成，以重复的序列单元，遵照蛋白质二级结构的折叠法则，设计得到高抗菌活性的α-螺旋抗菌肽，基于高抗菌活性α-螺旋抗菌肽的基础上，引入脯氨酸，打破原有的α-螺旋结构，降低细胞毒性，提高抗菌肽的治疗指数和安全性，为设计高效低毒的抗菌肽作为新型的饲料添加剂应用于动物生产提高了可行性的方法，奠定了理论基础。本发明的抗菌肽RW-P的螺旋含量降低，同时保持了RW的高抗菌活性。通过本方法得到的抗菌肽RW-P具有进一步研究开发成为抗生素替代品的潜质。

本方法设计得到的抗菌肽RW无论是通过计算机预测还是在模拟细胞膜疏水环境中的圆二色谱结果都表现出α-螺旋结构，表明α-螺旋抗菌肽设计成功。最小抑菌浓度测定结果表明RW对几种测定的革兰氏阳性菌和阴性菌都具有强抑菌活性。但最小溶血浓度和细胞毒性的测定结果显示，RW也同时表现出强细胞毒性；计算机结构预测和圆二色谱结果显示，在RW中引入脯氨酸后，原有的α-螺旋结构被打破，RW-P的螺旋比例下降。生物活性测定结果显示，RW-P保持了原肽RW的高抑菌活性，同时显著降低了细胞毒性，提高了治疗指数。

附图说明

图1为抗菌肽RW的计算机结构预测图；

图2为抗菌肽RW-P的计算机结构预测图

图3为抗菌肽RW的圆二色谱图；

图4为抗菌肽RW-P的圆二色谱图；

图5为抗菌肽RW和RW-P的溶血活性对比图；

图6为抗菌肽RW和RW-P对鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性对比图。

具体实施方法

实施例1

1抗菌肽的设计

1.1α-螺旋抗菌肽的设计

根据抗菌肽的结构功能关系，选择带正电荷的精氨酸和疏水性的芳香族氨基酸色氨酸为基本的氨基酸组成，以XXYY(其中，X为精氨酸，Y为色氨酸)为结构单元，将此单元重复链接三次，设计得到抗菌肽RW，其氨基酸序列为：

1.2打破α-螺旋结构的抗菌肽设计

应用定点氨基酸残基替代方法，在抗菌肽RW中间位置的结构单元将第5位的精氨酸和第8位的色氨酸替代为脯氨酸，得到抗菌肽RW-P，其氨基酸序列为：

2抗菌肽的合成和鉴定

设计得到的抗菌肽使用多肽合成仪，通过固相合成法合成，经电喷雾质谱法鉴定和反相高效液相色谱纯化，得到目标化合物，用于后续结构和活性测定。

3抗菌肽结构和生物活性测定

3.1计算机软件预测抗菌肽的二级结构

应用在线的结构预测软件I-TASSER，输入氨基酸序列预测抗菌肽的二级结构。

抗菌肽的二级结构预测图见附图1-2。从图中可以看出抗菌肽RW表现出标准的α-螺旋结构。当将两个氨基酸替代为脯氨酸后，抗菌肽的α-螺旋结构被破坏，仅部分片段呈螺旋结构。3.2圆二色谱法测定抗菌肽的结构

分别用10mM PBS(pH 7.4)和50％三氟乙醇(TFE)溶液模拟水环境和输水的细胞膜环境。将抗菌肽溶解于相应的溶液中(约150mM)用于结构测定。圆二色光谱仪的参数测定分别为：石英样品池的光程0.1cm，扫描测定波长范围为195-250nm，分辨率0.5nm，带宽1.0nm，扫描速度为10nm/min，在室温下进行测定。圆二色谱用平均残基摩尔椭圆度表示，单位为度·厘米²/分摩尔(degree·cm²·mdol^-1)。

经圆二色谱测定，抗菌肽在不同溶液中的二级结构见附图3-4。抗菌肽RW在模拟细胞膜输水环境的TFE中，在208nm和222nm处表现出两个负的特征肩峰谱带，这是典型的α-螺旋结构特征，但此谱带特征并未在抗菌肽RW-P中出现，表明脯氨酸的引入破坏了原有的α-螺旋结构。

3.3抗菌肽的最小抑菌浓度

配制一定浓度的肽溶液用于生物活性测定。将待测菌种接种于新鲜的MH(B)肉汤培养基培养过夜，最后将所得菌液的菌落数调整为约10⁵CFU/mL用于接种。取无菌的96-孔培养板，以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。将抗菌肽储存液加入到96-孔培养板的稀释液中，进行2倍的梯度倍比稀释，然后接种菌液。其中以不加抗菌肽组作为阳性对照，以不接种细菌组作为阴性对照已确定所有实验操作是在无菌环境下进行的。将培养板于37℃培养箱中孵育18-20h，无肉眼可见细菌生长的最低药物浓度即为该测定药物对检测菌的最小抑菌浓度。

抗菌肽的最小抑菌浓度见表1。从表中可以看出，抗菌肽RW和RW-P对测定的5中菌株都表现出极强的抗菌活性，最小抑菌浓度分别为2μM或4μM。表明脯氨酸的替代并未影响抗菌肽的抑菌活性。

表1抗菌肽的最小抑菌浓度的细胞选择指数

3.4抗菌肽的溶血活性及细胞选择指数

使用肝素钠抗凝管采集新鲜的人的血液1mL，1000×g离心5min，弃除上清，收集红细胞。将收集到的红细胞用PBS缓冲溶液洗涤三遍，弃上清，重悬血细胞定容至10mL。首先取无菌96-孔培养板，在其中加入PBS缓冲溶液，再加入待测抗菌肽，作2倍的梯度倍比稀释，然后加入等体积的血细胞溶液，37℃孵育1h，使用96-孔培养板离心机，1000×g离心5min，收集上清。使用酶标仪在570nm处测定吸光度值。本试验以0.1％Tritonx-100组作为100％溶血的阳性对照，以不加抗菌肽组作为阴性对照，计算抗菌肽在不同浓度的溶血活性。

抗菌肽细胞选择指数为抗菌肽引起5％溶血时的肽浓度与抗菌肽对不同测定菌株最小抑菌浓度几何平均数的比值。如在128μM抗菌肽的溶血率仍小于5％，使用256μM测定计算选择指数。

抗菌肽溶血活性随抗菌肽浓度的变化见附图4-5。从图中可以看出抗菌肽RW-P较RW的溶血活性显著降低，在最高测定浓度(128μM)，RW-P的溶血率仍小于5％。两个抗菌肽的细胞选择指数见表1，RW-P的选择指数是RW的27倍。

3.5抗菌肽的细胞毒性

细胞的准备：液氮中保存的鼠巨噬细胞RAW264.7复苏，培养于含有10％FBS和1％的青霉素和链霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养液中，在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养传代，每隔1天换一次培养液。当细胞达到80％～90％融合后，用PBS液洗涤细胞2次，加入0.25％的胰酶消化液，消化3～5min，至细胞间连接疏松，表明消化适度，迅速将胰蛋白酶倒掉，加入含10％胎牛血清的完全培养液5mL终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁，分散为单细胞悬液备用；

药物处理：在96孔板中采用2倍系列梯度倍比稀释法稀释待测抗菌肽样品，然后在各孔中加入等体积的细胞悬液，使各孔中细胞的浓度约为2×10⁴cells/孔。以不加抗菌肽和细胞组作为阴性对照，加细胞而不加抗菌肽组作为阳性对照，将96孔板置于5％CO₂，37℃培养条件下继续培养20-24h；

读数：培养结束后，在每孔中加入40μL MTT继续孵育4h，然后再加入150μL二甲基亚砜DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，将96孔板取出，使用酶标仪在492nm处测定吸光度值，计算细胞存活率。

抗菌肽的细胞毒性结果见附图6。从图中可以看出，抗菌肽RW具有强细胞毒性，细胞存活率随着抗菌肽浓度的升高显著下降，在4μM时细胞存活率已降至50％以下。相比较抗菌肽RW-P的细胞毒性降低显著，其在32μM时细胞存活率仍在70％左右。

综合以上结果可以得出，通过本方法可以快速有效地设计出高活性低毒性的抗菌肽，为抗菌肽作为新型饲料添加剂替代抗生素应用于动物生产奠定了基础，提高了可行性，本研究中得到的抗菌肽RW-P具有肽链短、活性高、毒性低等特点，具有开发应用的潜力。

＜110＞ 东北农业大学

＜120＞一种抗菌肽RW-P及其制作方法和应用

＜160＞ 2

＜210＞ 1

＜211＞ 12

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 1

Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp

1 5 10

＜210＞ 2

＜211＞ 12

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 2

Arg Arg Trp Trp Pro Arg Trp Pro Arg Arg Trp Trp

1 5 10

Claims (3)

1.一种抗菌肽RW-P，其特征在于，序列为SEQ ID No.2所示。

2.一种抗菌肽RW-P的制作方法，其特征在于，方法如下：

1)首先，选择带正电荷的精氨酸Arg和芳香族的色氨酸Trp作为基本结构单元，通过重复XXYY序列三次得到12个氨基酸残疾序列如SEQ ID No.1所示的α-螺旋抗菌肽RW，其中，X为精氨酸，Y为色氨酸；

2)然后，将得到的α-螺旋抗菌肽进行定点的氨基酸残基替代，分别将RW抗菌肽第5位的精氨酸和第8位的色氨酸替代为脯氨酸Pro，将原有的完整的α-螺旋结构打破得到抗菌肽RW-P，序列如SEQ ID No.2所示；

3)设计的抗菌肽采用固相化学合成法合成，经反相高效液相色谱纯化和电喷雾质谱法的鉴定，得到纯度大于95％的多肽纯品。

3.根据权利要求1所述的一种抗菌肽RW-P，在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。