CN106317201A

CN106317201A - 一种新型抗真菌多肽及其制备方法

Info

Publication number: CN106317201A
Application number: CN201510403750.8A
Authority: CN
Inventors: 李瑞芳; 陆志方
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-01-11

Abstract

本发明公开了一种新型抗真菌多肽及其制备方法。该抗真菌多肽的氨基酸序列为：NH₂-ALQGAKERAHQQ-COOH。本发明的制备方法是采用氨基酸氮Fmoc保护的固相多肽合成方法。本发明克服了常见抗菌肽生物安全性差、易溶血或对哺乳动物细胞有毒性的缺点，是一种对念珠菌具有特异抑制作用、不具有溶血性、对正常哺乳动物细胞没有毒性的新型抗真菌多肽。该多肽为临床抗真菌药物研究提供了一种新型先导物。

Description

一种新型抗真菌多肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制剂，具体涉及一种新型抗真菌多肽及其制备方法。

背景技术

近年来，在感染类疾病中，侵染性真菌感染的发病率及死亡率不断升高，耐药性真菌不断增多。但是，抗感染药物研发进展缓慢，特别是抗真菌药物先导化合物少，抗真菌药物品种少，可选范围窄。在侵染性真菌感染中，以念珠菌感染为主，且耐药性念珠菌感染发病率呈上升趋势。因此，尽快研究和开发新型、高效、低毒、病原真菌不易对其产生耐药性的抗真菌药物具有重要意义。

抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）是动物机体天然免疫系统的重要组成部分。细菌、真菌的细胞膜与哺乳动物的细胞膜所含组份不同，在细菌、真菌的细胞膜上不含胆固醇，而在哺乳动物的细胞膜上含有胆固醇。胆固醇可以降低抗菌肽对哺乳动物细胞的毒性，使抗菌肽能够选择性地杀伤细菌和真菌，而对哺乳动物细胞无害。与传统抗生素主要是通过抑制某一生物合成途径（如细胞壁、蛋白质）发挥作用不同，大多数抗菌肽通过破坏微生物膜、使线粒体活性氧水平升高、破坏细胞骨架等多途径、多靶点的作用机制抑制或杀死病原菌。抗菌肽独特的作用机制，致使微生物不易产生耐药性（Forde E, et al. Molecules, 2015, 20(1):1210-1227; 王欢，等. 细胞与分子免疫学杂志，2015，31(1): 137-139）。因此，抗菌肽用来治疗人和动物的疾病在临床上有着极大的潜力，可能是解决真菌耐药性、药物毒副作用问题的最佳选择。目前，抗菌肽已成为国际动物学、生理学和药理学领域的研究热点。从总体上看，在发现的抗菌肽中，具有抗细菌活性的抗菌肽较多，而具有抗真菌活性的抗菌肽较少。李瑞芳等利用基因工程重组表达技术制备并研究嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A, CGA）N-端衍生肽，发现CGA N端第31至第46位氨基酸组成的多肽CGA-N46，具有较强的抗真菌活性（李瑞芳，等. 中山大学学报（自然科学版），2006，45（2）：64-67）。抗真菌肽的发现为抗真菌药物的研发提供了优良的先导化合物，对治疗耐药性真菌感染具有重要价值。

利用基因工程技术表达多肽，表达产物不稳定，易被降解，纯化困难。化学合成30个氨基酸以上多肽，产物产量低、纯度低。因此，有必要对CGA-N46进行生物信息学分析，根据各部分结构特征和生物信息学特性，化学合成CGA-N46不同衍生片段，并进行比较，以期获得活性高、生物特性好、便于人工合成的抗真菌多肽片段。发明内容

采用固相化学合成技术获得了CGA N-端衍生多肽，并进行抗真菌活性研究，发现了具有较强抗真菌活性的动物内源性多肽，即位于CGA N-端第65位至第76位氨基酸组成的衍生片段CGA65-76。

对CGA65-76生物学特性进行研究，发现CGA65-76具有以下优点：（1）对念珠菌类病原真菌有特异的抑制作用，其中对热带念珠菌的增殖抑制作用最强，MIC₉₀为99.78µg/mL (75nmol/L)；（2）CGA65-76安全，在MIC₉₀浓度条件下，对红细胞没有溶血性，对兔肾原代细胞生长没有影响。对CGA65-76进行生物信息学分析，发现CGA65-76呈α-螺旋构型。

常见α-螺旋形抗菌肽抗菌机制是通过筒式模型或毯式模型使细菌细胞膜通透性增加，内容物外溢，达到抗菌目的。具有这种抗菌机制的抗菌肽多数具有溶血活性和哺乳动物细胞毒性。但CGA65-76在高出MIC₉₀浓度情况下，并不引起溶血，且对小鼠肾原代细胞没有毒性（见表1）。因此，CGA65-76是一种安全的新型抗真菌多肽。

表1 CGA65-76抗菌活性和细胞毒性

注：CGA65-76最大检测浓度2mg/ml

本发明克服了现有抗菌肽的不足，是一种安全的抗真菌多肽。本发明的第二个目的是提供了抗真菌多肽CGA65-76的制备方法。

实验表明本发明是一种安全、特异的抗念珠菌多肽，其制备未见报道。

附图说明

附图1为CGA65-76二级结构。

附图2为 CGA65-76质谱图。

具体实施方式

实施例1 抗真菌多肽的制备

采用固相Fmoc法合成目的肽段，由C端至N端合成。将该多肽C端第一个Fmoc-Ala-OH的羧基活化后与树脂结合，脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-Leu-OH结合，再脱去Fmoc-保护基，循环重复，直至添加所有氨基酸。用切割液切割树脂上的肽，收集切割液，于离心管中吹干，冰乙醚洗沉淀2~3次，离心去上清，吹干沉淀。将得到的粗品，HPLC纯化，质谱分析。CGA65-76的理论分子量为1336.47。采用质谱方法对主要成分多肽进行分子量鉴定，质谱图中的最高峰是MW+Na⁺+K⁺，与理论分子量吻合。

实施例2 MTT法测CGA65-76抗菌谱

1）称量和溶解蛋白质。配制CGA65-76磷酸溶液，设第一列初始浓度2mg/mL，终浓度为31.25μg/mL。则需配制4mg/mL的CGA65-76母液。用20mmol/L pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解CGA65-76，溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

2）使用移液枪，在96孔板的各孔中分别加入100μL的20mmol/L pH6.0的磷酸钠缓冲液，用于稀释CGA65-76。

3）用移液枪吸取100μL 4mg/mL CGA65-76母液至96孔板第一列的每个孔中。

4）反复吹吸板中第一列的溶液6~8次，混匀，不要溅起。

5）从第一列吸取100μL加入到第二列，反复吹吸混合6~8次，然后再吸取100μL至第三列。重复此步骤至第十列。

6）第十列吸取出的100μL丢弃，不要加入第11列，第11列为阴性对照孔。

7）分别将100μL菌悬液按顺序加入96孔板的第1列至11列，并反复吹吸6~8次，混匀。注意不要将菌悬液添加到第12列。第12列为空白对照孔。

8）在35℃下静置孵育96孔板48h

9）每孔加入20μL 5mg/mLMTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃置20min，并不时摇动，待晶体溶解完全后，用酶标仪于 490nm 处测 OD 值。

抑菌率（%）＝［（OD570(样品)–OD570（空白）］/［OD570(阴性)–OD570（空白）］×100。

MIC90定义为：使抑菌率达到90%时的CGA65-76最低浓度。

每个实验重复三次。

结果见表2。由结果可知，CGA65-76特异性抑制念珠菌，对热带念珠菌活性最强，抑制90%热带念珠菌生长的浓度为99.78µg/mL (75µmol/L)。

表2 CGA65-76抗菌谱

实施例2 溶血性测定

取无菌96孔板，吸取100μl 2％的人红细胞混悬液加入到96孔板中。在各个孔中分别加入100μl CGA65-76溶液，使CGA65-76终浓度分别为2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.125mg/mL，0.0625mg/mL和0.03125mg/mL，混合均匀，每个浓度重复三次。37℃孵育30min后，将各孔中的上清液取出转入到新的96孔微量滴定板中，使用微孔板酶标仪在570nm处测量样品的吸光度A。设未加CGA65-76的人红细胞混悬液为阴性对照（0%溶血），加入1% Triton X-100的人红细胞悬液为阳性对照(100%溶血)。计算溶血率。

溶血率计算公式：

溶血百分率(%)=[(样品A570–阴性对照A570)/(阳性对照A570–阴性对照 A570)]×100%

结果表明：5%溶血率时，CGA65-76浓度为522μg/ml，远远高于所测其对念珠菌的MIC90。可见，CGA65-76生物安全性高。

实施例4 CGA65-76对小鼠肾原代细胞毒性实验

将刚出生昆明乳鼠75%的酒精浸泡5分钟后取出，无菌条件下取出双侧肾脏，经无菌生理盐水漂洗干净后，用剪刀剪成0.5mm大小的组织块。加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶， 37℃消化5分钟，用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。加入1~2ml含10%小牛血清的RPM1640培养液终止消化。净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心，800-1000rpm离心8~10min，吸取上清液在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后置37℃孵箱中培养。

原代细胞培养3~5d，长满单层后，吸出培养液，用PBS洗细胞2次，用0.25%胰蛋白酶消化细胞5~10min，立即加入含有10%FBS的RPM1640终止细胞的消化过程。吸管吹打细胞悬液，吸出置于离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，重新加入RPM1640培养基，血球计数板计数，用培养基RPMI1640调整细胞悬液浓度为1×10⁵个/mL。取细胞悬液于96孔板中，100μl/孔，培养24h，使细胞贴壁后，弃旧培养液， 90μl新鲜的细胞培养液和10μl不同质量浓度的CGA65-76,使其终浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL，每个浓度设3个平行孔，并设置阴性细胞对照和空白对照。37℃，5% CO₂条件下，继续培养48小时。取出96板，弃去旧液，PBS洗涤1~2次，加入100μL 新鲜培养液，每孔加入20μl，5mg/ml MTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，37℃ 20min，并不时摇动，待晶体溶解完全后，用酶标仪于 490nm 处测 OD 值。根据下列公式计算CGA65-76对乳鼠肾原代细胞生长的抑制率作用:

抑制率（IR）%＝（阴性对照组平均OD值－试验组平均OD值）÷（阴性对照组平均OD值）×100％

结果见表3，测试的CGA65-76最高浓度（2mg/ml），CGA65-76对乳鼠肾原代细胞生长抑制率为0，即CGA65-76对乳鼠肾原代细胞没有毒性作用。

表3 CGA65-76作用下乳鼠肾原代细胞OD₅₇₀

Claims

1.一种新型抗真菌多肽，其特征在于：该抗真菌多肽氨基酸序列为NH₂-ALQGAKERAHQQ-COOH。

2.权利要求1中所述抗真菌多肽的制备方法，其特征在于：是采用常规固相多肽合成技术制备的。

3.权利要求2中的抗真菌多肽制备方法，其特征在于：在Fmoc保护系统的固相合成中，首先将Rink Amide-AM Resin装在反应器中，20%哌啶溶液去保护；将C端第一个氨基酸Fmoc-Ala-OH与反应器中的去保护Rink Amide-AM Resin混合，在HOBt/DIC催化下，结合到固相载体上；按照给定的氨基酸序列，Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH依次偶联，由C端逐个向N端延伸，最后用切割液（87.5% TFA, 2.5% 1,3-dimethoxybenzene, 2.5% triisopropylsilane, 2.5% H2O, 5% thioanisole）将多肽从固相载体上切下来。

4.根据权利药物2所述的抗真菌肽制备方法，其特征在于可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各种氨基酸残基，偶联剂可使用二异丙基碳二亚胺（DIC），二环己基碳二亚胺（DCC）进行直接偶联，或使用羟基苯骈三氮唑（HOBt）或7-氮杂羟基苯骈三唑（HOAt）活化氨基酸。