CN112341522A - 一种抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗菌肽及其应用，是海南沼蛙抗菌肽Temporin‑GHa(GHa)的衍生肽GHaR、GHa4R和GHa11R；属于肽类抗生素的应用领域，通过对抗菌肽GHa进行定向改造，得到衍生肽GHaR、GHa4R和GHa11R；本发明的GHaR、GHa4R和GHa11R具有更强、更快的抗MRSA活性，GHa11R有可能成为新的穿透肽；GHaR和GHa11R高效抗MRSA生物被膜活性、不易产生耐药、低细胞毒性和高细胞选择性使其成为治疗MRSA感染有巨大前景的新型抗菌药候选物。

Description

一种抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及肽类抗生素的应用技术领域，具体为一种抗菌肽及其应用。

背景技术

在人类历史上，传染病一直是全球威胁生命健康的严重问题之一。抗生素的发现和发展对人类对抗传染性疾病产生了变革性影响。然而，由于抗生素滥用，细菌已进化出各种策略逃避其杀灭作用，使多重耐药菌感染治疗成为严峻的挑战。金黄色葡萄球菌是临床常见病原体，可引起多种浅表皮肤感染和全身性疾病(心内膜炎和化脓性关节炎)。近年流行病学数据显示，医院和社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染数量急剧增加。因此，探索抗生素的替代品成为世界急需解决的难题。抗菌肽(antimicrobialpeptide，AMP)的广谱抗菌活性、低耐药性和低免疫原性，使其成为极有前景的治疗细菌感染的抗生素替代品。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种抗菌肽及其应用，本发明的GHaR、GHa4R和GHa11R衍生肽具有更强、更快的抗MRSA活性，GHa11R有可能成为新的穿透肽；衍生肽高效抗MRSA生物被膜活性、低细胞毒性和高细胞选择性使其成为治疗MRSA感染有前景的新型抗菌候选药物。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHaR(H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Phe-NH2)。

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHa4R(H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-His-Leu-Phe-NH2)。

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHa11R(H-Phe-Leu-Gln-His-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Phe-NH2)。

优选地，所述抗菌肽具有广谱抗微生物活性和抗生物被膜活性。

优选地，所述抗菌肽在治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病中的应用。

一种药物组合物，其特征在于，含有上述任意一项所述的抗菌肽。

本发明的有益效果在于：本发明的GHaR、GHa4R和GHa11R衍生肽具有更强、更快的抗MRSA活性，GHa11R有可能成为新的穿透肽；衍生肽高效抗MRSA生物被膜活性、低细胞毒性和高细胞选择性使其成为治疗MRSA感染有前景的新型抗菌候选药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为肽对MRSA的杀菌动力学；

图2为荧光光谱法测定肽对MRSA的膜渗透性；

图3为GHa及衍生肽对MRSA形态的影响；

图4为抗MRSA生物被膜能力测定；

图5为GHa及其衍生肽对肿瘤细胞和正常细胞的毒性；

图6为肽在无菌和含MRSA条件下的溶血活性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种抗菌肽及其应用，是海南沼蛙抗菌肽Temporin-GHa(GHa)的衍生肽GHaR、GHa4R和GHa11R。

一种抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列为GHaR(H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Phe-NH₂)。

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHa4R(H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-His-Leu-Phe-NH₂)。

一种抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列为GHa11R(H-Phe-Leu-Gln-His-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Phe-NH₂)。

进一步的，抗菌肽具有广谱抗微生物活性和抗生物被膜活性。

进一步的，抗菌肽在治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病中的应用。

一种药物组合物，含有上述任意一项的抗菌肽。

1.1实验方法

1.1.1抗菌肽设计及其理化性质分析

以海南沼蛙的抗菌肽temporin-GHa为模板设计衍生肽。使用DBAASP和APD3数据库分析肽的物理化学性质，以辅助设计具有更强抗菌活性的衍生肽。

1.1.2抗菌肽的合成

GHa和衍生肽采用N-9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成。制备液相色谱仪(LC6000)用于制备，高效液相色谱仪(LC3000)用于分析。制备条件：检测波长为220nm，流速为180mL/min，制备柱为C18柱。流动相：含0.1％TFA的100％乙腈，和含0.1％TFA的超纯水。肽的C-末端进行酰胺化修饰，反相高效液相色谱纯化，纯度≥95％，通过电喷射质谱鉴定抗菌肽。

1.1.3最低抑菌浓度测定

使用二倍稀释法依次配置系列浓度梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，分别加入等体积的MRSA菌液(2×10⁶CFU/mL)于各孔中。设置阳性对照(含有菌液而不含抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽)。37℃恒温培养过夜，肉眼未见孔底部有混浊现象的肽的最低浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。

1.1.4稳定性研究

1.1.4.1存储时间和存储温度的影响

将样品在25℃、4℃和-20℃保存30天、60天和90天，到相应存储时间后测定抗菌肽对MRSA的MIC。

1.1.4.2蛋白酶的影响

无菌水配制2mM样品，按肽：酶摩尔浓度比40:1分别加入V8蛋白酶(500units)或胰蛋白酶混合均匀，37℃孵育12h后测定抗菌肽对MRSA的MIC，未用酶处理的样品作为阳性对照。

1.1.4.3人血清的影响

配制含5％和10％人血清的TSB液体培养基。以此为细菌培养基测定样品对MRSA的MIC。未用样品处理孔作为阳性对照，无细菌只含5％或10％人血清的TSB液体培养基作为阴性对照(空白)。

1.1.5杀菌曲线测定

对数生长期MRSA调整至浓度2×10⁶CFU/mL备用。在eppendorf管中用TSB两倍连续稀释抗菌肽。各管中加入300μL稀释的细菌悬液，使肽的终浓度为1/2-2×MIC。37℃温育，分别在0、15、30、60、90、120和180分钟收集等分试样，用0.9％NaCl溶液系列稀释。100μL稀释样品涂琼脂平板，37℃孵育24小时，计菌落数。不含肽的TSB为阴性对照。绘制lg CFU/mL与时间的关系构建杀菌曲线。

1.1.6抗MRSA机制研究

1.1.6.1荧光光谱法测定膜渗透作用

在96孔板中制备100μL二倍系列稀释的样品。每孔中加入8μL碘化丙啶(终浓度为20μM)和92μL MRSA(终浓度1×10⁸CFU/mL)。磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照，无抗菌肽孔为阳性对照。多功能酶标仪37℃100rpm连续培养2小时，每5分钟读取一次。激发和发射波长分别为584nm和620nm。1.1.6.2扫描电子显微镜(SEM)观察肽对细菌形态的影响

PBS洗涤细菌三次，重悬至2×10⁸CFU/mL，菌液与抗菌肽(终浓度为4×MIC)体积比1:1混合共孵育60min。PBS作为空白对照。离心收集细菌，PBS洗涤三次，2.5％戊二醛固定3h。离心收集细菌并洗涤三次，依次用30％、50％、70％、90％和100％的无水乙醇脱水15min，将细菌滴至锡箔纸上，冷冻干燥过夜，真空高压喷金，扫描电镜观察细菌的形态。

1.1.7体外耐药性诱导试验

将MRSA接种于含1/2×MIC抗菌肽的TSB培养基中，37℃振荡培养24小时，按百分之一的量将其接种到含有1/2×MIC抗菌肽的新鲜TSB培养基按上述条件继续培养；重复传代培养40天。在第7、15、30、40天测定抗菌肽对MRSA的MIC。抗生素为阳性对照，无抗菌肽培养基为阴性对照。

1.1.8 MTT法检测抗生物被膜活性

1.1.8.1抑制细菌初始贴附

将MRSA用TSB(含有1％葡萄糖)调整至浓度2×10⁸CFU/mL。在96孔板中用TSB二倍稀释抗菌肽100μL，各孔加入等体积细菌悬液，无抗菌肽TSB用作阴性对照。37℃下静止孵育4小时，如下用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑鎓溴化物(MTT)检查生物被膜的生物量。

1.1.8.2抑制生物被膜的形成

对数生长期MRSA在TSB(含1％葡萄糖)中稀释至2×10⁶CFU/mL。在不存在(阴性对照)或存在不同浓度的抗菌肽的情况下，将MRSA悬浮液接种到96孔板，37℃孵育24小时，如下用MTT测定法检查生物被膜的生物量。

1.1.8.3预先形成的生物被膜破坏

MRSA在TSB培养基中稀释至10⁶CFU/mL。将200μL菌悬液接种到96孔平底板上37℃孵育24小时。用PBS洗涤两次，用系列二倍稀释抗菌肽200μL37℃处理24小时。如下用MTT测定法定量肽破坏生物被膜的能力。

1.1.8.4生物被膜代谢活性测定(MTT测定)

轻轻地除去如上处理的板中的培养基，自然干燥。各孔中加入5μL的MTT溶液(5mg/mL)和95μL PBS(pH7.2)，37℃孵育3小时。加入150μL二甲基亚砜(DMSO),用酶标仪在570nm测量吸光度。代谢活性的抑制百分比计算：[(OD₅₇₀空白对照组-OD₅₇₀实验组)/OD₅₇₀空白对照组]×100％。

1.1.9细胞增殖测定

人乳腺癌细胞(Human breast cancer cells，MCF-7)、人肝癌细胞系(Humanhepatocellular liver carcinoma cells，HepG2)、人正常肝细胞(Human hepatocytes，HL-7702[L-02])用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养液，在5％的CO₂、37℃恒温培养箱中培养。待细胞长满80％，用胰酶酶解细胞，用培养基稀释至5×10⁴cells/mL，96孔板每孔加入100μL，37℃，5％CO₂培养24小时。除去上清液，加入100μL系列二倍稀释的样品(3.1-200μM)。不含样品的培养基作为空白对照，5-氟尿嘧啶(5-FU)为阳性对照，在培养箱继续孵育24小时。每孔加入10μLCCK-8溶液继续孵育2-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

计算公式：细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

As:实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物)；

Ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)；

Ab:空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。

1.1.10溶血活性

将人红细胞(hRBC)用PBS(pH7.2)洗涤3-5次，至上清液澄清，稀释至2×10⁸cells/mL(4％)。分别将300μL的hRBC悬浮液和300μL二倍连续稀释的肽混合，37℃孵育60分钟，收集上清液150μL至新的96孔板中，在450nm处检测吸光度。PBS处理细胞的吸光度表示零溶血，0.1％TritonX-100处理细胞表示100％溶血。另外，将含1×10⁶CFU/mLMRSA的hRBCs溶液与肽共同孵育评估肽的选择性。最小溶血浓度(MHC)定义为导致10％溶血的肽最低浓度，导致50％溶血的肽最低浓度为HL₅₀。

1.2实验结果

1.2.1基于抗菌肽GHa的优化设计，理化性质分析

使用本实验室分离的抗菌肽temporin-GHa作为模板设计一系列衍生肽。为了获得高效低毒的抗MRSA和抗生物被膜肽，我们使用R分别在两亲性螺旋结构的两端进行H的单点和多点保守突变，共获得以下三条衍生肽序列(序列及物化性质见表1.1)。

表1.1 GHa及其类似物的序列和理化性质

^aDetermined at DBAASP, PI was isoelectric point；^bDetermined at APD3,BIis the Boman index(kcal/mol),AI:Amphiphilicity Index

1.2.2抗微生物活性

GHa仅对金黄色葡萄球菌，变形链球菌和大肠杆菌具有较小的活性，没有抗真菌活性，而衍生肽具有比GHa更有效和更广谱的抗菌活性，MIC降低了4-8倍(表1.2)。双位点突变体GHaR对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均显示有效的抗菌活性，MIC为1.6-25μM。衍生肽还获得了对临床常见的MRSA-1-3的抗菌活性，MIC范围为3.1-25μM，对MRSA-1和3的活性比万古霉素高8-16倍。GHaR与C端单点突变体GHa11R对革兰氏阳性菌表现出相似的高抗菌活性，但对革兰氏阴性菌，双位点突变体要强于C端单点突变体。N端单点突变体GHa4R具有相对较弱的活性。衍生肽的MBCs接近MICs值，相比GHa降低了4-32倍，表明衍生肽比GHa具有更强的杀菌作用。衍生肽的杀菌活性比卡那霉素高。与亲本肽相比，衍生肽对真菌均有更好的活性。

表1.2 GHa及其类似物对所测试菌株的MIC和MBC

SA:S.aureus(ATCC 25923),SM:S.mutans(ATCC 25175),BS:B.subtilis(ATCC6633),MRSA:methicillin-resistant S.aureus(ATCC 43300),MRSA-1-3:methicillin-resistant S.aureus(clinically isolated,No.1-3),EC:E.coli(ATCC 25922),D31:E.coli(D31)is an anti-streptomycin strain,PAO1:P.aeruginosa PAO1(wild type),PA:P.aeruginosa(ATCC 15442),CA:C.albicans(ATCC 10231),ND means not detected.

1.2.3稳定性研究

GHaR和GHa11R在25℃、4℃和-20℃保存30天、60天和90天后对MRSA的MIC值保持不变(表1.3)，表现出很好的稳定性和较长的保质期。

表1.3存储时间和存储温度对抗菌肽活性的影响

GHaR和GHa11R在V8蛋白酶处理12小时后对MRSA的MIC值保持不变，表现出对V8蛋白酶很好的抗性。在胰蛋白酶处理12小时后，GHa11R对MRSA的MIC值仍然保持不变，GHaR仅增大至6.2μM(表1.4)。

表1.4蛋白酶对抗菌肽活性的影响

在5％血清中GHaR对MRSA的MIC值保持不变，GHa11R对MRSA的MIC值为6.2μM，活性略微降低。在10％血清中，GHaR和GHa11R的活性均受到影响，抗菌活性降低4-8倍(表1.5)。

表1.5人血清对抗菌肽活性的影响

1.2.4杀菌曲线测定

所有肽对MRSA均表现出浓度依赖性和时间依赖性的杀菌活性(图1)。衍生肽对MRSA表现出极快的杀菌速率，当衍生肽浓度为2×MIC时细菌在15分钟内全部被杀死，GHaR在1×MIC浓度时，30分钟内可杀死全部细菌(图1B)。GHa在2×MIC浓度下即使作用3小时仍无法完全消灭细菌(图1A)。

1.2.5抗MRSA机制研究

1.2.5.1膜渗透作用

GHaR和GHa4R处理组在高浓度时PI荧光以浓度依赖和时间依赖的方式增加，4×MIC浓度的GHaR和GHa4R处理细菌后，40分钟达到最大荧光值，与阴性对照相比，增大了约6倍(图2)。而GHa和GHa11R荧光强度几乎不变。结果表明，GHaR和GHa4R直接破坏细菌膜结构完整性发挥其抗MRSA活性，GHa和GHa11R几乎没有膜渗透作用，可能以其他作用机制抑制MRSA生长。

1.2.5.2扫描电子显微镜(SEM)

通过SEM观察，阴性对照细菌呈球状，表面光滑(图3A)。GHa(图3B)和GHa11R(图3D)处理组个别细胞表面遭到轻微破坏。而GHaR(图3C)处理的细胞膜完整性受到严重破坏，胞内内容物渗出，细菌皱缩，失去完整形态。结果表明，MRSA细菌细胞膜结构被GHaR破坏，导致细菌快速死亡。GHa和GHa11R对MRSA细胞膜破坏作用小。

1.2.6耐药性

GHaR和GHa11R在40天内对MRSA的MIC值保持不变，表明MRSA对GHaR和GHa11R不易产生耐药性(表1.6)。万古霉素在30天的时候对MRSA的MIC值增大了4倍，表明MRSA对万古霉素的敏感性慢慢降低，产生耐药。

表1.6不同时间诱导耐药性后测定样品对MRSA的MIC值

1.2.7抗MRSA生物被膜活性

MRSA引起的化脓性皮肤和软组织感染经常呈现慢性化和反复化的临床特征，这主要是因为MRSA易形成生物被膜，导致其对抗生素的敏感性降低，不易治愈。GHaR和GHa11R对MRSA生物被膜初始粘附阶段具有较好的抑制作用，GHa在6.2μM浓度下无抑制作用(图4A-C)。相对于GHaR明显的剂量依赖性效应，GHa11R在低浓度时，剂量依赖效果不明显，当达到高浓度6.2μM时，抑制率与GHaR(84％)相近，达到86.3％。衍生肽比GHa更有效地抑制MRSA细菌的初始粘附。

GHa和GHaR以剂量依赖性抑制方式抑制MRSA生物被膜的形成(图4D-F)。表15显示了抑制50％的生物被膜形成(MBIC₅₀)和抑制90％的生物被膜形成(MBIC₉₀)所需的最小抑制浓度。GHa的MBIC₅₀为95.6μM，MBIC₉₀高于100μM。GHaR和GHa11R的MBIC₅₀值分别为1μM和1.8μM，MBIC₉₀值降低了32倍。衍生肽抑制MRSA生物被膜形成的能力显著提高。

GHa和衍生肽以剂量依赖性方式清除成熟生物被膜(图4G-I)。GHaR和GHa11R清除成熟生物被膜的能力相当，浓度为25μM时，几乎所有生物被膜都被破坏。GHaR和GHa11R的MBEC₅₀分别为4.8μM和5.2μM，MBEC₉₀均为25μM(表1.7)。与亲本肽相比，MBEC₅₀降低32倍左右，MBEC₉₀降低4倍以上。与GHa相比，衍生肽表现出增强数倍的抗MRSA生物被膜的能力。

表1.7抗生物被膜能力分析

1.2.8细胞毒性

样品肽对人正常细胞系HL-7702均表现出较低的细胞毒性(图5)，IC₅₀值大于180μM(表1.8)，均远高于MIC值。而对人癌细胞系显示出较强的抗增殖活性。GHaR表现出广谱抗增殖活性，对MCF-7和HepG2的IC 50值分别为19.82μM和18.89μM，远高于临床上市药品5-FU。GHa仅对HepG2具有抗增殖活性，IC 50值为20.57μM，GHa11R的抗癌活性弱。GHa及其衍生肽对正常细胞几乎无毒性，GHa和GHaR对肿瘤细胞具有较强的选择性。

表1.8肽对不同细胞的IC₅₀值(μM)

1.2.9溶血活性

通过测定MRSA存在时肽的溶血毒性的变化，评估肽对MRSA和红细胞的选择性(图6)。GHa、GHaR、GHa4R和GHa11R的MHC分别为20、13.6、14.3和12.5μM(表1.9)。衍生肽的MHC是其对MRSA的MIC的2-4倍。GHa的CSI值是1，而GHaR为亲本肽的15倍，GHa11R具有最高的选择性指数，CSI为37.4。在MRSA存在下，GHaR和GHa11R的HL₅₀显著增加，均高于200μM，而GHa的溶血活性未改变，表明衍生肽对细菌的选择性提高。结果表明衍生肽对MRSA具有高度的选择性，使GHaR和GHa11R具有更宽的治疗窗口。

表1.9溶血活性分析

^aThe minimum hemolytic concentration that caused 10％hemolysis ofhRBC；^bThe concentration at which 50％of hRBCs were lysed；^cCSI：calculated usingthe ratio of HL₅₀ to the MIC of the peptide against MRSA.

1.3讨论与结论

抗生素的发现是现代医学最伟大的成就之一，但过量使用导致微生物耐药性的产生。MRSA已在全球范围内引起关注。这种“超级细菌”会引起皮肤，软组织，呼吸道，骨关节和血管内感染，可能导致多种危及生命的恶性疾病，却没有有效的治疗药物。目前万古霉素是治疗MRSA感染的最后一道防线，但随着耐万古霉素菌株的出现，MRSA耐药性问题越发突出。由于全新化学结构抗生素研发停滞不前，发现新型抗MRSA及抗生物被膜的抗菌药物是人们亟待解决的问题。

因此，为了获得具有高效抗MRSA和抗生物被膜的抗菌肽，我们以GHa为模板进行定向改造，获得三条精氨酸突变衍生肽。与多数temporin抗菌肽类似，GHa对革兰氏阳性细菌的抗菌活性比对革兰氏阴性细菌高。抗微生物活性筛选表明衍生肽具有比GHa更有效且更广谱的抗菌活性。双位点突变体和C端单点突变体比N端单点突变体具有更强的活性。因此temporin肽的C端在发挥抗菌活性中起着重要作用，其中11位是关键的氨基酸位点。精氨酸残基对AMP的抗微生物活性比组氨酸贡献更大，这可能是由于R与细菌细胞膜带负电荷的磷脂之间的静电结合强于组氨酸。衍生肽对革兰氏阴性细菌的抗菌活性提高。

由于抗菌肽结构复杂，稳定性研究对于成药性至关重要。GHaR和GHa11R在不同存储时间和存储温度下表现出良好的稳定性和较长的保质期。MRSA感染中细菌可分泌多种致病因子，包括细胞外毒素和蛋白酶，这些致病因子有助于疾病的发生。衍生肽对金黄色葡萄球菌V8蛋白酶具有很好的抗性。GHa11R对胰蛋白酶也有良好的抗性，GHaR活性略微降低，可能是胰蛋白酶降解了少量GHaR所致。血清浓度为5％时衍生肽活性不受影响，当浓度为10％时，GHaR和GHa11R的活性稍微降低，GHaR和GHa11R对人血清有良好的耐受性。衍生肽在血清中的稳定性及更快速高效的杀菌作用使其在MRSA体内感染的治疗中具有极大的优势。4×MIC浓度的GHa和GHa11R对MRSA细胞膜损伤作用不明显，可能以其他作用机制抑制MRSA生长；而GHaR和GHa4R直接快速(40min内)破坏细菌细胞膜结构完整性发挥其抗MRSA活性。通过结构模拟发现GHaR和GHa4R第1位的F和第4位的R残基之间平行(即堆叠)排列是产生阳离子-π相互作用的优选构象(阳离子-π相互作用可以在平行或垂直的T形方向发生)，这促进了GHaR和GHa4R的膜渗透作用。综合以上研究，GHaR主要是通过膜裂解机制(电荷-电荷和疏水相互作用)，而GHa11R可能作为穿透肽作用于细胞内靶点，仅轻微诱导细胞膜损伤。

MRSA往往形成高度结构化的生物被膜，导致反复性难以治愈的慢性感染等疾病。MTT实验表明，与GHa相比，衍生肽抑制MRSA初始贴附、生物被膜形成和清除成熟生物被膜的能力显著提高。

细胞毒性评估在开发有前途的新型抗菌剂中尤为重要。GHa及衍生肽对人正常细胞系HL-7702均表现出较低的细胞毒性，但对人癌细胞系显示出较强的抗增殖活性。特别是GHaR对MCF-7和HepG2的活性远高于临床上市药品5-FU。GHa11R的抗癌活性很弱。GHa和GHaR对肿瘤细胞较强的选择性可能使其成为良好的抗肿瘤候选药物。

在感染病灶中存在大量细菌，通过测定MRSA存在时肽的溶血毒性的变化，评估肽在MRSA和红细胞之间的选择性。GHaR和GHa11R显著增大的CSI值体现了其宽泛的治疗窗口，降低了治疗风险。

总之，本发明的GHaR、GHa4R和GHa11R衍生肽具有更强、更快的抗MRSA活性，GHa11R有可能成为新的穿透肽。衍生肽高效抗MRSA生物被膜活性、低细胞毒性和高细胞选择性使其成为治疗MRSA感染有巨大前景的新型抗菌药候选物。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 可用于治疗MRSA感染的新型抗菌肽

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Leu Gly Ala Ile Ile Gly Ala Leu Gly Ala Leu Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Leu Gly Ala Ile Ile Gly Ala Leu Gly His Leu Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Leu Gly His Ile Ile Gly Ala Leu Gly Ala Leu Pro

1 5 10

Claims (6)

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHaR(H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Phe-NH2)。

2.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHa4R(H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-His-Leu-Phe-NH2)。

3.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为GHa11R(H-Phe-Leu-Gln-His-Ile-Ile-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Phe-NH2)。

4.如权利要求1-3中任意一项所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有广谱抗微生物活性和抗生物被膜活性。

5.如权利要求1-3中任意一项所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽在治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病中的应用。

6.一种药物组合物，其特征在于，含有如权利要求1-3中任意一项所述的抗菌肽。

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