CN114634553B - 阳离子肽c9及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及阳离子肽C9及其应用。该阳离子肽C9氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的阳离子肽C9具有较好的体外抑菌活性、抗生物被膜形成能力和不易产生耐药等特点，通过破坏细胞膜结构，增加膜的通透性和去极化水平以及扰乱膜的流动性，致使细菌无法完成必要的生物学过程而死亡，对体内抗感染治疗表现出一定的治疗潜力。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及阳离子肽C9及其应用。
背景技术
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)属于凝固酶阴性葡萄球菌，是定植于人体皮肤和黏膜表面的正常菌群。然而，在机体免疫功能低下或通过粘附于留置静脉导管、人工心脏瓣膜、人工关节等医疗移植物，转移至机体其它部位，可引起细菌性心内膜炎、新生儿败血症和假体周围感染，已成为医院获得性感染的重要病原体之一。
长期以来，抗生素在预防和治疗疾病方面发挥着重要作用，然而随着临床上广谱青霉素、氨基糖甙类及大环内酯类等抗生素的广泛使用，使得表皮葡萄球菌耐药菌株日益增多，甚至出现多重耐药现象。日益严重的抗生素耐药问题以及细菌致病性的出现，促使了一系列替代性抗菌化合物的研究，突出了对具有新作用模式新抗生素的需求。
抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)作为保护宿主免受入侵病原体感染的重要天然免疫分子，广泛存在于动植物中，具有相对分子量小、抗菌谱广且不易产生耐药等特点，成为抗生素的理想替代品。与传统抗生素单一作用靶点相比，抗菌肽通过作用于细胞膜或细胞内的多个非特异性靶点而显现出优势，并且对耐药细菌具有强大的活性。通常，抗菌肽具有较快的杀菌速度，能在几分钟内杀死细菌，但是，如果这些杀伤不是致命的，细菌在暴露于抗菌药物的情况下，能够迅速对这种压力环境做出反应，还因低蛋白酶稳定性、体内疗效以及药代动力学等因素限制了其临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经过改造的多肽，进一步优化其理化性质和抗菌活性，并提供其在制备抗菌药物中的应用。
本发明的第一个方面，提供一种阳离子肽C9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个方面，提供所述阳离子肽C9在制备抗细菌药物中的应用。
进一步的，所述抗菌指的是杀灭革兰氏阳性球菌。
更进一步的，所述革兰氏阳性球菌为表皮葡萄球菌。
本发明的第三个方面，提供所述阳离子肽C9联合抗生素在制备抗菌药物中的应用，所述抗生素选自万古霉素、环丙沙星和苯唑西林的一种或多种，所述抗菌指的是杀灭表皮葡萄球菌。
本发明的第四个方面，提供所述阳离子肽C9在制备治疗表皮葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。
本发明的第五个方面，提供所述阳离子肽C9联合抗生素在制备治疗表皮葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用，所述抗生素选自万古霉素、环丙沙星和苯唑西林的一种或多种。
本发明的第六个方面，提供一种药物，其活性成分为所述的阳离子肽C9；所述药物具有以下功能：
1)杀灭表皮葡萄球菌；
2)治疗表皮葡萄球菌感染所致疾病。
本发明的第七个方面，提供另一种药物，其活性成分为所述的多肽和抗生素，所述抗生素选自万古霉素、环丙沙星和苯唑西林的一种或多种；所述药物具有以下功能：
1)杀灭表皮葡萄球菌；
2)治疗表皮葡萄球菌感染所致疾病。
进一步的，所述药物还包含药学上可接受的盐。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的阳离子肽C9具有较好的体外抑菌活性、抗生物被膜形成能力和不易产生耐药等特点，通过破坏细胞膜结构，增加膜的通透性和去极化水平以及扰乱膜的流动性，致使细菌无法完成必要的生物学过程而死亡，对体内抗感染治疗表现出一定的治疗潜力。
附图说明
图1为C9对表皮葡萄球菌ATCC35984的时间杀伤曲线。
图2为耐药诱导实验；其中，前30代由1/2MIC浓度万古霉素与C9诱导菌株MIC，方框内后10代为无抗传代菌株。
图3为不同浓度C9对表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜形成的抑制作用。
图4为不同浓度C9对表皮葡萄球菌ATCC35984生长抑制情况。
图5为不同浓度C9对表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜的清除效果。
图6为激光共聚焦显微镜观察C9对表皮葡萄球菌ATCC35984生物被膜的影响，其中，A：生物被膜对照组；B：4×MIC(32μg/mL)浓度C9作用2h；标尺：20μm。
图7为激光共聚焦显微镜观察C9在表皮葡萄球菌ATCC35984中的分布，放大倍数：60×,数字有效放大3×。
图8为未经C9处理和经C9处理的表皮葡萄球菌ATCC35984的扫描电镜图，其中，对照组(A:10000×，C:20000×)；C9(4×MIC)处理组(B 10000×,D 20000×)。
图9为C9处理的表皮葡萄球菌ATCC35984的透射电镜图，其中，A：对照组；B：C9处理组；放大倍数(15000×)。
图10为C9对表皮葡萄球菌ATCC35984(A)和SE 5(B)的膜透化作用。
图11为C9对表皮葡萄球菌ATCC35984(A)和SE 5(B)的膜去极化作用。
图12为C9处理后的表皮葡萄球菌ATCC35984和SE 5的膜流动性检测。
图13为C9与细菌基因组DNA相互作用的凝胶阻滞分析。
图14为腹腔注射C9后小鼠体重变化。
图15为C9对小鼠肝、肾功能的影响。
图16为HE染色观察C9对小鼠肝、肾组织的影响。
图17为小鼠感染表皮葡萄球菌ATCC35984后的存活率。
图18为C9与万古霉素治疗后的存活率变化。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所应用的阳离子肽C9(或简称为C9)是通过对家蝇抗菌肽Cec4(41个氨基酸)进行改造和修饰得到的，由吉尔生化(上海)有限公司采用固相化学合成法合成，含有16个氨基酸，其C-端被酰胺化，实际分子量纯度(HPLC)＞97％，通过质谱确定肽的质量。所有的衍生肽用ddH2O溶解至10mg/mL，-20℃保存。其物理和化学参数如表1所示。
表1抗菌肽的氨基酸序列和理化性质
实施例1：C9体外生物学活性
1.实验菌株
34株表皮葡萄球菌临床分离样本，同一患者剔除重复样本。样本来源：痰液、血液、尿液等。临床分离菌株的收集和使用已获贵州医科大学机构审查委员会(IRB)批准，涉及人类参与者的研究已由贵州医科大学和伦理委员会隶属审查和批准。细菌的鉴定与药敏试验均采用法国生物梅里埃VITEK-2全自动微生物分析仪进行。表皮葡萄球菌ATCC35984为生物被膜形成阳性菌株，以上菌株由贵州医科大学病原生物学实验室保存。
2、方法
2.1最小抑菌浓度(MIC)测定
1)菌体的制备：取冻存于-20℃的细菌，划线接种于LB固体培养基中培养，挑取单菌落接种于MH液体培养基，37℃220rpm，过夜培养至对数期，再以1:100的比例转接至新鲜MH培养基，培养至对数生长期，取1mL菌液调整为0.5麦氏单位，再稀释至1×106CFU/mL。
2)药敏板制备：96孔板中每孔加入100μL MH培养基，并在每排的最后一孔中加入100μL不同浓度的C9与临床常规抗生素，混匀后吸取100μL溶液依次向前稀释。
3)菌体的接种：实验组每孔加入100μL菌悬液并混匀，以只加等体积的MH培养基和菌悬液作为空白对照和生长对照，将孔板放入37℃恒温箱培养18-20h。
4)结果判定：MIC被确定为肉眼可见抑制细菌生长的最小药物浓度。
2.2时间杀菌动力学
根据C9的最小抑菌浓度，选取表皮葡萄球菌ATCC35984为指示菌株，取对数生长期表皮葡萄球菌，用MH培养基将其稀释至1×106CFU/mL的菌悬液，将100μL菌悬液分别与等体积的阳离子肽C9溶液混合(使其终浓度为1/2×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC)，同时以PBS和万古霉素(1×MIC)为空白对照(Control)和阳性对照(Van)。混匀后立即置于37℃，220rpm恒温摇床培养，分别于0、20、40、60、120、240、360、480min时取样，并用PBS连续稀释至一定倍数。取稀释后的100μL菌悬液涂布于TSA平板上，37℃培养24h后进行菌落计数，以时间为横坐标，菌落数为纵坐标绘制杀菌曲线，试验重复3次。
2.3稳定性检测
取对数生长期表皮葡萄球菌，用MH肉汤制备浓度为1×106CFU/mL的菌悬液，并以96孔板制备不同浓度的C9肽浓度(终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL)。
1)盐离子和血清稳定性：加入不同浓度的盐离子和血清，使其终浓度分别为：NaCl(150mM)、KCl(4.5mM)、CaCl2(2.5mM)和血清(10％)。以不加盐离子与血清的为对照组，37℃培养箱孵育18-20h，记录MIC值。
2)胰蛋白酶稳定性：将阳离子肽C9与胰蛋白酶(1mg/mL)在37℃酶解1h，然后60℃水浴10min消除酶活性，以未经胰蛋白酶处理的C9肽溶液作为对照，随后进行抑菌活性检测，37℃培养箱孵育18-20h，记录MIC值。
2.4棋盘稀释法药敏试验
在测得阳离子肽C9和抗生素MIC值的基础上，取50μL C9肽溶液与50μL MH肉汤沿96孔板横坐标倍比稀释6个梯度(方向：由左到右)；再取50μL不同浓度的抗生素沿96孔板纵坐标分别添加至各孔(方向：由上到下)；每孔加入100μL浓度为1×106CFU/mL的菌悬液后，其总体积为200μL，阳离子肽C9和抗生素的最高浓度孔为2×MIC，设两组对照：一组为200μL培养液；另一组为200μL菌液，37℃培养24h后，MICs记录为抑制可见生长的药物的最低浓度。评判标准：分数抑制浓度指数(FICI)按以下公式计算：FICI＝MICA(组合)/MICA(单独)+MICB(组合)/MICB(单独)，FICI的最小值判断如下：FICI≤0.5表示协同作用；0.5<FICI≤4表示相加作用；FICI>4表示拮抗作用。
1.5耐药诱导实验
选择表皮葡萄球菌ATCC 35984作为亲代，分别用C9和万古霉素检测表皮葡萄球菌经药物连续诱导后诱导产生耐药性的情况，具体步骤如下：
1)取对数期表皮葡萄球菌，用MH肉汤制备1×106CFU/mL的菌悬液，按照前述方法测定C9和万古霉素对应的MIC值。
2)取微量暴露于0.5×MIC浓度的菌液，转接至TSB液体培养基中使其重新生长达到对数期，并定义为C1代。
3)随后分别用对应的药物重新进行MIC值测定，重复上述步骤至30代，记录每一代细菌的MIC值变化，并与亲代作比较，观察细菌对两种药物的耐药性变化。
3、结果
3.1药物敏感性检测
为检测现有临床菌株的耐药性，选取了几种抗生素进行敏感性检测，结果见表2：现有的34株临床表皮葡萄球菌中有28株对甲氧西林耐药，6株为甲氧西林敏感菌株，对万古霉素敏感，且C9的最小抑菌浓度均为8μg/mL。
表2表皮葡萄球菌菌株信息与C9的MIC值
3.2时间杀菌曲线
为检测C9对表皮葡萄球菌的杀菌速度，进行了时间杀伤动力学实验。万古霉素及四种浓度C9对表皮葡萄球菌的杀菌曲线如图1所示：C9具有比阳性对照万古霉素更快的杀菌速度，1/2×MIC浓度下前4h发挥抑菌作用，使菌落数降低2.34Log10 CFU/mL左右，而后恢复生长。1×MIC至4×MIC浓度时在20min内分别使菌落数降低2.04Log10 CFU/mL、2.59Log10CFU/mL、3.19Log10CFU/mL，其杀菌效果呈现剂量依赖性，分别能在6h、4h和1h内达到杀菌目的。而阳性对照万古霉素则在2h后才发挥杀菌效果，即使延长孵育时间至8h也只能使菌落数减少2.62Log10 CFU/mL检测时间内未能完全清除。
3.3C9稳定性检测
C9的稳定性检测主要从阳离子、酶、血清存在下对其抑菌活性的影响进行的。在生理浓度的盐离子影响下，C9对表皮葡萄球菌抑菌活性变化如表3所示，一价阳离子Na+和二价阳离子Ca2+使C9的抑菌活性降低了2倍，但一价K+未影响其活性。为了探究酶对C9抑菌活性的影响，选取胰蛋白酶在其最适反应温度下反应1h后进行抑菌测定，结果显示C9受胰蛋白酶降解作用，其抑菌活性丧失(MIC>128μg/mL)。肽经10％血清处理C9活性未发生变化。
表3盐离子、血清和胰蛋白酶对C9抑菌活性的影响
3.4联合药敏试验
联合药敏试验检测C9与临床抗生素联合使用的效果，结果如表4所示：C9与万古霉素、环丙沙星和苯唑西林联合使用时FIC指数在0.625-1之间，两者抗菌活性至少提升了两倍，呈现相加作用，未发现与几种抗生素的协同作用与拮抗作用。
表4C9与临床抗生素的协同作用分析
3.5耐药性检测
在抗菌药物长期运用的情况下，细菌可以通过突变获得耐药性，为了验证长期使用C9是否会形成耐药，用亚致死浓度(1/2×MIC)的C9和万古霉素长期处理表皮葡萄球菌，观察耐药形成情况。结果如图2所示，C9体外诱导30代其MIC值在第15代时上升了两倍，对照组的万古霉素MIC值在第9代时较亲代上升了两倍。对第30代诱导菌株进行无抗传代，C9诱导组在第二代MIC值下降两倍，敏感性恢复至亲代。
实施例2：C9对表皮葡萄球菌生物被膜的影响
1.实验菌株
表皮葡萄球菌ATCC 35984和临床分离株(SE5)。
2.方法
2.1生物被膜形成能力
取对数生长期表皮葡萄球菌，用TSB培养基制备浓度为2×106CFU/mL的菌悬液。在96孔板各孔加入200μL菌液，TSB培养基作阴性对照，每株菌设置3个复孔。37℃静止培养24h后，取出96孔板，弃去非贴壁细菌和培养物，用无菌PBS洗涤培养孔三次，板子置于60℃培养箱干燥固定30min，固定完毕后向孔中加入200μL 0.1％结晶紫(CV)，室温摇床染色20min；弃去结晶紫溶液，用无菌PBS轻轻洗涤3次，再向每孔加入200μL 95％乙醇，室温摇床溶解20min。
在酶标仪上读取OD570值及生物被膜形成能力判定：阴性对照OD值的均值±标准差定义为ODc，基于该OD值，将菌株分为以下四组：待测菌株的OD值与ODc比较，OD570≤ODc为生物被膜形成阴性(-)；ODc＜OD570≤2×ODc为弱生物被膜形成(+)；2×ODc＜OD570≤4×ODc为中等生物被膜形成(++)；4×ODc＜OD570为强生物被膜形成(+++)。
2.2生物膜抑制
检测不同浓度的C9对表皮葡萄球菌ATCC 35984和临床分离株(SE5)的生物膜形成能力的影响。
取对数期表皮葡萄球菌，用TSB液体培养基制备浓度为2×106CFU/mL浓度的菌悬液。以每孔100μL体系加入96孔板中，然后分别加入100μL不同浓度的阳离子肽C9(中浓度为0.4×MIC-0.9×MIC)，37℃恒温箱培养24h。通过酶标仪测定OD600检测表皮葡萄球菌生长情况，然后根据上述方法采用结晶紫染色法对形成的生物被膜进行检测，并计算抑制率。
2.3生物膜的清除
检测不同浓度的对表皮葡萄球菌ATCC 35984和临床分离株的成熟生物被膜的清除作用，取对数期表皮葡萄球菌，用TSB液体培养基制备浓度为2×106CFU/mL浓度的菌悬液，以每孔200μL体系加入96孔板中，以不含菌液的TSB培养液为空白对照，37℃恒温箱培养48h。取出孔板后去除培养基及游离菌，用无菌PBS洗涤2-3遍，加入200μL不同浓度的阳离子肽C9，37℃恒温箱培养24h。根据上述方法采用结晶紫染色法对形成的生物被膜进行检测，并计算清除率。
2.4共聚焦激光扫描显微镜分析
选取表皮葡萄球菌ATCC35984为指示菌株，以无菌的多聚赖氨酸处理的盖玻片为载体，参照上一步的方法培养生物被膜。在对照组加入无菌TSB培养基，实验组加入浓度为32μg/mL的C9溶液，孵育2h后，用PBS清洗3次。加入1mM的SYTO9(终浓度5μM)和10mM PI(终浓度5μM)，避光孵育15分钟，PBS清洗3次，除去未结合荧光染料。取出盖玻片倒置于含有20μL抗荧光衰减剂的无菌载玻片上，封片。共聚焦激光扫描显微镜观察(激发波长488nm发射波长495nm)。
3.结果
为了检测C9对表皮葡萄球菌生物被膜的形成以及清除作用，从临床菌株中选择了生物被膜形成能力比较强的SE5和标准菌株ATCC 35984，采用结晶紫染色法进行抑制和清除能力的测定。
3.1C9对表皮葡萄球菌生物被膜形成能力的影响
在生物被膜形成的抑制试验中，将不同浓度的C9与表皮葡萄球菌共同孵育24h后，结晶紫染色法检测生物被膜形成量，结果如图3所示：与对照组相比，生物被膜的形成量转化为百分比，发现0.4×MIC(3.2μg/mL)以上的C9能抑制26.7％表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜的形成(P<0.05)，对生物膜形成能力较强的SE5，0.5×MIC(4μg/mL)以上浓度能抑制27％左右生物膜形成(P<0.05)，当作用浓度达到0.8×MIC以上浓度时，能使两菌株的生物被膜形成量减少90％左右(P<0.001)。同时，不同浓度C9处理后的表皮葡萄球菌生长情况结果(图4)表明，菌株的生长受到抑制。
3.2C9对表皮葡萄球菌成熟生物被膜的清除效果检测
在C9对生物被膜的清除实验中，使用(1/2-8)×MIC浓度的C9对已形成的成熟生物被膜处理24h，结晶紫染色结果如图5所示：C9对48h形成的成熟生物被膜有清除作用，在2×MIC浓度以上对表皮葡萄球菌ATCC35984生物被膜的清除效果与对照组相比差异极显著(P<0.01)，在最高浓度下，可清除64％左右的生物被膜。对于SE 5形成的生物膜，1×MIC处理24h后，20％-45％左右的生物被膜被破坏掉，且与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)
3.3通过SYTO9/PI双染法评估C9处理前后表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜中细胞的生存能力，并采用激光共聚焦扫描显微镜进行观察，如图6所示，激光共聚焦显微镜观察C9对表皮葡萄球菌生物被膜其中SYTO9表征活菌，呈绿色荧光，PI表征死菌，呈红色荧光。对照组中大量生物被膜细菌分布密集并聚集成团块状，且具有较高的存活率(>％)。经C9(4×MIC)处理2h后，生物膜结构被破坏，膜内细菌死亡或受损，大部分细菌被染成红色，细菌分布相对稀疏，表明C9处理可通过破坏生物被膜，有效降低细菌的存活率，并显著减少生物膜的形成。
实施例3：C9的杀菌机制研究
1.实验菌株
表皮葡萄球菌ATCC 35984和临床分离株(SE5)。
2.实验方法
2.1显微镜观察形态变化
1)激光共聚焦显微镜
为了验证C9是否可以通过静电作用与表皮葡萄球菌细胞膜进行结合，采用激光共聚焦显微镜观察FITC-C9对表皮葡萄球菌的标记情况。
取对数期表皮葡萄球菌，用PBS制备1mL浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，加入FITC-C9(1×MIC)肽溶液后于在37℃培养箱孵育1h。孵育结束后，4000rpm离心5min收集菌体，并用PBS洗涤3次，去除未结合的肽，最后重悬于500μL PBS中，取6μL菌悬液制片并滴加20μL抗荧光衰减封片剂，加盖玻片并封片，静置完毕后用激光共聚焦显微镜进行观察。
2)扫描电子显微镜
通过电子显微镜可以直接观察C9处理后，表皮葡萄球菌的形态及结构变化，以表皮葡萄球菌ATCC35984为对象，具体方法如下：
用PBS制备浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，以4×MIC的阳离子肽C9溶液为实验组、PBS为对照组，于37℃培养箱孵育2h，4000rpm离心10min，收集菌体，并用PBS离心洗涤3次，将收集的菌体沉淀用1mL 2.5％戊二醛4℃固定过夜。固定后的样品用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇/叔丁醇混合物梯度脱水，每次15min，将样品放入临界点干燥仪内进行干燥，离子喷溅仪喷金30s后，用扫描电子显微镜(SU8100，HITACHI)观察采图。
3)透射电子显微镜
按照扫描电镜方法收集样本并固定，将已固定样品用PBS缓冲液冲洗3次，4000rmp离心10min，使用1％锇酸固定液固定2h，固定后PBS离心洗涤3次。然后分别使用30％-50％-70％-80％-95％-100％-100％乙醇将细菌梯度脱水，每次20min，100％丙酮两次，每次15min。采用Epon 812环氧树脂包埋，37℃、45℃、65℃温箱固化，每级温度24h。最后用Ultra45℃超薄切片机切片60nm-80nm，半薄切片定位醋酸铀饱和酒精溶液避光染色，透射电子显微镜(HT7800，HITACHI)下观察，采集图像分析。
2.2细胞内膜通透性
通过碘化丙啶(PI)进入细胞与其结合DNA的荧光强度变化检C9对细菌细胞内膜通透性的影响。
取对数期表皮葡萄球菌，用PBS重悬为1×108CFU/mL的菌悬液。在调好的菌液中加入一定体积初始浓度为1.5mM的PI溶液，使其终浓度为10μM。取190μL细菌悬液加入到96孔黑色酶标板的各孔中。使用多功能酶标仪在535nm的激发波长和610nm的发射波长处监测PI的荧光4min，直至基线稳定。向含有染料和细菌悬液的孔中加入10μL C9肽溶液(终浓度为4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL和32μg/mL)，以等体积的PBS作为空白对照，再连续监测25min。
2.3细胞膜去极化
使用细胞膜电势敏感的荧光染料diSC3-5检测C9对细胞内膜的去极化作用。
取对数生长期菌液，用5mM HEPES缓冲溶液(含有20mM葡萄糖，pH7.4)洗涤三次，最后用HEPES制备1×108CFU/mL，在细菌悬液中加入DiSC3-5，使其终浓度为0.4μM，室温避光震荡孵育1h，然后在细胞悬液中加入KCl，使其终浓度为0.1M，以平衡细胞质和外部的K+浓度，室温避光孵育15-30min。取50μL细菌悬液加入到96孔黑色酶标板的各孔中，在激发和发射波长分别为622nm和670nm的条件下使用多功能酶标仪记录荧光20min，直到基线稳定。实验组加入50μL连续稀释的C9溶液，以等体积的Triton X-100(1％)和PBS作阳性对照和阴性对照，再连续记录荧光40min。
2.4细胞膜流动性
取对数生长期的表皮葡萄球菌，用营养肉汤培养基制备浓度为1.5×106CFU/mL浓度的菌悬液。将Laurdan染料在室温避光环境中加入菌悬液中，使其终浓度为10μM；取100μL染料与细菌的混合物加入含有一定肽浓度的黑色96孔酶标板中，将50mM的苯甲醇作为膜流化剂用作阳性对照，混匀后避光孵育1小时。孵育结束后，使用多功能酶标仪记录荧光强度，激发波长为350nm，发射波长为435nm和490nm。GP的计算公式如下：GP＝(I435-I490)/(I435+I490)。其中I435和I490分别为波长435nm和490nm处的荧光强度。
2.5DNA凝胶迁移试验
取对数期的表皮葡萄球菌，按照细菌基因组DNA试剂盒说明书提取基因组DNA，所获得的DNA溶液用紫外分光计检测其核酸浓度和纯度，所提取的细菌基因组DNA纯度均达到实验的要求：1.7≤OD260nm/OD280nm≤1.9。取5μL基因组DNA溶液与不同浓度(0、8、16、32、64μg/mL)的抗菌肽等体积混合，置于37℃培养箱中作用1h。反应结束后分别加入2μL的6×loading buffer，将混合溶液依次加入含有荧光染料Gelred的1％琼脂糖电泳点样孔中，电泳(120V，30min)后用凝胶成像系统观察DNA的迁移情况并拍照。
3.结果
3.1显微镜观察
(1)激光共聚焦显微镜
通过激光共聚焦显微镜放大倍数400×下对FITC-C9处理后的表皮葡萄球菌进行观察，结果如图7所示。
(2)扫描电镜
为了可视化C9对表皮葡萄球菌细胞膜的杀伤作用，通过扫描电镜对C9处理2h后的菌体进行观察，结果如图8所示，未经C9处理的空白对照组菌体(图8A和8C)形态完整，表面光滑且结构致密，相比而言，经4×MIC浓度的C9处理后的表皮葡萄球菌细胞显示出明显的损伤，处理2h的菌体表面结构发生溶解变得疏松，且完整性遭到破坏，并出现穿孔(黑色箭头)、气泡或小突起(白色箭头)及黏丝现象(图8B和8D)。
(3)透射电镜
用透射电镜观察了C9对细菌细胞膜和内部结构的影响，结果如图9：未经C9处理的对照组菌体形态饱满，细胞膜层次分明且结构清晰而完整，内部结构致密，而C9处理组菌体发生了显著的形态学变化、细胞内变化和细胞膜破裂。C9作用2h后可观察菌体形态不规则，细胞膜结构不清晰，出现溶解破裂现象(白色箭头)，细胞内容物以团块形式释放(黑色箭头)。
3.2细胞膜通透性
碘化丙啶(PI)能够通过破损的细胞膜进入细胞后与细菌DNA结合导致荧光强度增加。检测结果如图10所示：对照组加入PBS前后以及连续25min的监测中均未观察到荧光强度的明显变化(P>0.05)，低浓度的C9(4μg/mL)可引起荧光强度的明显增加(P<0.05)，当浓度达到8μg/mL以上时，随着C9的加入PI荧光强度变化呈现出剂量与时间依赖性，且处理25min后的荧光强度与刚加入C9时相比具有显著差异(P<0.001)。说明C9能够快速破坏细菌细胞膜，引起表皮葡萄球菌通透性的增加。
3.3细胞膜去极化
膜电位敏感染料DiSC3(5)是一种插入细胞膜的自猝灭染料，在去极化时被释放，导致荧光信号增加，用于评估细菌的细胞膜去极化程度。结果如图11所示：荧光监测20min测定，未见明显波动，随后加入不同浓度C9，5min后与空白对照组相比，4μg/mL到128μg/mL的C9处理后均可观察到荧光强度的增加，其中4-8μg/mL曲线与空白组重合，而后的40min的荧光监测结果表现出相对缓和的趋势，说明C9能使表皮葡萄球菌的细胞膜发生去极化，且膜去极化程度呈现剂量依赖性。
3.4细胞膜流动性
通过使用Laurda检测C9对表皮葡萄球菌膜流动性的影响，并使用Laurdan广义极化(GP)度量来量化:GP＝(I440-I490)/(I440+I490)，从-1(最流动和无序)到+1(最刚性和有序)，检测结果如图12显示，在浓度低于16或32μg/mL时，膜紊乱程度与浓度成正比，膜流动性增大，高于该浓度后呈现增加的趋势，但与对照组相比，差异有统计学意义。
3.5DNA凝胶迁移实验
抗菌肽与DNA的结合可使DNA的相对分子质量和所带电荷发生改变，导致其电泳迁移率相比游离的DNA片段迁移有一定的滞后现象，进行DNA凝胶阻滞试验以评估C9与表皮葡萄球菌基因组DNA的结合活性。提取表皮葡萄球菌基因组DNA，并与不同浓度的C9(0×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC)混合，1％琼脂糖电泳结果如图13所示：随着C9浓度的增加，DNA的电泳迁移逐渐减少，4×MIC浓度的C9处理后，条带弥散分布于泳道，浓度达到8×MIC时，基因组DNA无法迁移到凝胶中。结果表明，C9能与表皮葡萄球菌基因组DNA结合，说明C9可能通过结合菌体DNA，发挥杀菌作用。
实施例4：C9的急性毒性与体内疗效
1.实验菌株
表皮葡萄球菌ATCC 35984。
2.实验方法
2.1C9对小鼠的LD50检测
为了评估单剂量C9治疗在BALB/c小鼠体内的急性毒性，采用腹腔注射方式给予两倍浓度梯度的C9测定其在BALB/c体内LD50(半数致死剂量)值，以确定安全剂量：
将20只6-8周BALB/c雌鼠随机分为4组(n＝5)，实验组小鼠腹腔注射不同剂量为的C9肽溶液(32mg/kg、64mg/kg、128mg/kg，0.2mL/只)，空白对照组小鼠给予同等体积的生理盐水。注射后密切观察各组小鼠的生存及活动状态，连续观察7天。
2.2C9对小鼠肝肾相关生化指标的影响
将10只6-8周BALB/c雌鼠随机分为2组(n＝5)，选取上一实验的中剂量组C9(64mg/kg)和等体积的生理盐水进行腹腔注射，观察C9对小鼠肝肾组织的影响。腹腔注射24h后，通过无菌操作经眼球取血的方式将血液缓缓注入1.5mL无菌Ep管中，37℃水浴30min待血清析出，同时处死小鼠，留取肝肾组织。水浴结束后将小鼠的血液样本以3000rpm离心5min以获得血清，并且通过全自动血液生化分析仪测定小鼠血清的部分生化参数。检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)水平以评估小鼠的肝功能，测定血肌酐(Cr)和尿素(UREA)以评估肾功能。
2.3对小鼠肝、肾组织进行HE染色并行组织病理学观察
立即将留取的肝和肾组织用2.5％戊二醛固定过夜，用石蜡包埋。将组织切成4～6mm厚的切片，采用苏木精—伊红染色，再利用3D全景扫描仪扫描切片(扫描仪型号：3DHISTECH Pannoramic250，MADE IN Hungary)，扫描后进行组织病理学观察，截取切片中主要的病变部位并进行描述。
HE染色具体步骤如下：
①取材和固定：小鼠安乐死后，立即留取部分肝脏、肾脏，分别置于2.5％戊二醛缓冲液中固定。
②冲洗、脱水、透明：用水冲洗固定的组织，将组织样本依次经70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇(I)、95％乙醇(II)、无水乙醇(I)、无水乙醇(II)处理，每次1～2h，脱去组织中的水份。用二甲苯为透明剂，将脱水后的样本在无水乙醇与二甲苯混合液浸泡15min，然后依次放入二甲苯(I)、二甲苯(II)，二每次0.5～2h，务必使组织达到透明为止，注意在使用透明剂时要随时盖紧盖子，防止空气中的水分进入。
③浸蜡、包埋：将已透明的组织依次放入熔化的石蜡杯(I)、蜡杯(II)、蜡杯(III)中。待石蜡完全浸入组织块后包埋于熔化的石蜡中，待其冷却凝固成块。
④切片、贴片：在切片机上将蜡块切成4～6mm厚的薄片。将切下的薄片放到加热的水中烫平，再平铺于载玻片上，放置于45℃恒温箱中烘干。
⑤HE染色：
1)脱蜡：将切片放入二甲苯(I)和二甲苯(II)中，各为10min，以溶去切片上的石蜡。
2)覆水：将切片依次放入无水乙醇(I)、无水乙醇(II)，洗脱掉苯，90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇依次浸润洗脱，各停留2～3min，然后用蒸馏水冲洗3次，每次2min。
3)染色：将蒸馏水洗涤后的切片用苏木精染色5min，然后用自来水洗去切片上残余的染液。然后用1％盐酸乙醇分化30s，提插数下。再放入双蒸水浸泡约15min，接着放入伊红液2min，用蒸馏水洗涤30s。
4)脱水：将以上所得切片依次放入95％乙醇(I)、95％乙醇(Ⅱ)、无水乙醇(I)、无水乙醇(II)中各1min。
5)透明：切片放入1：1的无水乙醇：二甲苯中1min，再放入二甲苯(I)、二甲苯(II)各1min。
6)封固：最后将切片从二甲苯(II)中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴加中性树脂，然后用镊子加盖盖玻片。
2.4小鼠表皮葡萄球菌感染模型建立
通过腹腔注射表皮葡萄球菌ATCC35984建立小鼠急性细菌感染模型。
取对数期表皮葡萄球菌，将菌悬液调制每200μL含有5×108、1×109和3×109CFU的菌量。将20只6-8周雌性BalB/C小鼠随机分为4组，每组5只，其中3组腹腔接种200μL不同剂量(5×108、1×109、3×109/只)的细菌，一组腹腔注射等体积PBS作为对照。连续监测7天小鼠生存情况。
2.5C9对表皮葡萄球菌感染模型的治疗效果
取对数期表皮葡萄球菌，将菌悬液调制每200μL含有1×109CFU的菌量。将20只6-8周雌性BABL/C小鼠随机分为4组，每组5只，以1×109CFU/只的菌量腹腔注射感染小鼠。感染2h后，阴性对照组小鼠用等体积生理盐水注射处理，其余3组分别经腹腔注射C9(10mg/kg)、尾静脉注射C9(10mg/kg)和尾静脉注射万古霉素(10mg/kg)进行治疗。记录小鼠7天内的死亡情况。
3.结果
3.1C9对小鼠的毒性检测
为了评估单剂量C9治疗对小鼠的急性毒性，对注射后对小鼠进行7天的生存率、体重和行为监测，结果如图14所示，腹腔注射32-128mg/kg剂量的C9后，对照组与32mg/kg仅64mg/kg与128mg/kg组小鼠出现聚堆、呼吸急促，静伏不动，症状于2h后消失，随后的7天监测中，对照组与C9治疗组均未见小鼠死亡(数据未显示)，体重变化与对照组无明显差异。
3.2C9对小鼠的肝肾毒性检测
为了评估C9对正常小鼠的肝肾毒性，采取中剂量C9(64mg/kg)的小鼠的血液进行生化分析，测定肝功能和肾功能相关生化指标水平，并观察小鼠肝、肾组织的病理学变化。结果如图15所示，除血尿素UREA与对照组相比有显著差异外(P<0.05)，两组小鼠血清的ALT、AST、ALB和Cr值之间均无显著差异(P>0.05)。此外，如图16所示，对照组和C9处理组小鼠的肝小叶肝窦结构清晰，组织中可见部分肝细胞颗粒变性，胞质疏松淡染(箭头1和箭头2)，未观察到明显的组织病理学变化；对照组肾小球形态结构正常，肾小管上皮细胞偶见水肿(箭头3)，胞质疏松淡染，C9处理组的肾间质可见大量静脉淤血(箭头4)，肾小球肾小管结构无明显异常，未见其它炎症变化。因此，注射中剂量C9(64mg/kg)对小鼠急性毒性较小。
3.3C9对小鼠腹腔感染模型的治疗效果
通过腹腔注射表皮葡萄球菌建立小鼠感染模型，并选取死亡率为60％-80％的剂量感染小鼠后进行治疗，初步评估C9在体内治疗效果。小鼠感染表皮葡萄球菌后出现呼吸急促、活动力下降、毛发耸立无光泽和聚堆现象，死亡结果如图17所示，中高剂量组(3×109CFU)小鼠在注射后4h开始出现死亡，24h死亡率为100％，中剂量组(1×109CFU)和低剂量组(5×108CFU)注射后48h的死亡率分别为60％和20％，存活小鼠伴有行动迟缓及体重减轻，2至3天后开始逐渐恢复正常活动状态，连续监测剩余小鼠的生存状况状态7天，未见小鼠死亡。
以1×109CFU/只的剂量感染2h后，进行药物治疗评估C9的治疗效果，存活率结果如图18所示，未治疗的模型组24h存活率为40％，经腹腔和尾静脉注射C9(10mg/kg)治疗后，小鼠7天存活率分别60％和80％，与对照组相比，C9治疗组小鼠在7天观时间内活动状态较好，尾静脉注射10mg/kg万古霉素，24h存活率为80％，48h出现死亡,在该感染模型中未见明显治疗效果。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 阳离子肽C9及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Trp Arg Val Gly Trp Asn Trp Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln Asn
1 5 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Ala Ile Gly Val Ala Gln Gln Ala Ala
20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Leu Lys Gly Lys
35 40
Claims (1)
1.一种阳离子肽C9在制备抗表皮葡萄球菌的药物中的应用，其特征在于，所述阳离子肽C9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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| Novel Cecropin-4 Derived Peptides againstMethicillin-Resistant Staphylococcus aureus;Jian Peng et al;《Antibiotics》;第10卷(第36期);第5页第2-4段、第2.2-2.4节、图1-2 * |
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Legal Events
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