CN104357445A - 一种用于抑制和治疗细粒棘球蚴病的干扰rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于抑制和治疗细粒棘球蚴病的干扰RNA，其靶向细粒棘球绦虫的GRP78基因，所述干扰RNA的靶序列为CCTCGTGGTTTACCTCAAA。本发明提供的siRNA-GRP78，通过电穿孔方法转染细粒棘球蚴原头节，siRNA-GRP78具有破坏囊型包虫原头节结构，诱导原头节凋亡，降低原头节的活力，从而抑制和杀伤细粒棘球蚴原头节。

Description

一种用于抑制和治疗细粒棘球蚴病的干扰RNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种干扰RNA及其用来抑制和治疗细粒棘球蚴病的应用，属于生物医药工程领域。

背景技术

棘球蚴病(echinococcosis)俗称包虫病(hydatid disease)，是棘球蚴绦虫的中绦期幼虫寄生于人及其他一些动物体内所引起的一种严重危害人体健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。棘球绦虫的种类较多，目前在我国主要有细粒棘球蚴病(囊型包虫病cystic echinococcosis，CE)和多房棘球蚴病(泡型包虫病alveolar echinococcosis，AE)两种，其分别由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，E.g)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，E.m)寄生于人及某些动物体内所致。细粒棘球蚴病呈全球性分布，在我国主要流行于新疆、青海、内蒙古、西藏等畜牧业发达的省区。

细粒棘球蚴可寄生于人体任何部位，其中肝脏最为常见(50-70％)，其次为肺脏(占20％～30％)，在脾，肾，骨，脑及其他器官中较少见到。目前，对于肝细粒棘球蚴病的治疗，仍然以外科手术为主，药物治疗为辅。对于手术治疗方式而言，一个严重的缺陷是穿刺内囊摘除过程中易引起内囊里的原头节外溢，复发率较高。即使近些年出现的肝包虫外膜内外囊完整摘除术可完整摘除肝包虫外囊，降低包虫病的复发率，但是当包虫囊肿体积较大或紧贴重要脏器或管道(肝门或胆管)时，则需要选择开放式外膜内完整摘除术。此种术式有两种情况：一是开放式外膜内外囊完全切除术，二是开放式外膜内外囊次全切除术，这两种情况都可能有头节的外漏和残留，增加术后复发的风险。因此本领域近年来已经开始尝试使用药物制剂来降低复发率。

迄今为止，国内外已经在体外、动物及临床上对95％乙醇，高渗盐水，5％的福尔马林，硝酸银及阿苯达唑等药物及其联合作用效果方面进行了广泛的研究，它们虽然可以起到一定的疗效，但都不尽理想且副作用较大：95％的乙醇可导致机体出现严重的肝胆并发症，20％的高渗盐水会使病人出现严重的肝胆并发症，10％H₂O₂会致使机体出现空气栓赛甚至会发生过敏性休克，福尔马林使用后会产生严重的肝胆并发症，20％的硝酸银可致使病人出现术中休克，心血管功能衰竭，肾功能衰竭，肝功能不全等副作用，术后发生呼吸困难，紫绀，低血压等一系列副作用，阿苯达唑(ABZ)临床上病人使用后，肝酶水平会因此而上升，高浓度酸性和碱性溶液尽管能有效杀灭，但是无法在人体内应用，而低浓度的酸性和碱性溶液杀灭效果不理想。

根据制药领域的认知，理想的局部化疗药物应具有快速，完整的药物作用效果(没有局限性和副作用)，从这个角度来看，目前还没有发现理想的局部化疗药物。因此，寻找理想的局部辅助用药的化疗药物对于肝包虫病的治疗具有重要意义。

发明内容

申请人多年来致力于研究细粒棘球蚴病在细胞和基因层面的致病机理，发现在细粒棘球蚴病中细粒棘球蚴原头节存在GRP78蛋白(分子伴侣葡萄糖调节蛋白78，glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein，GRP78)的高表达，从而确定内质网应激反应参与细粒棘球蚴发病。基于该致病机理，申请人研究了通过抑制GRP78表达从而影响内质网应激机制来抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的生长，从而有效治疗细粒棘球蚴病。

基于上述，本发明首先公开了一种干扰RNA(可简称为siRNA或RNAi)，能够特异性的靶向细粒棘球绦虫的GRP78基因从而使其沉默从而特异性下调GRP78的表达，用于抑制和治疗细粒棘球蚴病，所述干扰RNA的靶序列为CCTCGTGGTTTACCTCAAA。

由于上述作用机制的存在，在另一面，本发明还公开了干扰RNA在制备治疗细粒棘球蚴病的药物中的应用，所述干扰RNA的靶序列CCTCGTGGTTTACCTCAAA。

具体到临床应用，可以将干扰RNA作为药物活性成分直接进入病灶来防治细粒棘球蚴病，例如在手术过程中注射的方式，通常的，干扰RNA通过浸泡或转染的方式进入细粒棘球绦虫，从而消灭其生长过程。

优选的，通过电穿孔转染的方法将干扰RNA对细粒棘球蚴原头节进行转染，上述电转方法是本领域技术人员所广泛了解的，例如通过电转仪进行。

考虑到实际使用的需要，本发明所涉及的药物还可以是将含有上述干扰RNA序列的病毒载体或质粒载体作为活性成分，这在分子生物学上是广泛可用的，即通过对载体进行酶切，然后将干扰RNA与酶切后的载体连接得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞中筛选出阳性克隆，上述操作为本领域的公知技术，例如在分子克隆实验指南教材中即记载了标准操作过程。

申请人进行的实验显示，本发明所公开的RNA干扰序列转染细粒棘球蚴原头节，siRNA-GRP78具有破坏细粒棘球蚴原头节结构，诱导原头节凋亡，降低原头节的活力，从而抑制和杀伤细粒棘球蚴原头节。

附图说明

图1细粒棘球蚴原头节(A：绵羊肝包虫；B：培养细粒棘球蚴原头节)

图2转染siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节形态的影响(A：空白组3d原头节；B：空白组5d原头节；C：对照组3d原头节；D：：对照组5d原头节；E：siRNA-GRP783d原头节；F：siRNA-GRP785d原头节)

图3转染siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节活力的影响

图4转染siRNA-GRP7824h对体外细粒棘球蚴原头节表面超微结构的影响(A：空白组原头节；B：对照组原头节；C，D：转染siRNA-GRP7824h原头节)

图5转染siRNA-GRP78不同时间对细粒棘球蚴原头节内Caspase-3酶活性的影响

图6转染siRNA-GRP78不同时间对细粒棘球蚴原头节内Caspase-12酶活性的影响

图7转染siRNA-GRP7848h后细粒棘球蚴原头节TUNEL检测(A：空白组原头节；B：对照组原头节；C，D：转染siRNA-GRP7848h原头节)

具体实施方式

为了说明本发明干扰RNA的效果，申请人进行了体外的细粒棘球蚴杀灭实验，具体的实验过程如下所述：

实验1：细粒棘球蚴原头节的采集和培养

取新鲜的自然感染囊性肝包虫病的绵羊肝脏，清洗羊肝表面多次至清洁，然后用75％酒精消毒，无菌条件下抽取含有原头节的囊液，于无菌瓶中。用PBS(PH＝7.2)洗濯原头节多次至澄清，用0.1％伊红染液做染色排斥反应，98％以上拒染。肉眼观察原头节呈白色细沙样均匀颗粒，活性好的原头节沉降速度较快，相反活性不好的或者已死亡的原头节沉降速度相对比较缓慢。倒置显微镜下观察原头节虫体呈凹陷型，散在密集分布，虫体呈椭圆形且其内部结构饱满、清晰完整，里面充满许多清亮而明显的钙颗粒。依据头节量的多少将原头节分装至大小不等的已添加10％小牛血清的RPMI 1640培养基的培养瓶中(100U/mL青霉素，链霉素100U/mL)，在37℃、5％CO₂恒温孵育箱内培养备用。

实验2：设计和合成干扰RNA序列片段

合成与鉴定siRNA-GRP78有效序列：根据GRP78基因序列(GenBank:M63605.1)，设计siRNA-GRP78的序列，由广州锐博生物公司合成小分子的siRNA-GRP78，并筛选得到本发明所用的siRNA(小分子干扰RNA)分子，靶序列为(siRNA反义链与靶序列碱基配对)：CCTCGTGGTTTACCTCAAA。

实验3：细粒棘球蚴原头节电穿孔方法转染siRNA-GRP78

实验分组：siRNAGRP78、空白组(未加siRNA进行转染)及对照组(非特异性siRNA)。

实验方法：设120μL体系，将在体外培养3天后的细粒棘球蚴原头节用磷酸盐缓冲液(PH7.2)清洗3次，按以上各组，将大约2000个原头节加入上述组的培养液中、电转缓冲液及所加siRNA(浓度设为5μmol/L)于电极杯中。然后用Amaxa 2型电转仪采用最优电转程序分别对细粒棘球蚴原头节进行转染。最后置37℃，5％CO₂孵育箱内培养。

实验4：siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节形态的影响

1)siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节光镜结构的影响

应用电穿孔方法将siRNA-GRP78转染囊型包虫原头节，处理不同时间，在倒置显微镜下仔细观察虫体的存活、运动、生长发育以及形态变化，将原头节悬液定量稀释后,取5uL均匀的混悬液用伊红染色,观察头节活力并计数，绘制原头节活力曲线，观察siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节生长的影响。

2)siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节超微结构的影响

应用电穿孔方法将siRNA-GRP78转染细粒棘球蚴原头节，处理不同时间，将原头节置于4℃3％戊二醛固定24h，乙醇梯度脱水后，将标本置于二氧化碳临界点干燥仪中干燥，在真空涂膜仪内喷金，扫描电镜观察原头节表面结构。

实验5：siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节凋亡的影响

Caspase-3活性检测：应用电穿孔方法将siRNA-GRP78转染细粒棘球蚴原头节，处理不同时间，用caspase-3试剂盒检测caspase-3活性。caspase-3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，从而可以通过测定吸光度来检测caspase-3的活性，依据底物被蛋白水解酶分解后的吸光度值而测定。在测得A405值和作出标准曲线的基础上，计算出样品中已生成的对硝基苯胺(ρNA)浓度。采用单因素方差分析对Caspase-3活性检测出来的数据进行统计学分析，组间两两比较采用SNK法。

TUNEL检测：应用电穿孔方法将siRNA-GRP78转染细粒棘球蚴原头节，处理不同时间，TUNEL法检测细胞凋亡。用甲醛固定，琼脂糖包埋原头节，将包埋原头节的琼脂糖块作为组织块进行石蜡包埋，切片，TUNEL染片。凋亡细胞的细胞核被TUNEL试剂染成棕黄色，正常细胞不着色。

Caspase-12蛋白表达：应用电穿孔方法将siRNA-GRP78转染囊型包虫原头节，处理不同时间，Western blot检测原头节内Caspase-12蛋白表达水平。提取原头节的总蛋白,SDS-PAGE分离蛋白样品，将蛋白质转移到NC膜上，NC膜用5％脱脂牛奶封闭，一抗孵育过夜，5％脱脂牛奶漂洗3次，辣根过氧化物酶标记的IgG室温孵育，PBS漂洗，ECL滴加到NC膜上，胶片曝光，X光冲片机冲洗胶片。实验结果如下所示：

肉眼观察原头节呈细白沙样均匀颗粒，活性好的原头节沉降速率快，活性不好的或者死亡的原头节沉降速率相对比较慢。倒置显微镜下观察原头节虫体呈内陷型，散在密布，虫体结构饱满，呈椭圆形，结构清晰完整，钙颗粒清亮而明显。有些外翻型的原头节，可见到背腹左右四个吸盘，少量原头节的口器仍然吸附在生发层表面(图1)。

倒置显微镜下观察，电转siRNA-GRP7872h后，原头节活动度逐渐减弱，并出现虫体边缘不规整，且有大量空泡产生，钙颗粒显著减少，原头节顶突上的小钩排列紊乱，部分脱落，吸盘开始变型，120h后，头节活动度较正常及对照组明显减弱，活力减弱的原头节虫体开始皱缩、体积变小且边缘空泡量增多，伊红染液做染色排斥实验，可见大部分头节内部结构破坏并被红色着染。空白组和非特异性siRNA组原头节有的顶突凸出，有的凹陷，头节的体积也比实验组大，存活良好，可见活动的原头节(图2)。

siRNA-GRP78转染细粒棘球蚴原头节，经倒置显微镜下观察，绘制活力曲线，从图中亦可以看出，随着转染时间的延长，siRNA-GRP78对原头节活力的抑制率增加，证实siRNA-GRP78体外作用于细粒棘球蚴原头节，有抑制原头节生长的作用(图3)。

扫描电镜观察空白对照组原头节多呈内陷型，虫体呈球形或椭圆形，且表面光滑,。非特异性siRNA作用于原头节，未见头节结构变化。应用siRNA-GRP78作用于细粒棘球蚴原头节1d后在SEM下观察发现，原头节吸盘发生变型，头钩紊乱，微毛排列紊乱或消失，虫体表层呈现虫蚀样的改变或出现指状突起，部分头节虫体凹陷且结构遭到严重破坏，甚至开始崩解。当siRNA-GRP78作用2d后，原头节体表破坏加重，顶突界面严重缺损，吸盘变型，头钩排列紊乱并出现部分缺损(图4)。

采用单因素方差分析对Caspase-3活性检测出来的数据进行统计学分析，从结果看出细粒棘球蚴原头节内Caspase-3的活性表达，转染siRNA-GRP7824h、48h时，siRNA-GRP78组Caspase-3的活性表达最强(图5)。

用Western blot检测原头节内Caspase-12蛋白表达水平，发现siRNA-GRP78转染于细粒棘球蚴原头节，Caspase-12蛋白表达水平升高(P<0.05)，由此证实，siRNA-GRP78可以激活细粒棘球蚴原头节内质网应激凋亡通路(图6)。

siRNA-GRP78转染于细粒棘球蚴原头节，TUNEL检测siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节的凋亡状况。结果显示，siRNA-GRP78组原头节结构尚完整，原头节中可见被染成黄色和蓝色两种颜色的细胞核，细胞核黄染者为凋亡细胞，凋亡细胞呈散在分布或集中靠近皮层处。而对照组和空白组原头节细胞核大多数呈蓝色。证实siRNA-GRP78转染于细粒棘球蚴原头节，可以激活原头节凋亡(图7)。

综合上述结果我们可以看到，本发明的技术方案基于RNAi技术，针对GRP-78目的基因，设计干扰序列，采用电穿孔转染技术，特异性下调GRP-78的表达。实验结果显示，应用siRNA-GRP78后，siRNA-GRP78具有破坏细粒棘球蚴原头节光镜和超微结构，降低原头节的活力；激活细粒棘球蚴原头节Caspase-3活性，激活细粒棘球蚴原头节Caspase-12活性，激活细粒棘球蚴原头节TUNEL活性，诱导凋亡。基于上述实验结果可以发现本发明的干扰RNA能成功抑制GRP78表达，并对体外培养的细粒棘球蚴原头节有抑制和杀伤作用，此作用具时间依赖性，即随着作用时间的延长，原头节的抑制率增加。倒置显微镜下可见原头节体内的钙颗粒减少，头节活动度明显下降。通过伊红染色反应，可观察到随着时间的延长被着色的原头节数量也越来越多，说明抑制GRP78表达对体外培养得细粒棘球蚴原头节有抑制和杀伤作用。

Claims (6)

1.一种用于抑制和治疗细粒棘球蚴病的干扰RNA，其靶向细粒棘球绦虫的GRP78基因，所述干扰RNA的靶序列为CCTCGTGGTTTACCTCAAA。

2.干扰RNA在制备治疗细粒棘球蚴病的药物中的应用，所述干扰RNA的靶序列为CCTCGTGGTTTACCTCAAA。

3.抑制细粒棘球蚴生长的方法，其特征在于转染干扰RNA到细粒棘球绦虫细粒棘球蚴原头节，其靶向细粒棘球绦虫的GRP78基因，所述干扰RNA的靶序列为CCTCGTGGTTTACCTCAAA。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述转染的方法为电穿孔。

5.根据权利要求3的方法，其特征在于还包括评价抑制效果的步骤，包括通过光镜和电镜观察siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节形态的影响、应用Caspase-3活性检测，TUNEL检测和Caspase-12蛋白表达，获得siRNA-GRP78对细粒棘球蚴原头节凋亡的影响。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于caspase-3试剂盒检测caspase-3活性，Western blot检测原头节内Caspase-12蛋白表达水平，TUNEL法检测细胞凋亡。