CN117860704B

CN117860704B - 一种纳米复合材料Fe/TNT@NM及其制备方法和应用

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Publication number: CN117860704B
Application number: CN202410276845.7A
Authority: CN
Inventors: 杜春红; 张新歌; 周令怡; 隋委伽; 张宏健; 张元�; 单永强; 苑广洋
Original assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Current assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Priority date: 2024-03-12
Filing date: 2024-03-12
Publication date: 2024-05-24
Anticipated expiration: 2044-03-12
Also published as: CN117860704A

Abstract

本发明涉及生物医用材料技术领域，公开了一种纳米复合材料Fe/TNT@NM及其制备方法和应用，纳米复合材料Fe/TNT@NM包括掺杂型纳米颗粒以及包裹在掺杂型纳米颗粒外部的中性粒细胞膜；其中，所述掺杂型纳米颗粒包括二氧化钛纳米管和掺杂于所述二氧化钛纳米管内的铁元素；通过NM包裹Fe/TNT后，实现了纳米材料的深层组织渗透，有效避免体内免疫识别和清除，延长纳米材料的体内保留，同时具备了中性粒细胞的炎症相关受体蛋白，有效靶向疾病部位，提高纳米材料的抗菌疗效，因此可用于深层感染性疾病的声动力催化治疗领域。

Description

一种纳米复合材料Fe/TNT@NM及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料的技术领域，尤其是涉及一种纳米复合材料Fe/TNT@NM及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素的泛用和滥用造成细菌耐药性问题越来越普遍，严重威胁到人类健康。伴随着细菌耐药形成周期的缩短和耐药谱系的不断蔓延，导致耐药菌的抗生素疗效愈发降低甚至完全失效，耐药菌所引发的严重感染几乎陷入 “无药可治”的尴尬局面。因此，围绕细菌结构及感染微环境的特性，设计响应性与靶向等多功能协同的抗菌纳米载体是防治耐药菌感染研究的关键突破口。

声动力治疗(SDT)是一种在超声(US)下以声敏剂为基础产生活性氧(ROS)的具有高组织穿透性的无创治疗方式。诸如掺杂贵金属(Pt、Pb和Au)的TiO₂、卟啉类单原子催化剂、金属有机骨架纳米粒子和压电纳米粒子(如MoS₂和BaTiO₃)等声敏化剂已被设计用于作为信号换能器，将水或氧转化为活性氧，从而具有导致微生物死亡的声动力治疗效果。而钛酸盐纳米管具有高比表面积、空心形貌和优异的电子转移效率，因此它们在光电催化和纳米酶领域得到了深入的探索。然而，考虑到TiO₂声敏剂很难突破生物被膜，极大地限制了SDT的疗效。因此，亟需开发一种在生物膜基质内具有良好穿透性和声动力活性的远程控制纳米复合材料，以有效消除由耐药菌生物膜引起深层感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米复合材料Fe/TNT@NM及其制备方法和应用，以解决现有技术中细胞耐药的技术问题。

本发明提供一种纳米复合材料Fe/TNT@NM，包括掺杂型纳米颗粒以及包裹在掺杂型纳米颗粒外部的中性粒细胞膜；

其中，所述掺杂型纳米颗粒包括二氧化钛纳米管和掺杂于所述二氧化钛纳米管内的铁元素。

本发明还提供了上述纳米复合材料Fe/TNT@NM的制备方法，包括如下步骤：

S1、提取中性粒细胞膜（NM）；

S2、制备掺杂型纳米颗粒（Fe/TNT）；

S3、将NM与Fe/TNT混合，以使得NM包裹于Fe/TNT的外部，获得中性粒细胞包裹的铁掺杂的二氧化钛纳米管（Fe/TNT@NM）。

进一步地，在S2中，制备Fe/TNT具体包括：

取1±0.1mol/L三氯化铁溶液和钛酸纳米管，对于每30ml三氯化铁溶液加入0.16±0.02g钛酸纳米管，搅拌24-48 h后离心，并对离心后的沉淀进行干燥，获得Fe/TNT。

进一步地，钛酸纳米管通过如下方式制得：

S101、将NaOH、TiO₂和去离子水以质量比（5~7）：（2~4）：（14~16）混合，并在150℃条件下搅拌10-12 h，获得粗产物；

S102、将粗产物离心后取沉淀水洗至中性，再加入浓盐酸调节pH=2±0.2，继续水洗至中性，干燥后获得钛酸纳米管。

进一步地，在S3中，NM与Fe/TNT的质量比为（1~2）:1。

进一步地，在S3中，将NM与Fe/TNT混合时，还包括对NM与Fe/TNT的混合物进行5-10分钟的超声。

本发明又提交了上述纳米复合材料Fe/TNT@NM的应用，用于深层感染性疾病的声动力催化治疗。

进一步地，所述深层次感染性疾病为细菌性肺炎。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：

（1）Fe/TNT声敏剂化学稳定性强，生物安全性高，具有较强的组织穿透性，有利于深层次感染疾病的有效治疗；

（2）NM包裹Fe/TNT后，实现了纳米材料的深层组织渗透，有效避免体内免疫识别和清除，延长了纳米材料的体内保留，同时具备了中性粒细胞的炎症相关受体蛋白，有效靶向疾病部位，提高了纳米材料的抗菌疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的 Fe/TNT的构建和表征图；

其中，（A）Fe/TNT@NM的TEM图像；（B）Fe/TNT@NM的HR-TEM图像；（C）Fe/TNT@NM的XRD谱图；（D）Fe/TNT@NM的XPS谱图；

图2为本发明提供的Fe/TNT@NM的一般性能表征图；

其中，（A）WB验证Fe/TNT@NM受体蛋白TNF-R1、IL-1RⅠ和LFA-1的丰度；（B-C）流式检测Fe/TNT@NM受体蛋白LFA-1的水平；（D）DLS检测Fe/TNT@NM粒径；（E）DLS检测Fe/TNT@NM电势；

图3为本发明提供的Fe/TNT@NM的稳定性和生物相容性图；

其中，（A-B）DLS检测Fe/TNT@NM在PBS和血清中孵育15天的粒径变化；（C）不同浓度的Fe/TNT@NM的溶血率；（D）不同浓度的Fe/TNT@NM处理A549和HUVEC细胞的活性；

图4为本发明提供的Fe/TNT@NM的声动力效应图；

其中，（A-B）DPBF与Fe/TNT@NM或水共孵育在不同US照射时间后的UV-vis光谱；（C）DPBF在不同处理后经US照射后的吸收强度；（D）连续5个on-off循环下Fe/TNT@NM的1O2产率；

图5为本发明提供的Fe/TNT@NM的化学动力效应图；

其中，（A）Fe/TNT@NM催化不同浓度H₂O₂的UV-vis光谱；（B）Fe/TNT@NM对不同H₂O₂孵育时间下的化学催化效率UV-vis光谱；（C-D）Fe/TNT@NM催化H₂O₂的稳态动力学试验；

图6为本发明提供的Fe/TNT@NM的声动力和化学动力的联合效应图；

其中，（A-B）Fe/TNT@NM中TEMP/1O2加合物和DMPO/•OH 加合物分别在US辐照和H₂O₂孵育下的ESR光谱；（C）Fe/TNT@NM、H₂O₂和OPD 混合物在不同US照射时间下的UV-vis光谱；（D-E）Fe/TNT@NM、H₂O₂和OPD混合物经不同US照射时间处理后的•OH产率；

图7为本发明提供的Fe/TNT@NM体外杀菌效果图；

其中，（A）不同处理下活/死菌染色实验的CLSM 图像；（B-C）PBS、US、Fe/TNT@NM和Fe/TNT@NM+US组的平板计数结果；（D）不同浓度的Fe/TNT@NM暴露于US下PA平板计数结果；

图8为本发明提供的Fe/TNT@NM体外分散生物被膜的效果；

其中，（A）不同处理下材料分散生物被膜的CLSM 图像；（B）不同浓度的Fe/TNT@NM分散生物被膜的量化分析；（C）Fe/TNT@NM暴露于不同US时间下生物被膜分散率；

图9为Fe/TNT@NM在体外水平诱导PA发生铁死亡的效果图；

图10为Fe/TNT@NM在体外水平提升PA中MDA水平的效果图；

图11为Fe/TNT@NM在体外水平促进PA中ROS的积累的效果图；

图12为Fe/TNT@NM在体内小鼠肺炎模型中的杀菌效果图；

图13为Fe/TNT@NM在体内小鼠肺炎模型中诱导PA发生铁死亡的效果图；

图14为Fe/TNT@NM在体内小鼠肺炎模型中抑制炎症反应的效果图；

图15为Fe/TNT@NM对健康小鼠体内组织和器官的潜在毒性效果图；

其中，(A-D)健康小鼠经US、Fe/TNT@NM或Fe -1处理后第7天全血RBC、HGB、WBC和PLT水平；(E and F) 健康小鼠经US、Fe/TNT@NM或Fe -1处理后第7天血清中ALT、AST水平；(G)健康小鼠经US、Fe/TNT@NM或Fe -1处理后第7天的心、肝、脾、肺、肾病理分析。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

通常在此处附图中描述和显示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

细胞膜包裹的纳米颗粒作为一类新兴的纳米载体，天然衍生的细胞膜使其能够模拟细胞特性，擅长与生物底物相互作用，从而使它们能够避免体内的免疫清除。而中性粒细胞膜（NM）包裹的纳米颗粒因其继承了源细胞的抗原外部和相关的膜功能，使其成为中性粒细胞靶向生物分子的理想诱饵，从而有效地靶向聚集在疾病部位发挥疗效。

为了解决细胞耐药的问题，基于临床需求与药物创新之间的差距不断扩大，本发明依据细菌感染微环境，设计了一种感染微环境激活的纳米复合材料Fe/TNT@NM，为耐药菌感染的防治提供新的突破口，用于实现深层感染性疾病的声动力催化治疗，包括掺杂型纳米颗粒以及包裹在掺杂型纳米颗粒外部的中性粒细胞膜；

其中，掺所杂型纳米颗粒包括二氧化钛纳米管和掺杂于所述二氧化钛纳米管内的铁元素。

进一步地，本发明还提供了上述纳米复合材料Fe/TNT@NM的制备方法，包括如下步骤：

S1、提取中性粒细胞膜（NM）；

S2、制备掺杂型纳米颗粒即铁掺杂的二氧化钛纳米管（Fe/TNT）；

S3、将NM与Fe/TNT混合，以使得NM包裹于Fe/TNT的外部，获得纳米复合材料Fe/TNT@NM即中性粒细胞包裹的铁掺杂的二氧化钛纳米管（Fe/TNT@NM）

进一步地，在S2中，制备Fe/TNT具体包括：

进一步地，钛酸纳米管通过如下方式制得：

S101、将NaOH、TiO₂和去离子水以质量比（5~7）：（2~4）：（14~16）混合，并在150℃的条件下搅拌10-12 h，获得粗产物；

在S3中，NM与Fe/TNT的质量比为（1~2）：1。

此外，在S3中，将NM与Fe/TNT混合时，还包括对NM与Fe/TNT的混合物进行5分钟的超声。

在一个具体的实施例中，提取NM通过如下方式：

首先，将30 ug/20 g的脂多糖（每20g体重的老鼠注射30ug的脂多糖）腹腔注射到ICR小鼠体内，以激活体内中性粒细胞。6 h后，取小鼠心脏血和骨髓。全血样本中加入红细胞裂解缓冲液充分裂解红细胞，剩余细胞放置于三层percoll梯度为78%、69%和52%的percoll分离液上面，在4℃条件下1500g离心30 min，收集69%和78%梯度层之间以及78%梯度层上部的细胞即可富集得到中性粒细胞。随后将细胞重悬在含有Tris-HCl、甘露醇、蔗糖、EGTA和蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的低渗裂解缓冲液中（低渗裂解缓冲液中各组分含量为：30mM Tris-HCl， 225mM甘露醇，75mM蔗糖，0.2mM EDTA，100X蛋白酶和磷酸酶抑制剂），均质器轻轻研磨20min细胞至均匀化，在4℃的温度环境下以离心力 2万g离心25分钟，弃掉沉淀。上清液在4℃ 的温度环境下以离心力10万g 离心35分钟，收集沉淀即为细胞膜。

然后，称量30 g NaOH、1.6 g TiO₂、75mL去离子水添加于含有100mL聚四氟乙烯的反应釜中，在150℃ 的温度环境下搅拌反应10h。将产物离心水洗至中性，加入浓盐酸调节pH=2，然后水洗到中性，并在80℃的温度环境下进行干燥，制备得到钛酸纳米管。随后在浓度为1mol/L的30mL三氯化铁溶液中，加入0.16 g钛酸纳米管，搅拌24h，并进行离心，将得到的沉淀在80℃的温度环境下干燥，干燥后制备得到的产物即为Fe/TNT。随后将中性粒细胞膜与Fe/TNT以1:1重量比混合，水浴超声仪对混合物进行5分钟的超声，完成Fe/TNT@NM的制备。

检测例1：Fe/TNT@NM的表征：

检测方法：

（1）一般性能表征

通过高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）观察纳米颗粒的结构和形貌。通过X射线衍射（XRD）检测纳米颗粒的晶体结构。通过X射线光电子能谱（XPS）检测纳米颗粒的化学元素组成。通过动态光散射仪（DLS）测量纳米颗粒的水力学直径、粒径多分散指数及Zeta电势。

（2）WB检测

SDS-PAGE胶的配制：配置10%的下层分离胶，静置20-30分钟，待下层分离胶凝固后，配制上层堆积胶，倒入wb配胶专用的薄厚玻璃板之间，插好梳子，静置20-30分钟堆积胶凝固。

电泳：将配好的SDS-PAGE胶放置于电泳槽中，加入1X电泳缓冲液，小心拔掉梳子，取出三组蛋白样品和蛋白marker准备上样，每wb胶上样孔内分别加入5ul的蛋白marker和20ul的蛋白样品进行电泳。在进行电泳时，先用60V电压跑30分钟左右，这时样品均已从上层堆积胶跑至下层分离胶，然后再将电压改成100V，跑2h左右，待样品跑到分离胶最底层边缘处停止电泳。

转膜：电泳结束后，将SDS-PAGE胶放在提前预冷好的转膜液中浸泡10分钟，将PVDF膜裁剪后放置甲醇中激活5分钟，随后转移至转膜液中浸泡。转膜时，将转膜夹平放在桌子上，转膜夹的黑色面铺上海绵与三层滤纸，将分离胶小心地转移至三层滤纸上，随后铺上PVDF膜、三层滤纸和一层海绵，将转膜夹的白色面合上后固定，之后将转膜夹转移至转膜槽中，同时放入转子和冰盒，倒满转膜液，开始转膜，100V，2h。

封闭：转膜结束后取出PVDF膜，用1X TBST缓冲液清洗后，用5% 脱脂牛奶进行孵育全膜，温度为室温，时间为2个小时。

一抗孵育：封闭结束后，根据目的蛋白的分子量大小，将PVDF膜裁剪成不同大小的条带，用5%脱脂牛奶对配制好的一抗进行孵育，然后放置在温度为4℃的冰箱中过夜。转天，回收一抗，用1X TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟。

二抗孵育：清洗结束后，用5%脱脂牛奶对配制好的兔二抗和鼠二抗进行孵育1h。然后用1X TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟。

曝光：清洗结束后，将膜放置平皿中，在平皿中加入HRP底物，然后将平皿放入曝光仪中进行曝光。

（3）流式检测

取3个流式管，分别吸入100ul Fe/TNT、Fe/TNT@NM和中性粒细胞悬液，PBS洗三次，500g离心弃上清；每管加入2ul LFA-1流式抗体，在4℃的温度环境下孵育40min-1h。然后再用PBS对三个流式管内的溶液洗三次，500g离心弃上清，随后在每个流式管中均添加300ulPBS重悬，重悬之后流式上机检测LFA-1的荧光强度。

检测结果：通过高分辨率透射电镜观察所制备的 Fe/TNT@NM形貌，发现该纳米复合体具有中空管状结构，平均直径为25nm，平均管长约180nm。水平视角的HR-TEM图像显示，TNT结晶良好，平行晶格间距为0.197nm，对应锐钛矿相TiO₂，TNT与Fe沉积在同一平面。X射线衍射图谱表明，TNT的衍射峰显示锐钛矿相TiO₂，而Fe离子的掺杂并没有影响锐钛矿型TNT的晶体结构，而且Fe/TNT衍射峰中出现了Fe离子的特异性峰，说明了TNT与Fe的成功结合。X射线光电子能谱检测同样证实了Fe的存在，而且掺杂在TNT上的Fe元素以二价铁为主。【图1】

通过WB和流式检测发现，中性粒细胞膜炎症蛋白受体TNF-R1和IL-1RⅠ，以及炎症相关免疫调控的蛋白LFA-1在Fe/TNT@NM中得到了显著的富集。动态光散射（DLS）检测发现，Fe/TNT@NM的水动力直径比未涂覆NM的Fe/TNT增加了87nm，表面Zeta电位从-13 mv降低到-18 mv。【图2】

检测例2：Fe/TNT@NM的稳定性和相容性

检测方法：

（1）粒径DLS检测

Fe/TNT和Fe/TNT@NM在37℃的PBS缓冲液和血清中进行孵育15天，其中每隔三天检测两种材料在不同溶液中的粒径大小，比较Fe/TNT和Fe/TNT@NM的粒径稳定性。

（2）溶血性检测

取小鼠心脏血10ml，在3000rpm的条件下离心5min，弃去上层血清，收集沉淀即为红细胞，用PBS缓冲液洗涤三次，至上清液不显红色为止，用PBS配成2%的混悬液（2ml红细胞+生理盐水至100ml）备用。通过二倍稀释法建立Fe/TNT@NM的浓度梯度：500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.2ug/ml、15.6ug/ml、7.8ug/ml、3.9ug/ml、2ug/ml，分别与等量的红细胞样品在37℃的温度环境下孵育1h，其中以PBS作为阴性对照，水作为阳性对照。最后，取出混合物在3000rpm的条件下离心5min，通过酶标仪检测540nm处吸光度，结果表示为相对于阳性对照释放的血红蛋白的百分比。

（3）MTS检测

BEAS-2B和HUVEC细胞在DMEM+10%FBS+1%P.S培养基中培养。细胞用胰酶消化后，以每孔50000个细胞接种于96孔板中。转天，将Fe/TNT@NM加入到对应孔中，至终浓度为：500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.2ug/ml、15.6ug/ml、7.8ug/ml、3.9ug/ml、2ug/ml，每组 5 个复孔，加入培养基作为空白对照。培养 24 h 后，每孔加入20 μl MTS 溶液，并在37℃的温度环境下孵育 2 h，通过酶标仪检测545nm处吸光度。

检测结果：为了评估Fe/TNT@NM在生理条件下的稳定性，将Fe/TNT和Fe/TNT@NM在37 ℃的PBS和小鼠血清中孵育15天，粒径结果显示，Fe/TNT@NM的水力学直径约为230nm，其变化可以忽略不计，这表明经过NM包裹修饰，Fe/TNT@NM在生理条件下是稳定的。溶血性实验和细胞毒性实验表明，Fe/TNT@NM具有良好的血液相容性和细胞相容性。【图3】

检测例3：Fe/TNT@NM的声动力效应

检测方法：从4℃的温度环境下取出1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）分子探针，称取适量6mgDPBF粉末，加2ml DMSO进行充分溶解，分装4管（500ul/管），包锡纸存于4℃备用。准备3组离心管：H₂O+US、Fe/TNT@NM+US、Fe/TNT，每组6管，每管试剂体积为1ml，分别做US时间梯度：0min，2min，4min，6min，8min，10min。将30ul的DPBF试剂加入到1ml材料溶液，充分混匀后通过US超声 (1.0 MHz， 50% duty cycle， 1.5 W/cm-2）不同梯度的时间，超声之后立即通过紫外分光光度计检测416nm的吸光度，随后计算吸光度的下降比例。重复三次实验，统计分析ROS产量。

检测结果：采用常见的1O2探针DPBF检测Fe/TNT@NM在超声波的作用下产生氧自由基的能力，结果显示，与H₂O组相比，Fe/TNT@NM组在超声作用下表现出了显著的1O2生成效率。而且随着超声时间的延长，Fe/TNT@NM组的 DPBF的紫外吸收强度逐渐减弱，表明1O2的产生逐渐增多。开-关循环实验结果表明，Fe/TNT@NM材料具有一定的稳定性和可重复使用的声动力效果。【图4】

检测例4：Fe/TNT@NM的化学动力学效应

检测方法：取H₂O₂原液（30%），用dd水倍比稀释成以下浓度梯度：2000uM、1000uM、500uM、250uM、125uM、62.5uM、31.3uM。称取3mg TMB（ 3，3‘，5，5’-四甲基联苯胺）粉末，加1ml DMSO充分溶解。取500ulFe/TNT@NM材料和500ul不同浓度的H₂O₂混匀，然后加入50ul的TMB试剂，充分混匀后，在室温下孵育10min，孵育完成后吸取700ul液体量于比色杯中，通过紫外分光光度计检测652nm的吸光度；

结果：通过羟基自由基（·OH）捕集剂TMB检测发现Fe/TiO₂@NM催化H₂O₂产生·OH的声动力效应与H₂O₂浓度和H₂O₂孵育的时间成正相关。进一步测定了Fe/TiO₂@NM的催化稳态动力学，并定量计算米氏常数和催化效率，Km为10.85mM，最大反应速率为1.069，表明Fe/TNT@NM具有潜在的化学动力催化效率。【图5】

检测例5：Fe/TNT@NM的声动力和化学动力的联合效应

检测方法：

（1）ESR单线态氧检测

称取适量的TEMP（单线态氧捕捉剂）粉末，然后加入2ml dd水充分溶解，配制2x储存液。工作液稀释10倍使用，使其终浓度为50mM。将100ul的TEMP试剂加入到100ul材料的溶液中，充分混匀后，在US超声 (1.0 MHz， 50% duty cycle， 1.5 W/cm-2）10min，超声之后立即通过电子顺磁共振（ESR）检测单线态氧（1O2）的产生。

（2）ESR羟基自由基检测

称取一定量的DMPO（羟基自由基捕捉剂）粉末，用1-2ml dd水充分溶解，配制10X储液。工作液稀释10倍使用，使其终浓度为50mM。取100ul H₂O₂原液（30%）加入900ul dd水稀释10倍，配制得到浓度为1M的储液，再用dd水稀释8倍后，配制成浓度为128mM的工作液，在室温下放置备用。将500ul材料和500ul H₂O₂混合后，取100ul混合液+100ul DMPO，在室温下孵育10min，孵育之后立即通过电子顺磁共振（ESR）检测羟基自由基的产生。

（3）OPD检测

取100ul H₂O₂原液（30%，9.79M）+400ul dd水（稀释5倍）配制浓度为2M储存液，再稀释500倍，配制得到浓度为4mM的工作液，在室温下放置备用。称取5mg邻苯二胺(OPD)粉末，加1ml无水乙醇充分溶解，室温避光放置备用。实验共分为3组，分别为Fe/TNT@NM+US、Fe/TNT@NM+H₂O₂、 Fe/TNT@NM+H₂O₂+US；H₂O₂的终浓度均为2000uM，US处理时间分别为0min、2min、4min、6min、8min、10min。按照下面加入试剂：Fe/TNT@NM材料、H₂O₂和OPD工作液。

随后每组依次通过紫外分光光度计记录反应溶液在440 nm处的吸光度，重复3次实验，进行统计分析。

检测结果：研究表明超声波是一种穿透性强的机械波，能够显著加速H₂O₂的催化过程。因此，我们采用电子自旋共振光谱法（ESR），分别以2,2,6,6-四甲基哌啶-氮氧化物（TEMP）和5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作为1O2和•OH 的捕集剂，直接捕获短寿命的ROS。暴露于US照射或与H₂O₂共培养后，观察到具有代表性的ESR信号，强度比为1:1:1和1:2:2:1，表明在声动力和化学动力效应产生了ROS。同时，检测发现US可以显著促进Fe/TNT@NM催化H₂O₂生成•OH的产率，并具有一定的时间依赖性，证明了Fe/TNT@NM的声动力与化学动力效应具有一定的联合效应，即声动力效应显著增进化学动力催化效应。【图6】

检测例6：Fe/TNT@NM的逃避免疫吞噬

检测方法：

（1）细胞培养

细胞复苏：从液氮中取出冻存的RAW264.7细胞，放置于37℃的水浴锅中3-5min，吸出细胞悬液放入DMEM培养基中，并以1500rpm的转速离心5min，弃掉上清，用新鲜的培养基重悬，置于37摄氏度的培养箱孵育

细胞复苏：从液氮中取出冻存的RAW264.7细胞，放37摄氏度的水浴锅中水浴3-5min，随后吸出细胞悬液放入DMEM培养基，再在1500rpm的转速下离心5min，弃掉上清，用新鲜的培养基重悬，置于37℃的培养箱孵育。

细胞传代：待细胞生长至90%密度后，轻轻吸弃细胞上清培养基，用PBS轻轻洗一遍，吸弃PBS，吸取1ml新鲜的培养基，轻轻吹打细胞皿底部，直至所有细胞脱落下来，准备3个10cm培养皿，将细胞悬液均分三份，补加8ml新鲜培养基，置于37℃的培养箱中孵育。

细胞铺板：待细胞生长状态良好时，轻轻吹打收集细胞，吸取20ul进行细胞计数，剩余细胞悬液以1500rpm的转速离心弃上清，用DMEM重悬细胞，并调整细胞密度为1×10⁵个/ml。取12孔板和细胞爬片，将爬片轻轻放置于孔板底中，每孔先加入500ul培养基，再加入细胞悬液500ul，至于37℃的培养箱中孵育24h。

（2）染料标记材料

分别取1ml空载和包NM膜纳米材料与1ml RB染料（2mg/ml），充分混匀后，水浴超声1h，再以5000rpm的转速离心5min，弃掉上清多余染料，加1ml PBS重悬备用。

（3）纳米材料与巨噬细胞共孵育

将空载的和包NM膜的纳米材料分别以5000rpm的转速离心5min，弃掉上清，改用新鲜培养基重悬至终浓度为200ug/ml。取出12孔板，观察细胞形态后，将细胞上清弃掉，随后轻轻加入1ml分别含有空载纳米材料和包有NM膜纳米材料的新鲜培养基，轻轻摇晃孔板，至于37℃培养箱，孵育72h。

（4）免疫荧光检测

取出12孔板，轻轻弃上清，加PBS清洗三次，每次5min，然后去掉多余的染料。加入1ml 4%多聚甲醛（固定液），在室温下避光孵育10min，弃掉固定液，加入PBS清洗三次，每次5min。弃掉上清，加入配好的1ml 0.25%TritonX，在室温下避光孵育15min，弃上清，加入PBS清洗三次，每次5min。弃掉上清，加入1ml 0.5% BSA，在室温下避光孵育30min，弃上清，加入PBS清洗三次，每次5min。用0.5%BSA配制Tubulin一抗（1：100），4℃过夜避光孵育细胞爬片。转天，将爬片放回孔板中，加入PBS清洗三次，每次5min。用0.5%BSA配制F488荧光二抗，在室温下避光孵育细胞爬片1h。将爬片放回孔板中，加入PBS清洗三次，每次5min。轻轻取出细胞爬片至滤纸上，晾干，在载玻片上加10ul DAPI封片剂，荧光显微镜观察纳米材料的吞噬情况。

检测结果：空载材料组中发现大量红色染料标记的材料被巨噬细胞吞噬到细胞质中。包NM纳米材料组中，巨噬细胞的胞质中聚集的红色荧光强度显著减弱，有效逃避巨噬细胞的吞噬。综上表明：巨噬细胞对包裹了NM的纳米粒的吞噬能力显著减弱，包裹NM膜的纳米材料具备有效逃避巨噬细胞吞噬清除的潜能。

检测例7：Fe/TNT@NM的抗游离菌性能

检测方法：

（1）平板培养计数法

取出小摇的菌液，以5000rpm的转速离心5min，弃上清，加适量PBS重悬清洗三次，离心弃上清，分次加入适量的PBS重悬细菌、紫外细菌悬液OD600=1.023。各取菌液500ul于4组1.5ml离心管中，分别是PBS组、材料组、PBS+US组和材料+US组。再以5000rpm的转速离心5min，弃上清，1组和3组用500ul PBS重悬细菌沉淀，2组和4组用500ul材料重悬细菌沉淀，放置37℃摇床里摇晃孵育2-3h。孵育结束后，取3组和4组样本依次进行US超声处理10min，1组和2组在室温环境下静置20min。将4组菌液和固体培养基放入超净台，4组菌液分别做4次的10倍稀释，取最大稀释倍数管35ul进行涂板，每组涂三个，37℃培养16-18h。转天上午进行菌落平板计数。重复三次，进行统计学分析。

（2）死/活细菌荧光染色

取出新鲜菌液，对其进行划线涂板，并在37℃的环境下生长18h。转天，挑取单克隆菌落，放入15ml LB中37℃过夜摇菌。第三天，取出菌液，在5000rpm的转速下离心5min，弃上清，随后加入10ml PBS重悬，再在5000rpm的转速下离心5min，重复洗2次。随后用PBS调细菌OD600=1.2，取500ul细菌悬液于4组1.5ml离心管中，再以5000rpm的转速离心5min，弃掉上清备用。1组和3组离心管中加500ul PBS重悬，2组和4组离心管中加500ul 材料（250ug/ml）重悬，四个离心管水平放置固定于离心管架上，在37℃的环境下通过摇床孵育2h。随后取出共孵育后的离心管，3组和4组离心管依次进行US 超声10min，在US超声的过程中混匀一下，其余离心管在室温下静置。从4℃取出AO和EB（配好现用）染液，浓度都是1mg/ml，各取10ulAO染液和10ul EB染液于各离心管中（500ul体系），混匀，37℃避光染色15min，5000rpm离心5min，吸弃上清。每管加1ml PBS洗8次（至上清完全无色透明），在5000rpm的转速下离心5min，最后一次PBS离心后，用枪头弃上清，吸干上清。用移液枪转移一滴甘油于离心管底，包裹菌液沉淀，先用枪头搅拌均匀，调30ul量程吹打均匀。吸取菌液滴于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，液体均匀分布后，倒置于滤纸上，轻轻按压挤出多余液体。用指甲油在盖玻片四角滴一滴进行固定。避光盖上盖子，过夜晾干，预约CLSM拍照。

检测结果：基于上述Fe/TNT@NM优良的声动力和化学动力效应，我们通过死/活染色法和平板计数法研究Fe/TNT@NM对PA耐药菌的抗菌性能，结果显示Fe/TNT@NM介导的声动力和化学动力效应可以显著抑制并消除游离PA耐药菌的活性，并具有一定的浓度依赖性。【图7】

检测例8：Fe/TNT@NM的抗生物被膜性能

检测方法：

（1）结晶紫染色检测

取出菌液，在5000rpm的转速下离心5min，弃上清，加10ml PBS重悬，再以5000rpm的转速离心5min，重复洗2次。随后用LB调细菌OD600=0.05备用。吹打混匀细菌悬液后，准备96孔板，每孔加入100ul PA14细菌悬液，共7组，每组5个复孔，每个加样孔之间相隔一个孔，周围其它孔加入200ul PBS，在37℃的孵箱中培养24h，形成生物被膜。取出96孔板，用移液枪轻轻吸弃孔内菌液，只保留生物被膜，每孔轻轻加入200ul PBS，清洗三次，弃掉废液。分别加入不同浓度的材料溶液100ul，在37℃的孵箱中共孵育4h。孵育结束后，依次进行US超声处理5min。用移液枪轻轻吸弃孔内全部液体，每孔加200ul甲醇（固定液）进行固定40min。用移液枪轻轻吸弃固定液，每孔加200ul结晶紫，在室温下染色30min。用移液枪轻轻吸弃结晶紫，每孔加入200ul PBS或自来水进行反复清洗，至除生物被膜染色外无其他多余染料。用移液枪加200ul 33%乙酸，用手轻轻摇晃孔板，室温静置1h至充分溶解，酶标仪检测Ab590。以上重复三次，数据统计分析。

（2）CLSM三维成像检测

取出菌液，以5000rpm的转速离心5min，弃上清，加10ml PBS重悬，再在5000rpm的转速下离心5min，重复洗2次。随后用LB调细菌OD600=0.05备用。吹打混匀细菌悬液后，准备6孔板和已灭菌的载玻片，每孔加入2ml PA14细菌悬液，放入载玻片，在37℃的孵箱中培养24-48h，以培养生物被膜。取出6孔板观察生物被膜生长情况，用移液枪轻轻吸弃孔内剩余菌液，只保留生物被膜，每孔轻轻加入2ml PBS，清洗三次后弃掉废液。材料组每孔加入2ml的250ug/ml材料溶液，PBS组加入2ml PBS，然后再37℃的孵箱中共孵育4h。孵育结束后，PBS+US组和材料+US组依次进行US超声处理8min。用移液枪轻轻吸弃孔内全部液体，每孔加2ml 4%戊二醛进行固定4h。取40ul FITC-conA染液和40ul EB染液于2ml孔中，在37℃的环境中避光染色15min。染色后每孔加2ml PBS洗3次，随后将载玻片晾干。然后吸取一滴甘油滴于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，待液体均匀分布后倒置于滤纸上，轻轻按压挤出多余液体。用指甲油在盖玻片四角滴一滴进行固定。避光盖上盖子，过夜晾干，预约CLSM拍照。

检测结果：由于生物被膜基质对杀菌剂的屏蔽效应致使生物被膜难以被有效清除。因此，纳米复合材料分散生物被膜的能力对于生物被膜的根除是重要的。通过激光共聚焦和结晶紫染色探究Fe/TNT@NM材料分散耐药PA菌株形成的生物被膜的分散作用，结果表明，Fe/TNT@NM声动力治疗能够显著分散耐药菌PA的生物被膜，并具有一定的浓度和时间依赖性。【图8】

检测例9：Fe/TNT@NM的诱导PA铁死亡

检测方法：

（1）实验分组和不同治疗处理

从-20℃冰箱取出新鲜菌液，划线涂板，在37℃的温度环境下生长16h。转天，挑取单克隆菌落，放入10ml LB中，并在37℃的温度环境下过夜摇菌。第三天，取出菌液后以5000rpm的转速离心5min，弃上清，加8ml PBS重悬，再以5000rpm的转速下离心5min，重复洗2次。随后用PBS调细菌OD600=1.2，分别取450ul新鲜的菌液于5组1.5ml离心管中，随后再以5000rpm的转速离心5min，弃上清备用。称取1mg Fe/TiO₂粉末，再加入500ul无菌PBS充分溶解，以冰浴探头式超声40min，超声20s，然后停顿15s，均匀分散Fe/TiO₂至均匀尺寸大小。另取出1mg NM膜蛋白溶液，按比例1：1将Fe/TiO₂和NM充分混匀，然后水浴超声15min，再通过离心弃掉多余未结合的游离膜蛋白，沉淀为NM包裹纳米材料，加入1ml PBS重悬备用，利用PBS配制1mg/ml储液。随后用PBS稀释5倍以配制工作浓度为200ug/ml的材料备用。称取1mgFerrostatin-1(Fer-1)粉末溶于10ml溶剂（10% DMSO + 40% PEG300 + 5% 吐温-80 + 45%PBS），在37℃的环境下孵育10min，然后再超声5min，直至完全溶解，以此配制成100ug/ml（381uM）的储存液，体外使用时稀释200倍后使用。

实验分组：PA+PBS、PA+PBS+US、PA+Fe/TNT@NM、 PA+Fe/TNT@NM+US、 PA+Fe/TNT@NM+US+Ferrostatin-1(Fer-1)。第1组和第3组细菌悬液中加500ul PBS重悬；第2组和第4组细菌悬液中加500ul Fe/TNT@NM（200ug/ml）重悬；第5组细菌悬液中加500ul Fe/TNT@NM（200ug/ml）+2.5ul Fer-1（381uM）重悬；以上5组离心管水平放置固定于离心管架上，在37℃下摇床孵育5h。随后在37℃的环境下取出共孵育后的5组离心管，第3、4和5组离心管依次进行US 8-10min，期间每隔2 min混匀一下，其余离心管在室温下静置。

（2）流式检测脂质过氧化情况

声动力处理后，将5组细菌悬液在5000rpm的转速下离心5min，弃上清，PBS清洗三次，并在每次清洗后以5000rpm的转速离心5min。最后一次离心前，将悬液转移到流式管中，离心后弃掉上清，取出C11-bodipy染色，每管加入0.5ul染液，充分混匀后在37℃的环境下孵育1h。染色结束后，每管加1ml PBS，并以5000rpm的转速离心5min，清洗3次并弃掉多余的游离染液。用300ul-500ul PBS重悬后，上机检测488激发光下的510nm的荧光强度。

（3）酶标仪检测MDA水平

收集5组细菌到离心管内，并以5000rpm的转速离心5min，弃上清，PBS清洗三次，每次清洗后以5000rpm的转速离心5min，弃上清。随后加入1mL试剂盒中提取液，再通过超声波破碎细菌（功率200W，超声5s，间隔10s，重复30个循环），随后8000g 4℃条件下离心10min，吸取上清于新的1.5ml离心管中，置冰上待测。随后每管吸取100ul 上清于新的离心管中，每孔加入300ul MDA检测工作液和100ul试剂三，混合均匀后，在100℃水浴中孵育60min，随后冰浴冷却。最后吸取混合液200ul于新的96孔板中，检测Ab523。

（4）免疫荧光法检测ROS产生情况

收集5组细菌到离心管内，并以5000rpm的转速离心5min，弃上清，PBS清洗三次，每次清洗后以5000rpm的转速离心5min。最后一次离心前，将悬液转移到流式管中，离心后弃掉上清，取出DCFH-DA染色，每管加入0.3ul染液，充分混匀，在37℃的环境下孵育40min。每管加1ml PBS洗3次，再以5000rpm的转速离心5min，最后一次PBS离心后，用枪头弃上清，吸干上清，吸取一滴甘油于管底，包裹菌液沉淀，先用枪头搅拌均匀，调30ul量程吹打均匀。吸取菌液滴于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，液体均匀分布后，倒置于滤纸上，轻轻按压挤出多余液体。用指甲油在盖玻片四角滴一滴固定。避光盖上盖子，过夜晾干，荧光显微镜检测488激发光下的510nm的荧光强度。

检测结果：

（1）材料诱导体外PA铁死亡

首先，我们在体外游离多重耐药PA中，通过流式检测手段进一步验证了Fe/TNT@NM在超声照射和Fer-1处理下的脂质过氧化情况，结果如下：与PBS相比，超声处理不能诱导体外PA发生脂质过氧化；而单独Fe/TNT@NM孵育或同时在US处理后均能显著诱导PA发生脂质过氧化，510nm的荧光强度显著增强，510nm处吸收峰发生右移，而这一现象确实能够被Fer-1所削弱。以上结果表明， Fe/TNT@NM在US照射下能够显著诱导PA细菌膜发生脂质过氧化。【图9】

（2）材料诱导PA中MDA水平升高

随后我们在体外实验中，检测了Fe/TNT@NM在超声处理下和Fer-1处理下的PA内产生MDA的水平情况，结果如下：与PBS相比，单独US不能诱导PA内MDA水平的变化；而单独Fe/TNT@NM处理或同时在US处理后均能显著诱导PA内MDA水平的显著提升，表现为532nm的吸收强度显著增强。同时，Fer-1处理能够在一定程度上削弱Fe/TNT@NM+US增加PA内MDA水平的能力。以上结果表明，Fe/TNT@NM和US处理能够显著诱导PA内MDA水平的升高。【图10】

（3）材料诱导PA中ROS水平升高

我们在体外游离多重耐药PA中，通过免疫荧光检测手段再次验证了Fe/TNT@NM在超声照射和Fer-1处理下总体ROS产生的情况，结果如下：单纯超声处理不能显著诱导体外游离PA的ROS水平增加；Fe/TNT@NM孵育后能够促进PA体内ROS的产生，绿色荧光强度稍有加强；Fe/TNT@NM孵育后进行US处理的同时，进一步增加了细菌内ROS的总体水平，绿色荧光大幅度增强；而这一现象在经过Fer-1处理后产生一定程度的削弱，绿色荧光相对减弱。

以上结果表明，Fe/TNT@NM在US照射下显著促进PA细菌内ROS的产生，其中一部分是由于铁死亡所介导产生的。【图11】

检测例10：Fe/TNT@NM显著改善铜绿假单胞菌小鼠肺炎损伤

检测方法：

（1）小鼠肺炎模型构建

从-20℃的冰箱中取出新鲜菌液，划线涂板，并在37℃的环境下生长18h。转天，挑取单克隆菌落，放入15ml LB中37℃过夜摇。第三天，取出菌液，并以5000rpm的转速离心5min，弃上清，加10ml PBS重悬，再以5000rpm的转速离心5min，重复洗2次。随后用PBS调细菌OD600=0.05备用。小鼠腹腔注射10%水合氯醛（100ul/20g），将小鼠平卧位放置，用1ml注射器吸取MDR-PA细菌悬液，多次少量经鼻腔给药，共计50ul/只，随后放回笼中静置24h，构建细菌性肺炎模型。

（2）材料治疗方案

材料配制：称取2mg Fe/TiO₂粉末，加1ml 无菌PBS充分溶解，再以冰浴探头式超声1h，在超声过程中每超声10s后停10s，均匀分散Fe/TiO₂至均匀尺寸大小。另取出2mg NM膜蛋白溶液，按比例1：1将Fe/TiO₂和NM充分混匀，水浴超声10min，离心弃掉多余未结合的游离膜蛋白，沉淀为NM包裹纳米材料，加入2ml PBS重悬备用，以此配制浓度为1mg/ml的储液。随后用PBS稀释5倍以配制工作浓度为200ug/ml的材料备用。Fer-1配制：称取1mg粉末溶于10ml溶剂（10% DMSO + 40% PEG300 + 5% 吐温-80 + 45% PBS），在37度的环境下孵育10min，并超声5min，直至完全溶解。

实验分为6组，每组各5只老鼠：normal、PA+PBS、PA+PBS+US、PA+Fe/TNT@NM、 PA+Fe/TNT@NM+US、 PA+Fe/TNT@NM+US+Fer-1。在PA感染24 h后，先在最后一组小鼠通过尾静脉注射200ul Fer-1（0.1mg/ml）/只。随后小鼠腹腔注射10%水合氯醛，小鼠平卧位放置，votex混匀材料悬液，用1ml注射器吸取材料悬液（200ug/ml），多次少量经鼻腔给药，共计50ul/只，随后小鼠胸部涂抹适量耦合剂，进行US超声共6 min，分3次进行，每次2min。随后放置笼中，以上治疗方案连续重复5天。

（3）小鼠肺组织残留PA检测

实验第7天，将小鼠处死后，取出肺组织，于冰上用PBS反复清洗至无血色，用注射器反复研磨组织块至肉眼不可见，随后将肺组织悬液用PBS清洗三次，于500g离心，离心后去掉细胞沉淀，随后将收集好的上清进行5000g离心，离心后收集细菌沉淀，随后用LB培养基重悬后，5组分别做3-4次的10倍稀释，取最大稀释倍数管35ul 进行涂板，均匀涂布于三个平皿，在37℃的环境下培养16-18h，转天上午菌落平板计数。重复三次，进行统计学分析。

（4）小鼠肺组织PA铁死亡检测

配制C11-bodipy，1mg C11-bodipy粉末取出，并在室温下平衡30min，且低速离心10min，随后加入200ul DMSO，使其充分溶解后混匀，配制成10mM的储存液。实验第7天，将小鼠处死后，取出肺组织，于冰上用PBS反复清洗至无血色，将全部肺组织充分研磨至无肉眼可见组织块，随后将肺组织悬液用PBS清洗三次，于500g离心，离心后去掉细胞沉淀，随后将收集好的上清进行5000g离心，弃上清，随后收集细菌沉淀，再用PBS清洗三次，在最后一次离心前，将悬液转移到流式管中，离心后弃掉上清，取出C11-bodipy染色，每管加入0.2ul染液，充分混匀后在37℃的环境下孵育30min。随后用PBS清洗三次，通过流式检测488激发光下的510nm的荧光强度。

（5）小鼠肺组织炎症因子水平检测

实验第7天，将小鼠处死后，取出肺组织，于冰上用PBS反复清洗至无血色，剪下一小块肺组织加入TRIZOL裂解液，并在冰上进行充分裂解，按照RNA提取说明书步骤提取组织RNA，然后通过逆转录试剂盒进行逆转录，最后加入cDNA、引物和SYBR进行实时荧光定量PCR以检测肺组织中的炎症因子IL-1β、TNF-a和IL-6的转录水平。

（6）材料的生物安全性检测

实验第7天，采集心脏抗凝全血进行血常规检查，包括红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、白细胞(WBC)和血小板(PLT)。取血后在室温下静置1h，并以3500转/分的转速离心15min，收集上肢血清进行生化检测，检测目标包括丙氨酸转氨酶(ALT)、和天冬氨酸转氨酶(AST)。将小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官分离于固定液中浸泡24h，随后以石蜡包埋，再切成4 μm薄片。最后采用HE染色对各组织异常病理结构进行观察和分析。

检测结果：

（1）材料的体内杀菌性能

首先，我们检测了Fe/TNT@NM在超声和Fer-1处理后得体内杀菌效果。相比于正常组，其他PA感染组小鼠均成功感染PA肺炎。与PA+PBS组相比，单独US处理和单独Fe/TNT@NM处理均能够抑制部分肺部PA菌的生长和存活，两组小鼠在治疗周期后肺组织内残留细菌数显著减少。重要的是，Fe/TNT@NM+US处理能够最大程度地杀伤肺组织中的PA菌，抗菌效果最显著，肺部残留细菌数最少。以上结果表明，Fe/TNT@NM在体内肺炎小鼠模型中具有很大潜力的抗菌效能。【图12】

（2）材料诱导体内PA铁死亡

我们检测了Fe/TNT@NM在超声处理下和Fer-1处理下的小鼠肺组织感染的PA脂质过氧化情况，结果如下：与PBS相比，单独US不能诱导PA发生脂质过氧化；而单独Fe/TNT@NM处理或同时在US处理后均能显著诱导PA发生脂质过氧化，表现为510nm的荧光强度显著增强。同时，Fer-1处理能够在一定程度上削弱Fe/TNT@NM+US诱导脂质过氧化的能力。以上结果表明，Fe/TNT@NM和US处理能够显著诱导PA发生脂质过氧化。【图13】

（3）材料改善小鼠肺炎损伤

我们检测了Fe/TNT@NM对小鼠肺炎组织内炎症因子水平的影响，结果显示，相比于正常组，PA感染组小鼠肺组织中的促炎因子IL-1β、TNF-a和IL-6水平显著升高；与PBS组相比，单独US处理和单独Fe/TNT@NM处理均没有影响小鼠肺组织中的促炎因子IL-1β、TNF-a和IL-6水平。而Fe/TNT@NM+US处理能够显著抑制小鼠肺组织中的促炎因子IL-1β、TNF-a和IL-6水平，Fer-1处理在一定程度上削弱Fe/TNT@NM+US的抑制效果。以上结果表明，Fe/TNT@NM在US作用下通过诱导PA铁死亡显著减轻小鼠肺组织促炎因子的浸润。【图14】

（4）材料的生物安全性

最后，我们对Fe/TNT@NM对健康小鼠组织和器官的潜在毒性作用进行了全面评估。分别取不同治疗组小鼠全血进行血常规检查，结果显示红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）水平均保持在正常范围内。然后分离血清进行生化指标检测，包括谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)维持在正常水平。病理分析进一步证实，各治疗组小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织结构均正常，未发生明显炎症反应。以上结果表明，Fe/TNT@NM对健康小鼠血液系统及主要脏器无明显毒性作用。【图15】

综上，本发明成功制备了中性粒细胞包裹的铁掺杂的二氧化钛纳米管，其化学稳定性强、生物安全性高，并具备较强的组织穿透性，可通过声动力及化学动力效应联合作用高效杀灭耐药菌；通过破坏细菌生物被膜，诱导细菌铁死亡，解决细菌多重耐药，为细菌性肺炎等深层次感染性疾病的治疗提供更强有力的手段，为临床提供更多治疗选择，提高感染疾病的治愈率和预后，为后续研究提供重要的科研依据。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种纳米复合材料Fe/TNT@NM，其特征在于，包括掺杂型纳米颗粒以及包裹在掺杂型纳米颗粒外部的中性粒细胞膜；

其中，所述掺杂型纳米颗粒包括二氧化钛纳米管和掺杂于所述二氧化钛纳米管内的铁元素；

所述纳米复合材料Fe/TNT@NM通过如下方式制得：

S1、提取中性粒细胞膜NM；

S2、制备掺杂型纳米颗粒Fe/TNT；

S3、将NM与Fe/TNT混合，以使得NM包裹于Fe/TNT的外部，获得中性粒细胞包裹的铁掺杂的二氧化钛纳米管Fe/TNT@NM；

所述中性粒细胞膜通过如下方式获得：

将30 ug/20 g的脂多糖腹腔注射到ICR小鼠体内，以激活体内中性粒细胞，6 h后，取小鼠心脏血和骨髓，全血样本中加入红细胞裂解缓冲液充分裂解红细胞，剩余细胞放置于三层percoll梯度为78%、69%和52%的percoll分离液上面，在4℃条件下1500g离心30 min，收集69%和78%梯度层之间以及78%梯度层上部的细胞即可富集得到中性粒细胞，随后将细胞重悬在低渗裂解缓冲液中，其中低渗裂解缓冲液中各组分含量为：30mM Tris-HCl， 225mM甘露醇，75mM蔗糖，0.2mM EDTA，100X蛋白酶和磷酸酶抑制剂，均质器轻轻研磨20min细胞至均匀化，在4℃的温度环境下以离心力 2万g离心25分钟，弃掉沉淀，上清液在4℃ 的温度环境下以离心力10万g离心35分钟，收集沉淀即为细胞膜；

在S2中，制备Fe/TNT具体包括：

取1±0.1mol/L三氯化铁溶液和钛酸纳米管，对于每30ml三氯化铁溶液加入0.16±0.02g钛酸纳米管，搅拌24-48h后离心，并对离心后的沉淀进行干燥，获得Fe/TNT；

所述钛酸纳米管通过如下方式制得：

S101、将NaOH、TiO₂和去离子水以质量比（5~7）：（2~4）：（14~16）混合，并在150℃条件下搅拌10-12h，获得粗产物；

2.根据权利要求1所述的纳米复合材料Fe/TNT@NM，其特征在于，在S3中，NM与Fe/TNT的质量比为（1~2）：1。

3.根据权利要求1所述的纳米复合材料Fe/TNT@NM，其特征在于，在S3中，将NM与Fe/TNT混合时，还包括对NM与Fe/TNT的混合物进行5-10分钟的超声。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的纳米复合材料Fe/TNT@NM在制备深层次感染性疾病药物中的应用；

所述深层次感染性疾病为细菌性肺炎。