CN112121015A - 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途 - Google Patents

一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112121015A
CN112121015A CN202010855790.7A CN202010855790A CN112121015A CN 112121015 A CN112121015 A CN 112121015A CN 202010855790 A CN202010855790 A CN 202010855790A CN 112121015 A CN112121015 A CN 112121015A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tio
antibody
peg
nps
nanoparticles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010855790.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112121015B (zh
Inventor
邱逦
马朗
韦馨
程冲
向茜
王丽芸
朱笔挥
李玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by West China Hospital of Sichuan University filed Critical West China Hospital of Sichuan University
Priority to CN202010855790.7A priority Critical patent/CN112121015B/zh
Publication of CN112121015A publication Critical patent/CN112121015A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112121015B publication Critical patent/CN112121015B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/143—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A61K41/0033—Sonodynamic cancer therapy with sonochemically active agents or sonosensitizers, having their cytotoxic effects enhanced through application of ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明提供了一种载PD‑L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途，属于生物医用材料领域。该TiO2纳米粒是载细胞程序性死亡受体‑配体1抗体的仿生TiO2纳米粒；所述仿生TiO2纳米粒由TiO2纳米粒、DSPE‑PEG2000‑NH2和细胞膜为原料制备而成；TiO2纳米粒、DSPE‑PEG2000‑NH2和细胞膜的质量比为(1～5)：(1～5)：(1～5)。该纳米粒粒径较小，同时抗体携载率较高，无明显细胞毒性。同时，该纳米粒能较好地同源靶向并特异性靶向结合恶性黑色素瘤细胞，进而引起细胞凋亡。此外，该纳米具有生物安全性，瘤内注射后具有相对较强的靶向聚集能力，SDT条件下能够较好地抑制恶性黑色素瘤的生长。可用于肿瘤，特别是恶性黑色素瘤治疗，具有良好的应用前景。

Description

一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途。
背景技术
恶性肿瘤是世界范围内威胁人类健康与生命的最为严重的疾病之一。目前，早期恶性肿瘤可通过传统的治疗方法如手术治疗、化疗、放疗等进行治疗，但这些方法对中晚期肿瘤患者疗效甚微，并且巨大的毒副作用如肝肾损伤等可能会加速患者病情的恶化与死亡。因此，临床急需一些新的治疗方法用于辅助肿瘤治疗。随着医学技术的不断发展，一些新兴疗法如生物疗法、免疫疗法、光动力学以及声动力学疗法越来越被广泛关注。
声动力疗法(Sonodynamic therapy，SDT)是由光动力疗法(Photodynamictherapy，PDT)发展而来的新兴肿瘤治疗方法，最早由日本学者Umemura S提出。SDT抗肿瘤的作用机制目前尚未完全统一，但大部分研究者认为SDT的作用机制与PDT类似，即单线态氧机制及氧自由基理论。目前认为SDT主要通过激活组织内的声敏剂产生一系列的生化效应(如增加羟自由基、单线态氧等)，加上本身的超声物理效应(如空化效应、热效应和声致发光效应)，从而损伤或杀灭肿瘤细胞(程序性凋亡、自噬和非程序性坏死)。SDT经过三十年的发展，已被证实可用于多种实体肿瘤如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胶质瘤、肉瘤、恶性淋巴瘤、黑色素瘤等的体内外研究。
SDT抗肿瘤作用的发挥离不开声敏剂。目前的声敏剂主要包括有机声敏剂及无机声敏剂。有机声敏剂主要含各种化合物如卟啉及其衍生物、染色剂、喹诺酮类药物、吩噻嗪类化合物、抗肿瘤药物等；而无机声敏剂主要包括负载有机小分子声敏剂的无机材料及自身具有声敏特性的无机材料。有机声敏剂大多也属于光敏剂，大多水溶性较差，存在生物利用度低、稳定性和特异性不佳及光毒副作用等缺点。无机声敏剂的产生，可以在一定程度上改善这些不足，增强SDT效果。
无机纳米粒子如二氧化钛(Titanium dioxide，TiO2)纳米粒具有声敏作用，其对生物系统具有化学惰性，生物安全性高，成本低，具有广泛的临床应用潜力，多项研究证实其作为声敏剂可抑制肿瘤细胞的增长。但由于其分散性不佳，颗粒在肿瘤中特异性积累不足而导致肿瘤治疗效率低下，限制了TiO2纳米粒在SDT中的应用与发展。TiO2纳米粒的靶向修饰可弥补这一不足。YouD G等人通过羧甲基葡聚糖和多巴胺修饰合成了亲水性TiO2纳米粒子(HTiO2 NPs)，实验证明相同超声条件下HTiO2 NPs比一般TiO2纳米粒子能更好地抑制肿瘤的生长，且具有更好的稳定性。
同时，现有技术常利用聚合物、白蛋白、磷脂、表面活性剂、聚多糖等修饰TiO2纳米粒，增强了修饰后的TiO2纳米粒的生物相容性和长循环性。但是现有技术修饰的TiO2纳米应用于SDT存在靶向性和疗效不足的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途。
本发明提供了一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，它是载细胞程序性死亡受体-配体1抗体的仿生TiO2纳米粒；
所述仿生TiO2纳米粒由TiO2纳米粒、DSPE-PEG2000-NH2和细胞膜为原料制备而成；TiO2纳米粒、DSPE-PEG2000-NH2和细胞膜的质量比为(1～5)∶(1～5)∶(1～5)。
进一步地，所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体为活化细胞程序性死亡受体-配体1抗体；所述活化细胞程序性死亡受体-配体1抗体为将细胞程序性死亡受体-配体1抗体溶于溶剂后，加入EDC和NHS活化，即得；
优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和溶剂的体积比为(1～10)∶100；所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体、EDC和NHS的质量比为(0.001～0.1)∶(0.1～1)∶(0.1～1)；
更优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和缓冲液的体积比为1∶100；所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体、EDC和NHS的质量比为0.005∶0.5∶0.6。
进一步地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体为PD-L1单克隆抗体；
和/或，所述溶剂为缓冲液；
和/或，所述活化为冰水浴反应1～3h；
优选地，
所述缓冲液为MES缓冲液；
更优选地，
所述MES缓冲液浓度为0.1M，pH为5.0。
进一步地，所述载细胞程序性死亡受体-配体1抗体的仿生TiO2纳米粒的制备方法包括如下步骤：
将细胞程序性死亡受体-配体1抗体加入仿生TiO2纳米粒溶液中，搅拌后离心，干燥，即得；
优选地，所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为(0.002～0.003)∶1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液为TiO2纳米粒的PBS溶液；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌；
和/或，所述干燥为冷冻干燥；
更优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为0.0025∶1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌过夜；
和/或，所述离心为离心力3600～3700g离心10min。
进一步地，所述TiO2纳米粒、DSPE-PEG2000-NH2和细胞膜的质量比为2∶1∶1。
进一步地，所述仿生TiO2纳米粒的制备方法包括如下步骤：
(1)将TiO2纳米粒溶于溶剂中，制备得到浓度为1～5mg/mL的TiO2纳米粒悬液；
(2)将DSPE-PEG2000-NH2溶于溶剂中，制备得到浓度为1～5mg/mL的DSPE-PEG液；
(3)将细胞膜用溶剂稀释成浓度为1～5mg/mL的细胞膜液；
(4)按质量比将TiO2纳米粒液、DSPE-PEG液和细胞膜液混合，超声分散，离心，弃上清液，冻干即得；
优选地，
步骤(1)中，所述TiO2纳米粒悬液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(1)中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液；
和/或，步骤(2)中，所述DSPE-PEG溶液液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(2)中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液；
和/或，步骤(3)中，所述细胞膜溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(3)中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液。
进一步地，
步骤(1)中，所述TiO2纳米粒悬液制备时进行超声分散；
和/或，步骤(4)中，所述超声分散的功率162W，频率40KHz，时间30min；
和/或，步骤(4)中，所述离心为4℃离心；
优选地，
步骤(1)中，所述超声分散的功率162W，频率40KHz，时间10min；
和/或，步骤(4)中，所述离心力为3600～3700g离心10min。
进一步地，所述细胞膜为黑色素瘤细胞的细胞膜；
优选地，所述细胞膜为黑色素瘤B16F10细胞的细胞膜。
本发明还提供了一种前述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒的制备方法，它包括如下步骤：
将细胞程序性死亡受体-配体1抗体加入仿生TiO2纳米粒溶液中，搅拌离心，干燥，即得；
优选地，所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为(0.002～0.003)∶1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液为TiO2纳米粒的PBS溶液；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌；
和/或，所述干燥为冷冻干燥；
更优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为0.0025∶1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌过夜；
和/或，所述离心为离心力3600～3700g离心10min。
本发明还提供了前述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒在制备抗肿瘤的材料和/或药物中的用途；所述材料为声敏剂；
优选地，所述声敏剂为用于声动力疗法的声敏剂；
更优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。
本发明中，室温为25±5℃；过夜为12±2h。
本发明中，PD-L1抗体就是细胞程序性死亡受体-配体1抗体。
本发明主要有以下有益效果：
1、成功制备载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs)；该纳米粒粒径较小，稳定性好，具有B16F10细胞膜相同膜蛋白及黑色素瘤膜相关抗原gp100的表达，且PD-L1抗体的携载率较高。
2、TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs无明显细胞毒性，具有较好的血液相容性，能较好地同源靶向及特异性靶向B16F10细胞。不同浓度的TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs，不同强度、不同时间的声动力条件下可产生不同程度的ROS，进而引起不同程度的细胞凋亡。
3、TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs在体内具有较好的生物安全性，瘤内注射后在体内具有相对较强的靶向聚集能力，在声动力条件下能够较好地抑制恶性黑色素瘤的生长，具有相对显著的抗肿瘤治疗效果。
综上，本发明成功制备了载PD-L1抗体的仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)，该纳米粒粒径较小，B16F10细胞膜包被，同时抗体携载率较高，无明显细胞毒性。同时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs能较好地同源靶向并特异性靶向结合B16F10细胞；在SDT条件下可产生ROS，进而引起不同程度的细胞凋亡。此外，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs具有生物安全性，瘤内注射后具有相对较强的靶向聚集能力，SDT条件下能够较好地抑制恶性黑色素瘤的生长。可用于肿瘤，特别是恶性黑色素瘤治疗，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs制备示意图，图中B16F10 membrane为黑色素瘤B16F10细胞膜；TiO2 NPs为TiO2纳米粒；DSPE-PEG2000-NH2为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物；PD-L1 Antibody为程序性死亡受体-配体1抗体；EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；TiO2@PEG/B16M NPs为仿生TiO2纳米粒；TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs为仿生靶向TiO2纳米粒；Activated PD-L1A为活化的PD-L1抗体。
图2为制备当天三种纳米粒的电位和粒径结果：A为三种纳米粒的电位比较(**P＜0.01，***P＜0.001，n＝3)；B为三种纳米粒的粒径比较(*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3)。
图3为制备后第1天和第3天各纳米粒的稳定性结果：左图为制备后第1天各纳米粒的稳定性；右图为制备后第3天各纳米粒的稳定性；图中A瓶中为TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs，B瓶中为TiO2@PEG/B16M NPs，C瓶中为TiO2@PEG NPs。
图4为SDS-PAGE检测结果，I为B16F10细胞膜，II为TiO2@PEG/B16M NPs。
图5为纳米粒抗体携载的FCM图，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的FITC荧光携载率高达92.39％，而TiO2@PEG/B16M NPs仅为0.16％。
图6为纳米粒的MFI分析结果，图中A为TiO2@PEG/B16M NPs，B为TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs，MFI为平均荧光强度，***P＜0.001，n＝3)。
图7为不同纳米粒不同浓度下细胞的存活率分析结果(Cell Viability：细胞存活率；ns：P＞0.05；n＝3)。
图8为不同纳米粒的FDA/PI荧光染色图(FDA：活细胞染色，PI：死细胞染色，Merge：FDA与PI合并后图像；×200倍，标尺为50μm)。
图9为不同纳米粒不同浓度的溶血试验结果图。
图10为无INF-γ刺激时各组B16F10细胞与纳米粒的靶向结合的CLSM图(FITC：PD-L1A间接免疫荧光染色，TRITC：细胞骨架染色，DAPI：细胞核染色，Merge：FITC、TRIC及DAPI三种染色图合并后图像；×200倍，标尺100μm)。
图11为INF-γ(200ng/mL)刺激后各组B16F10细胞与纳米粒的靶向结合的CLSM图(FITC：PD-L1A间接免疫荧光染色，TRITC：细胞骨架染色，DAPI：细胞核染色，Merge：FITC、TRITC及DAPI三种染色图合并后图像；×200倍，标尺100μm)。
图12为各组B16F10细胞与纳米粒的靶向结合的FCM图。
图13为各组FCM检测B16F10细胞与纳米粒靶向结合后的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度；*P＜0.05，***P＜0.001，n＝3)。
图14为不同肿瘤细胞对TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的摄取的CLSM图(DiO：绿色荧光染色后的纳米粒，TRITC为细胞骨架染色，DAPI为细胞核染色，Merge为DiO、TRITC及DAPI三种染色图合并后的图像；×400倍，标尺50μm)。
图15为CLSM下不同肿瘤细胞MFI分析结果(B16F10：黑色素瘤细胞，A549：肺癌细胞，A2780：卵巢癌细胞；**P＜0.01，***P＜0.001，n＝3)。
图16为各组B16F10细胞对不同纳米粒摄取的CLSM图(DiO：绿色荧光染色后的纳米粒，TRITC为细胞骨架染色，DAPI为细胞核染色，Merge为DiO、TRITC及DAPI三种染色图合并后的图像；×200，标尺100μm)。
图17为各组B16F10细胞对不同纳米粒摄取的FCM图。
图18为各组FCM检测B16F10细胞摄取不同纳米粒后的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度；*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3)。
图19为不同纳米粒SDT后细胞内的ROS检测结果(FCM：流式细胞术，FM：荧光显微镜；×200倍，标尺50μm)。
图20为FCM检测SDT后细胞内ROS的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度；ns：P＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001，n＝3)。
图21为不同US时间辐照后细胞内的ROS检测结果(FCM：流式细胞术，FM：荧光显微镜；×200倍，标尺50μm)。
图22为不同US时间辐照后细胞内ROS的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度；*P＜0.05，***P＜0.001，n＝3)。
图23为不同US强度辐照后的细胞内ROS检测结果(FCM：流式细胞术，FM：荧光显微镜；×200倍，标尺为50μm)。
图24为不同US强度辐照后细胞内ROS的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度；*P＜0.05，***P＜0.001，n＝3)。
图25为不同纳米粒浓度SDT后的细胞内ROS检测结果(FCM：流式细胞术，FM：荧光显微镜；×200倍，标尺为50μm)。
图26为不同纳米粒浓度SDT后细胞内ROS的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度，***P＜0.001，n＝3)。
图27为FCM检测不同纳米粒SDT后的细胞凋亡结果。
图28为FCM下不同纳米粒SDT后的细胞凋亡率分析结果(Apoptosis Rate：凋亡率；***P＜0.001，ns P＞0.05，n＝3)。
图29为FCM检测不同纳米粒浓度同一US条件辐照后的细胞凋亡率结果。
图30为不同纳米粒浓度同一US条件辐照后的细胞凋亡率分析结果(ApoptosisRate：凋亡率；***P＜0.001，n＝3)。
图31为B16F10移植瘤模型，黑色圆圈代表肿瘤。
图32为荷瘤小鼠注射后的活体荧光成像图。
图33为荷瘤小鼠注射后不同时间各组肿瘤的MFI分析结果(MFI：平均荧光强度；***P＜0.001，*P＜0.05；注射后1d TiO2@PEG NPs组与其他时间段比较，###P＜0.001；注射后1d TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组与其他时间段比较，▲▲▲P＜0.001；注射后1dTiO2@PEG/B16M NPs组与其他时间段比较，
Figure BDA0002647324910000051
n＝5)。
图34为注射后12d各组小鼠肿瘤及主要脏器的冰冻切片荧光显微镜图(Heart：心脏，Liver：肝脏，Spleen：脾脏，Lung：肺，Kidney：肾脏，Tumor：肿瘤；×400倍，标尺20μm)。
图35为各组小鼠肿瘤及肝脏内MFI分析结果(A：肝脏组织，B：肿瘤组织，MFI：平均荧光强度；*P＜0.05，***P＜0.001，n＝5)。
图36为小鼠体内SDT治疗流程图。
图37为不同治疗组小鼠肿瘤体积变化曲线(n＝5)。
图38为治疗后小鼠及肿瘤照片及超声影像图(Mouse：小鼠，Tumor：肿瘤，US：超声)
图39为不同治疗组小鼠TGI比较分析结果(TGI：肿瘤抑制率；*P＜0.5，***P＜0.001，n＝5)。
图40为不同治疗组小鼠体重变化曲线，(Bodyweight：体重；n＝5)。
图41为不同治疗组小鼠相对体重比分析结果(Relative body weight：相对体重比；ns P＞0.05，n＝5)。
图42为各组主要内脏器官及肿瘤组织的H&E染色图(Heart：心脏，Liver：肝脏，Spleen：脾脏，Lung：肺，Kidney：肾脏，Tumo：肿瘤；×400倍，标尺20μm)。
图43为不同治疗组肿瘤组织的TUNEL凋亡图(×200倍，标尺20μm)。
图44为不同治疗组肿瘤组织的凋亡MFI分析结果(ns P＞0.05，***P＜0.001，n＝5)。
图45为各组肿瘤内胶原沉积Masson染色图(×400倍，标尺20μm)。
图46为各组肿瘤内RCC分析(RCC：胶原相对含量；ns P＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001，n＝5)。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1、主要实验试剂及耗材
大鼠抗小鼠PD-L1单克隆抗体(Programmed death ligang-1 MonoclonalAntibody，PD-L1 A)：Ebioscience公司(美国)；异硫氰酸(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记羊抗大鼠IgG：Biolegend公司(美国)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG(2000)-NH2)：艾伟拓公司(中国)；二氧化钛纳米粒(Titanium dioxide nanoparticles，TiO2 NPs)：百灵威公司(中国)；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloridecrystalline，EDC)：Sigma-Aldrich公司(美国)；N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(N-hydroxysulfosuccinimide sodiumsalt，sulfo-NHS)：Sigma-Aldrich公司(美国)；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)：Biosharp公司(美国)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)：QuaCell公司(乌拉圭)；青霉素-链霉素溶液：Hyclone公司(美国)；胰酶(含乙二胺四乙酸，Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)：Millipore公司(美国)；细胞RPMI1640培养液：Sigma公司(美国)；干扰素-γ(Interferon-γ，INF-γ)：Peprotech公司(美国)；抗荧光淬灭封片液：碧云天公司(中国)；二辛可宁酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒：碧云天公司(中国)；蛋白预制胶：金斯瑞公司(中国)；全预染蛋白标准品：金斯瑞公司(中国)；三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris)：索莱宝公司(中国)；无EDTA蛋白酶抑制剂：碧云天公司(中国)；3-(N-吗啉基)丙磺酸(3-(N-morpholinyl)propanesulfonic acid，MOPS)电泳缓冲液：Genscript公司(美国)；2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonicacidhydrate，MES)：Amresco公司(美国)；蛋白上样缓冲液：金斯瑞公司(中国)；考马斯蓝蛋白胶极速染色液：赫兹生物科技有限公司(中国)；兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体：Abcam公司(英国)；兔抗小鼠黑色素瘤细胞膜相关抗原gp100抗体：Abcam公司(英国)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司(中国)；膜蛋白、核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒：生工生物工程股份有限公司(中国)；超敏化学发光检测试剂盒：碧云天(中国)；四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI)亲脂性膜染液：碧云天(中国)；9，10-二苯基蒽(9，10-Diphenylanthracene，DPA)：Aladdin公司(美国)；碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色试剂：索莱宝公司(中国)；二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)活细胞染色试剂：沪震实业(中国)；曲拉通X100：国药集团公司(中国)；细胞毒性(Cell Counting Kit-8，CCK-8)检测试剂盒：碧云天公司(中国)；Annexin V-FITC/PI Kit凋亡检测试剂盒：四正柏(中国)；活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)检测试剂盒：碧云天公司(中国)；4，6-联脒-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)细胞核染色试剂：碧云天公司(中国)；异硫氰四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)鬼笔环肽：索莱宝公司(中国)；4％多聚甲醛组织固定液：塞国生物(中国)；3，3′-二十八烷基氧杂碳菁高氯酸盐(3，3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，DiO)膜染液：碧云天公司(中国)；四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)亲脂性膜染液：碧云天(中国)；2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate，MES)：Sigma公司(美国)；戊巴比妥钠：哈灵生物科技公司(中国)；原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒：Promega公司(美国)；薇婷脱毛膏：Reckitt Benckiser(英国)；冰冻切片(Opti-mumcutting temperature compound，OCT)包埋剂：Sakura公司(美国)；刀片：Leica公司(德国)；游标卡尺：高致精密仪器有限公司(中国)；苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染料：Sigma-Aldrich公司(美国)；10％中性甲醛溶液：南京化学试剂股份有限公司(中国)；1，1-二十八烷基-3，3，3，3四甲基吲哚碳花青碘化物(1，1-dioctadecyl-3，3，3，3tetramethyl indori carbocyanine iodide，DiR)亲脂性膜染料：瓦兰生物科技有限公司(中国)；异氟烷：瑞沃德生命科技有限公司(中国)；中性树脂：汇源实业技贸公司(中国)；丽春红染液：拜力生物科技有限公司(中国)；磷钼酸染液：科龙化工试剂厂(中国)；苯胺蓝染液：西玛科技有限公司(中国)；碘伏：汇德科技有限公司(中国)；山羊血清：碧云天公司(中国)。
2、细胞株和实验动物
细胞株：小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞株购于中国科学院细胞库/干细胞库。肺癌细胞A549、卵巢癌细胞A2780均由四川大学华西公共实验室细胞平台提供。
实验动物：Sprague-Dawley(SD)雄性Balb/c小鼠60只，6～7周龄，体重(20.3±2.0)g，购于成都达硕实验动物有限公司。所有的动物实验方案均获得了四川大学动物伦理委员会的批准(No.2019157A)。饲养条件：四川大学实验动物中心SPF级无菌室中，25℃恒温，55％恒湿饲养，给予灭菌食物和饮水。
3、统计学分析
应用SPSS22.0统计软件，计量资料用
Figure BDA0002647324910000071
表示，数据符合正态分布且满足方差齐性时，两组间均数的比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；若不满足上述条件，则使用秩和检验，即两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，两两比较采用Nemenyi检验；均为双侧检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
实施例1、本发明载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒的制备
1、小鼠恶性黑色素瘤B16F10细胞膜提取
(1)收集4个T175细胞培养瓶中的B16F10细胞(约1×108个细胞)；
(2)1000g离心5min，PBS液洗涤2次；用1mL缓冲液重悬细胞。缓冲液的pH为7.2，以10mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris)为溶剂，加入MgCl2(100mM)0.1mL和100×无EDTA蛋白酶抑制剂(10μL)配制而成；
(3)冰浴下用超声细胞破碎仪(功率300W，频率21KHz，50％占空比)破碎细胞30min；4℃低温离心(4000g)10min后收集上清；
(4)上清液再4℃低温离心(16000g)30min，弃上清后用PBS洗涤2次；
(5)用1mLPBS超声重悬5min(功率300W，频率21KHz，50％占空比)，得小鼠恶性黑色素瘤B16F10细胞膜；
(6)按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书流程检测膜蛋白浓度；
(7)根据膜蛋白浓度将细胞膜稀释成1mg/mL，再进行分装，置于-80℃或-20℃冰箱保存后备用。
标准蛋白曲线线性回归方程为Y＝1.88X+0.191，相关系数R2＝0.992：膜蛋白浓度为1.135mg/mL。根据蛋白质约占膜总量的40％推算出膜的浓度为2.837mg/mL，取一半细胞膜液用于SDS-PAGE，一半稀释成1mg/mL进行分装冻存用于后续纳米粒的制备。
2、普通TiO2纳米粒(TiO2@PEG NPs)的制备
(1)称取2mg TiO2纳米粒盛于5mL EP管中，加入2mL PBS液，制备成TiO2纳米粒液，即TiO2 NPs(1mg/mL)，超声清洗机中超声分散(功率162W，频率40KHz)10min；
(2)称取1mg DSPE-PEG2000-NH2溶于1mL PBS液，制备成DSPE-PEG液(1mg/mL)；
(3)分别取500μL TiO2纳米粒液及500μLDSPE-PEG液(1∶1体积比)于2mL EP管中，超声清洗机超声分散(功率162W，频率40KHz)30min，分散期间不断混匀，得普通TiO2纳米粒(TiO2@PEG NPs)；
(4)置于4℃冰箱内保存备用。
3、仿生TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M NPs)的制备
(1)称取2mg TiO2纳米粒盛于5mL EP管中，加入PBS液2mL，制备成TiO2纳米粒液，即TiO2 NPs(1mg/mL)，超声清洗机中超声分散(功率162W，频率40KHz)10min；
(2)称取1mg DSPE-PEG2000-NH2溶于1mL PBS液，制备成DSPE-PEG液(1mg/mL)；
(3)1000μL TiO2纳米粒液(1mg/mL)置于5mL EP管中，依次加入500μL DSPE-PEG液(1mg/mL)及500μL B16F10细胞膜液(1mg/mL)，三种液体的体积比为2∶1∶1；
(4)超声分散(功率162W，频率40KHz)30min，分散期间不断混匀；
(5)4℃低温下离心(3699g)10min，弃上清液，冻干，即得仿生TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M NPs)；
(6)在所得仿生TiO2纳米粒中加入PBS液重悬，得到浓度为1mg/mL的仿生TiO2纳米粒，置于4℃冰箱内保存。
4、仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)的制备
TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs制备示意图如图1所示。
(1)活化抗体：大鼠抗小鼠PD-L1单克隆抗体(PD-L1A)原液(0.5mg/mL)10μL溶于MES缓冲液(0.1M，pH 5.0)1mL，稀释比例为1∶100；加入EDC 0.5mg，NHS 0.6mg，低温冰浴摇床反应1h；
(2)将活化后抗体500μL加入到1000μL TiO2@PEG/B16M NPs(1mg/mL)中，冰浴搅拌过夜；离心(3699g)10min，冻干，得到仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)；
(3)在所得仿生靶向TiO2纳米粒中加入PBS液重悬，得到浓度为1mg/mL仿生靶向TiO2纳米粒，置于4℃冰箱内保存。
以下通过具体试验例证明本发明有益效果。
试验例中的细胞膜、TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs均是按照实施例1所述方法制备的小鼠恶性黑色素瘤B16F10细胞膜、TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。TiO2 NPs为原料二氧化钛纳米粒。
试验例1、本发明载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒的理化性质检测
一、纳米粒的粒径与电位检测
1、试验方法
按照实施例1所述方法制备TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs，取10～20μL纳米粒原液进行稀释，采用布鲁克纳米粒径电位分析仪分别检测以上三种纳米粒的粒径与电位；同时在制备1天和3天后分别对以上纳米粒进行观察。
2、试验结果
使用布鲁克粒径电位仪同时测定三种纳米粒的粒径(Size)、电位(Zetapotential)，结果如表1和图2所示。制备当天TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs粒径分别为(651.27±90.13)nm，(372.02±36.84)nm，(489.88±137.30)nm，差异具有统计学意义(P＜0.05)，TiO2@PEG NPs粒径最大；TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs电位分别为(-9.75±1.89)mv，(-17.27±0.56)mv，(-38.79±0.38)mv，组间差异具有统计学意义(P＜0.01)，TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs电位最大。
表1.三种纳米粒制备当天的粒径、电位
Figure BDA0002647324910000081
制备后第1天，TiO2@PEG NPs纳米粒可见少许液体分层，第3天可见完全沉淀；TiO2@PEG/B16M NPs制备后第1天未见液体分层，第3天可见大部分沉淀；TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs制备后第1天未见液体分层，第3天可见部分分层及沉淀(图3)。实验结果表明：TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs稳定性相对较佳。
二、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)检测
1、试验方法
(1)处理样品：(1)分别取20μL浓缩后纳米粒样品(TiO2@PEG/B16M NPs，约含蛋白质23μg)及20μL细胞膜样品(约含蛋白质23μg)，再各自加入7μL 4×蛋白上样缓冲液后混匀，95℃处理5min使蛋白变性；
(2)安装样品槽：将预制胶按照正确方法安装进样品槽内，短面朝里，并用10％MOPS电泳缓冲液检查是否漏液，并且检查正负极是否安装正确；
(3)将处理之后的样品加入到上样槽里，并加入5μL标准蛋白。在外槽加入约1/3MOPS缓冲液，内槽加满；
(4)跑胶：盖上盖子，设置跑胶参数：电流250mA，电压先100V，待10min后再调成200V。随时观察蛋白位置，当蛋白接近预制胶底部时停止；
(5)取胶：用凝胶铲小心将预制凝胶取出，并保持凝胶润湿状态；
(6)考马斯亮蓝快速染色：蛋白胶用超纯水洗一次除去残余缓冲液，浸泡在染色液中，摇床摇动至过夜；
(7)染色结束后，将蛋白胶取出，化学发光成像仪进行拍照。
2、试验结果
SDS-PAGE检测TiO2@PEG/B16M NPs的膜蛋白表达与黑色素瘤细胞膜的膜蛋白表达较一致(图4)，表明黑色素瘤细胞膜成功包覆了TiO2@PEG/B16M NPs。
三、流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测抗体负载率
1、试验方法
(1)分别取50μL制备好的TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs于EP管中；
(2)再分别加入1∶100稀释浓度的FITC标记的羊抗大鼠IgG 200μL，37℃，避光孵育30min，离心(3699g，10min)弃上清，PBS重悬，重复3次；
(3)FCM进行检测。
2、试验结果
结果如图5，检测的500000个载PD-L1抗体仿生TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs)中，FITC荧光携载率高达到92.39％，而单纯仿生纳米粒(TiO2@PEG/B16M NPs)未与FITC结合，荧光携载率趋近于0。TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs荧光携载率大于TiO2@PEG/B16MNPs。如图6所示，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs平均荧光强度(Mean fluorescenceintensity，MFI)大于TiO2@PEG/B16M NPs(25123.90±720.84 vs 107.13±21.51，P＜0.01)。说明TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs负载抗体成功。
上述试验结果说明本发明通过超声分散法成功制备了仿生TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M NPs)，采用碳二亚胺法成功制备了载PD-L1A仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)，该纳米粒粒径偏小，同时抗体携载率较高。
试验例2、本发明载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒声动力治疗恶性黑色素瘤的体外细胞实验
一、生物安全性研究
(一)CCK-8细胞毒性检测
1、试验方法
分组：
对照孔①：培养基+CCK-8；
对照孔②：细胞+培养基+CCK-8；
对照孔③：不同稀释倍数TiO2@PEG NPs或TiO2@PEG/B16M NPs或TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(浓度分别为0.004mg/mL，0.02mg/mL，2mg/mL)+培养基+CCK-8；
实验孔：不同浓度TiO2@PEG NPs或TiO2@PEG/B16M NPs或TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs(0.004mg/mL，0.02mg/mL，2mg/mL)+细胞+培养基+CCK-8；均复孔3个。
步骤：
(1)将含B16F10细胞的混悬液接种于96孔板内(对照孔①及对照孔③不加)，每孔约200μL(细胞数约4000个)；放入孵箱培养24h；
(2)制备不同稀释倍数，即不同浓度(0.004mg/mL，0.02mg/mL，2mg/mL)TiO2@PEGNPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs，分别取10μL不同浓度的纳米粒与190μL细胞培养液混合均匀制备成含不同浓度纳米粒的细胞培养液(根据实际具体用量制备含纳米粒的细胞培养液的总量)，吸出培养基，按分组分别加入含不同浓度TiO2@PEG NPs或TiO2@PEG/B16M NPs或TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs细胞培养液200μL培养24h，对照孔①及②加新鲜培养基；
(3)加入CCK-8液10μL，避光孵育1h；
(4)用酶联免疫监测仪在450nm波长处，测定各孔的光密度值(Optical density，OD)并记录结果；
(5)计算细胞存活率：OD(实验孔-对照孔③)/(对照孔②-对照孔①)×100％。
2、试验结果
细胞的存活率接近1可认为无细胞毒性，本实验CCK-8检测结果(图7)显示不同浓度(0.004mg/mL，0.02mg/mL，2mg/mL)TiO2@PEG NPs对B16F10细胞作用24h后，细胞的平均存活率均接近1，分别为1.10±0.05，1.06±0.04，1.13±0.02，各组差异无统计学意义(P＞0.05)；不同浓度(0.004mg/mL，0.02mg/mL，2mg/mL)TiO2@PEG/B16M NPs对B16F10细胞作用24h后，细胞的平均存活率均接近1，分别为1.05±0.04，1.08±0.07，1.09±0.06，各组差异无统计学意义(P＞0.05)；不同浓度(0.004mg/mL，0.02mg/mL，2mg/mL)TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs对B16F10细胞作用24h后，细胞的平均存活率均接近1，分别为1.09±0.06，1.10±0.08，1.05±0.04，各组差异无统计学意义(P＞0.05)。说明各组TiO2纳米粒均无细胞毒性。
(二)活/死细胞荧光(Fluorescein diacetate/Propidium iodide，FDA/PI)染色
1、试验方法
实验分组：共分为4组，每组复孔3个
①对照组：B16F10+培养基；
②实验组：B16F10+TiO2@PEG NPs；
③实验组：B16F10+TiO2@PEG/B16M NPs；
④实验组：B16F10+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
步骤：
(1)将含B16F10细胞的混悬液接种于96孔板内，每孔约200μL(细胞数约4000个)，培养24h；
(2)分别取10μL不同纳米粒(TiO2@PEG NPS，TiO2@PEG/B16M NPs，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)与190μL细胞培养液混合均匀制备成含不同纳米粒的细胞培养液(根据实际具体用量制备含纳米粒的细胞培养液的总量)，吸出培养基，对照孔不加纳米粒，加入200μL新鲜培养基，而其余孔分别加入含不同纳米粒的细胞培养液200μL(均0.1mg/mL)，培养24h；
(3)吸出培养液后，加入PBS 200μL洗涤两次，每孔缓慢加入FDA液100μL(10μg/mL)，避光37℃孵育5min，再每孔加入PI液100μL(20μg/mL)，避光37℃孵育5min；
(4)缓慢吸出染液，每孔加入PBS 200μL溶液洗涤3次，每次2～3min；
(5)倒置荧光显微镜下观察。
2、试验结果
FDA为活细胞染色，呈绿色，PI为死细胞染色，呈红色；荧光显微镜(图8)显示TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs原液与B16F10细胞共孵育24h后，活细胞的绿色荧光较多，死细胞的红色荧光相对较少。试验结果说明：从形态学表明各组TiO2纳米粒均无明显细胞毒性。
(三)溶血实验
1、试验方法
(1)红细胞纯化：取小鼠1mL全血，加入2mL生理盐水，离心(411g，15min)，弃上清，2mL生理盐水重悬，离心(500g，10min)，弃上清，2mL生理盐水重悬，重复离心3～4次，直至上清液较为清亮为止，根据沉淀体积加入2倍于沉淀体积的生理盐水重悬，得到稀释后红细胞悬液；
(2)分组：
阴性组：稀释后红细胞0.1mL+生理盐水5mL；
阳性组：稀释后红细胞0.1mL+纯水5mL；
不同浓度的TiO2@PEG NPS组：①稀释后红细胞0.1mL+生理盐水5mL+TiO2@PEG NPS(0.2mg/mL)0.25mL；②稀释后红细胞0.1mL+生理盐水5mL+TiO2@PEG NPS(0.6mg/mL)0.25mL；③稀释后红细胞0.1mL+生理盐水5mL+TiO2@PEG NPS(1.2mg/mL)0.25mL；④稀释后红细胞0.1mL+生理盐水5mL+TiO2@PEG NPS(2.0mg/mL)0.25mL；复管3个；
不同浓度的TiO2@PEG/B16M NPS组：同TiO2@PEG NPS分组一样，按浓度0.2mg/mL、0.6mg/mL、1.2mg/mL、2.0mg/mL分为4组；复管3个；
不同浓度的TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPS组：同TiO2@PEG NPS分组一样，按浓度0.2mg/mL、0.6mg/mL、1.2mg/mL、2.0mg/mL分为4组，复管3个；
(3)按分组加入相应液体，加完后置入37℃水浴锅中加热1h，离心(1200g，5min)；
(4)取所有组的上清液，采用紫外分光光度计进行检测，波长设置为545nm，测量并记录结果；
(5)溶血率＝(样品OD值-阴性对照组OD值)/(阳性对照组OD值-阴性对照组OD值)×100％。
2、试验结果
试验结果(图9和表2)表明：不同浓度TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的溶血率均＜5％。试验结果说明：各组TiO2纳米粒血液相容性及生物安全性良好。
表2.不同纳米粒不同浓度的溶血率比较
Figure BDA0002647324910000111
二、纳米粒与B16F10的体外特异性靶向结合(间接免疫荧光染色)
(一)CLSM检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①B16F10+INF-γ(0ng/mL)+PBS；
②B16F10+INF-γ(0ng/mL)+TiO2@PEG NPs；
③B16F10+INF-γ(0ng/mL)+TiO2@PEG/B16M NPs；
④B16F10+INF-γ(0ng/mL)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
⑤B16F10+INF-γ(200ng/mL)+PBS；
⑥B16F10+INF-γ(200ng/mL)+TiO2@PEG NPs；
⑦B16F10+INF-γ(200ng/mL)+TiO2@PEG/B16M NPs；
⑧B16F10+INF-γ(200ng/mL)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
步骤：
(1)接种细胞于24孔板(每孔500μL约3000个细胞)，培养24h；
(2)每孔加入不同浓度INF-γ150μL活化细胞，培养24h；吸出培养基，PBS清洗2～3次；
(3)加入4％多聚甲醛1mL固定10min，PBS清洗2-3次；
(4)均匀加入含不同纳米粒100μL(2mg/mL)的纳米粒液，对照组(PBS组)中加PBS液100μL，37℃孵育2h，PBS清洗2～3次；
(5)加入FITC标记的羊抗大鼠IgG(1∶200稀释)100μL，37℃避光孵育1h，PBS清洗2～3次；
(6)加入0.5％曲拉通×100 500μL，作用5min，PBS清洗2～3次；
(7)加入TRITC标记鬼笔环肽300μL(100nM)染色30min，PBS清洗2～3次；
(8)加入DAPI 500μL(5μg/mL)，染色5min，PBS清洗2～3次；
(9)抗荧光淬灭剂封片，倒置CLSM观察。
2、试验结果
无INF-γ刺激(0ng/mL)时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组B16F10细胞表面及周围可见星点状FITC绿色荧光，TiO2@PEG/B16M NPs组、TiO2@PEG NPs组及对照组(PBS组)几乎无绿色荧光(图10)；高浓度INF-γ刺激(200ng/mL)时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组B16F10细胞表面及周围可见大量点、片状绿色荧光，TiO2@PEG/B16M NPs组，TiO2@PEG NPs组及对照组(PBS组)几乎无绿色荧光(图11)。试验结果说明：无论INF-γ的浓度多高，仅TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组具有特异性靶向黑色素瘤细胞，并且结合率与INF-γ的浓度有关，浓度越大，与细胞的结合率越高。
(二)FCM检测
1、试验方法
分组：与“二、纳米粒与B16F10的体外特异性靶向结合中的(一)CLSM检测”的分组一致，共分为8组，每组复孔3个。
步骤：
(1)接种细胞于12孔板(每孔1.5mL约1×105个细胞)，培养24h；
(2)每孔加入不同浓度INF-γ150μL活化细胞，培养24h；吸出培养基，PBS清洗2～3次，胰酶消化细胞，离心(233g，4min)，冰PBS液500μL重悬；
(3)按分组加入不同纳米粒100μL(2mg/mL)，冰上孵育1h，离心(233g，4min)，冰PBS500μL重悬；
(4)加入FITC标记的羊抗大鼠IgG(1：200稀释)100μL，冰上避光孵育40min，离心(233g，4min)，冰PBS 500μL重悬，重复2-3次；
(5)FCM检测。
2、试验结果
FCM检测结果与CLSM观察结果较一致，当无INF-γ刺激B16F10时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组细胞的荧光携载率较低(24.47％)，而TiO2@PEG/B16M NPs组、TiO2@PEG NPs组及对照组的细胞几乎无荧光携载；高浓度1NF-γ刺激(200ng/mL)时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组细胞的携载率最大，最高可达99.46％，其余三组细胞几乎无荧光携载(图12)。各组流式检测的MFI分析显示，无INF-γ刺激时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的荧光强度高于其余3组，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)；高浓度INF-γ刺激时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的荧光强度明显高于其余3组，组间差异具有统计学意义(P＜0.001)，并且高浓度INF-γ刺激后TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的荧光强度明显高于无INF-γ刺激时的荧光强度，组间差异具有统计学意义(P＜0.001)(图13)。
三、不同肿瘤细胞对相同纳米粒的摄取
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①B16F10+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
②A549+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
③A2780+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。
步骤：
(1)复苏黑色素细胞B16F10、肺癌细胞A549及卵巢癌细胞A2780；接种细胞于35mm共聚焦培养皿(玻底14mm)中(每孔1.5mL约10000个细胞)，培养24h；
(2)吸出培养基，加入含DiO标记TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的培养基1mL(取2mg/mL DiO标记纳米粒100μL加入900μL培养基混匀，即0.2mg/mL)，孵育12h，PBS清洗2～3次；
(3)吸出培养基，PBS清洗2～3次，加入4％多聚甲醛1mL固定10min，PBS清洗2-3次；
(4)加入0.5％曲拉通×100 600μL，作用5min，PBS清洗2～3次；
(5)加入TRITC标记鬼笔环肽600μL(100nM)染色30min，PBS清洗2～3次；
(6)加入DAPI 600μL(5μg/mL)，染色5min，PBS清洗2～3次；
(7)抗荧光淬灭剂封片，正置CLSM观察，使用Image J软件进行荧光强度值半定量分析。
2、试验结果
CLSM结果如图14，显示黑色素细胞B16F10吞噬的绿色纳米粒荧光较肺癌细胞A549及卵巢癌细胞A2780两组细胞多，各组MFI差异有统计学意义(P＜0.01)(图15)。说明纳米粒具有一定的同源识别并靶向同源细胞的能力，即本发明TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs可靶向黑色素细胞B16F10。
四、B16F10对不同纳米粒的摄取(直接荧光染色)
(一)CLSM检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①B16F10+PBS；
②B16F10+TiO2@PEG NPs；
③B16F10+TiO2@PEG/B16M NPs；
④B16F10+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。
步骤：
(1)复苏B16F10细胞，接种细胞于24孔板(每孔500μL约3000个细胞)，培养24h：
(2)每孔加入INF-γ(200ng/mL)150μL活化细胞，培养12h；吸出培养基；
(3)加入含DiO标记纳米粒的培养基500μL(取2mg/mL DiO标记纳米粒80μL加入420μL培养基混匀，即0.32mg/mL)，孵育12h，PBS清洗2～3次；
(4)吸出培养基，PBS清洗2～3次，加入4％多聚甲醛1mL固定10min，PBS清洗2-3次；
(5)加入500μL 0.5％曲拉通×100，作用5min，PBS清洗2～3次；
(6)加入TRITC标记鬼笔环肽300μL(100nM)染色30min，PBS清洗2～3次；
(7)加入DAPI 500μL(5μg/mL)，染色5min，PBS清洗2～3次；
(8)倒置CLSM观察。
2、试验结果
CLSM结果如图16，DiO代表经DiO膜染色后的纳米粒，呈绿色，TRITC为细胞骨架染色，呈红色，DAPI为细胞核染色，呈蓝色，Merge为DiO、TRITC及DAPI三种染色图合并后的图像。CLSM显示TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组及TiO2@PEG/B16M NPs组均可见较多绿色荧光，前者的绿色荧光较后者多，合并后呈橙黄色，而TiO2@PEG NPs组有少量绿色荧光，对照组(PBS组)无绿色荧光。试验结果说明：包覆细胞膜的纳米粒与细胞均有结合，具有一定的同源识别及靶向性，而TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的摄取量最大，即TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs对细胞的靶向性最好。
(二)FCM检测
1、试验方法
分组：与“四、B16F10对不同纳米粒的摄取中的(一)CLSM检测”的分组一致，共分为4组，每组复孔3个。
步骤：
(1)接种细胞于12孔板(每孔1.5mL约1×105个细胞)，培养24h
(2)每孔加入INF-γ(200ng/mL)150μL活化细胞，培养12h；吸出培养基，加入含DiI标记纳米粒的培养基1.0mL(取2mg/mL DiI标记纳米粒100μL加入900μL培养基混匀，即0.2mg/mL)，孵育12h；
(3)PBS清洗2～3次，胰酶消化细胞，离心(233g，4min)，冰PBS液500μL重悬，重复2～3次；
(4)FCM检测。
2、试验结果
FCM检测结果显示TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的红色荧光携载率最大，最高达90.12％，TiO2@PEG/B16M NPs组次之，可达50.01％，而TiO2@PEG NPs组有少量荧光携载(32.90％)，对照组几乎无荧光携载(0.10％)，组间MFI比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图17和18)。
五、超声(Ultrasound，US)辐照后B16F10细胞ROS检测
(一)不同纳米粒在相同SDT条件下ROS的检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①PBS；
②US；
③TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
④US+TiO2@PEG NPs；
⑤US+TiO2@PEG/B16M NPs；
⑥US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。
步骤：
(1)接种细胞于24孔板(每孔500μL约10000个细胞，孵育12h；
(2)每孔加入100μL INF-γ(200ng/mL)活化细胞24h；
(3)吸出培养基，PBS组及US组加入新鲜培养基500μL，其余组加入含不同纳米粒的细胞培养基(按2mg/mL纳米粒100μL加入400μL培养基的比例进行配制)，每孔500μL，孵育24h，PBS洗2～3次；
(4)处理细胞，按上述分组进行细胞处理，所需超声条件为强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间60s，占空比50％；阳性试剂孔吸出300μL培养基后加入双氧水阳性试剂600μL(50μg/mL)，处理完细胞后孵育1h，无血清培养基洗1次；
(5)加入荧光标记探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，每孔600μL(10μM)，孵育40min；PBS洗3次；
(6)观察与检测：荧光显微镜可直接进行观察；若进行流式细胞检测，需胰酶消化、离心(233g，4min)、PBS重悬为300μL后再上样检测。
2、试验结果
荧光显微镜(Fluorescence microscopy，FM)结果显示单纯US组(强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间60s，占空比50％)ROS绿色荧光最少，US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的绿色荧光最多，US+TiO2@PEG/B16M NPs组次之，US+TiO2@PEG NPs组较US+TiO2@PEG/B16M NPs组少，而PBS对照组和单纯TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组几乎无绿色荧光(图19左侧)。
FCM检测结果与FM结果较一致，细胞的绿色荧光携载率由大到小依次为US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(25.24％)＞US+TiO2@PEG/B16M NPs组(18.34％)＞US+TiO2@PEGNPs组(14.48％)＞单纯US组(12.86％)，而PBS对照组(0.97％)和单纯TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(2.56％)几乎无绿色荧光携载(图19右侧)。组间MFI比较，对照组和单纯TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组差异无统计学意义(16051.27±2191.82 vs 140802.13±3784.18，P＞0.05)，US联合纳米粒组组内MFI比较，US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(103391.90±7545.70)＞US+TiO2@PEG/B16M NPs组(80918.77±4009.02)＞US+TiO2@PEGNPs组(48130.47±936.66)＞单纯US组(37250.20±877.90)，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图20)。
(二)相同纳米粒在不同US时间下ROS的检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①US(时间60s)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
②US(时间90s)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
③US(时间120s)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
④US(时间150s)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。
步骤：
除第(3)步吸出培养基，加入含TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的细胞培养基(按2mg/mL纳米粒100μL加入400μL培养基的比例进行配制)，每孔500μL，孵育24h，及第(4)步超声处理细胞的条件(强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间分别为60s，90s，120s，150s，占空比50％)不同以外，其余步骤均同“五、超声(Ultrasound，US)辐照后B16F10细胞ROS检测中的(一)”。
2、试验结果
FM结果及FCM检测显示：当其他超声条件不变(强度0.4W/em2，频率1MHz，占空比50％)，随着US辐照时间延长，ROS绿色荧光逐渐增加(图21)。60s组，90s组，120s组及150s组的MFI分别为40875.57±570.17、50757.60±58.62、51727.67±367.94、59656.03±287.12，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)(图22)。
(三)相同纳米粒在不同US强度下ROS的检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①US(强度0.4W/cm2)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
②US(强度0.6W/cm2)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
③US(强度0.8W/cm2)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
④US(强度1.0W/cm2)+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。
步骤：
除第(3)步吸出培养基，加入含TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的细胞培养基(按2mg/mL纳米粒100μL加入400μL培养基的比例进行配制)，每孔500μL，孵育24h，及第(4)步超声处理细胞的条件(强度分别为0.4W/cm2，0.6W/cm2，0.8W/cm2，1.0W/cm2，频率1MHz，时间60s，占空比50％)不同以外，其余步骤均同“五、超声(Ultrasound，US)辐照后B16F10细胞ROS检测中的(一)”。
2、试验结果
FM及FCM检测显示：当其他超声条件不变(频率1MHz，时间60s，占空比50％)时，随着US强度增加，ROS绿色荧光逐渐增加(图23)，0.4W/cm2组，0.6W/cm2组，0.8W/cm2组及1.0W/cm2组MFI分别为79435.03±3510.02，95312.67±3338.37，122402.50±8547.42，212119.86±3107.06，组间差异有显著统计学意义(P＜0.05)(图24)。
(四)不同纳米粒浓度相同SDT条件下ROS的检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(2mg/mL)；
②US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(0.04mg/mL)；
③US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(0.004mg/mL)。
步骤：
除第(3)步配置含不同浓度TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的细胞培养基，按取0.004mg/mL，0.04mg/mL，2mg/mL纳米粒各100μL并分别加入400μL培养基的比例进行配制；吸出培养基，每孔加入含不同浓度TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的细胞培养基500μL，孵育24h，及第(4)步超声处理细胞的条件(强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间60s，占空比50％)不同以外，其余步骤均同“五、超声(Ultrasound，US)辐照后B16F10细胞ROS检测中的(一)”。
2、试验结果
FM及FCM检测显示：当超声条件不变时(强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间60s，占空比50％)，随着纳米粒浓度增加，ROS绿色荧光逐渐增加(图25)，0.004mg/mL组，0.04mg/mL组，2mg/mL组MFI分别为66810.3333±1025.65，83130.70±1793.04，108261.13±3041.08，组间差异有统计学意义(P＜0.001)(图26)。
六、体外SDT介导后B16F10细胞凋亡检测
(一)不同纳米粒在相同SDT条件下的细胞凋亡检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①PBS；
②TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
③US；
④US+TiO2@PEG NPs；
⑤US+TiO2@PEG/B16M NPs；
⑥US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs。
步骤：
(1)接种细胞于12孔板，每孔1.5mL(含1×105个细胞)，孵育12h；
(2)每孔150μL INF-γ(200ng/mL)活化细胞24h；
(3)吸出培养基，按分组每孔加入含不同纳米粒的细胞培养基1.5mL(按2mg/mL纳米粒100μL加入1.5mL培养基的比例进行配制)，孵育24h；
(4)PBS洗3次以清除未结合或未被细胞摄取的纳米粒；
(5)除PBS组及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组不用超声处理外，其余组按超声条件(强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间90s，占空比50％)处理细胞；
(6)无EDTA胰酶消化细胞，离心(233g，4min)，500μL冰PBS重悬，再离心(233g，4min)，加入稀释后结合缓冲液100μL重悬；
(7)加入Annex V FITC染液5μL，避光冰上孵育5min；
(8)加PI(20ug/mL)染液每管10μL，上样流式检测。
2、试验结果
FCM结果显示，当超声条件不变时(强度0.4W/cm2，频率1MHz，时间90s，占空比50％)，细胞凋亡率由大到小依次为US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(29.87％±0.26％)＞US+TiO2@PEG/B16M NPs组(23.97％±0.23％)＞US+TiO2@PEG NPs组(21.01％±0.28％)＞单纯US组(14.90％±0.46％)，各组的平均凋亡率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，而PBS对照组及单纯TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组细胞凋亡率较低，凋亡率分别为5.45％±0.99％、6.30％±0.60％，差异无统计学意义(P＞0.05)，US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组、US+TiO2@PEG/B16M NPs组、US+TiO2@PEG NPs组及单纯US组分别与对照组比较，组间差异具有统计学意义(P＜0.001)(图27和图28)。
(二)不同纳米粒浓度相同SDT条件下的细胞凋亡检测
1、试验方法
分组(每组复孔3个)：
①US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(0.004mg/mL)；
②US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(0.04mg/mL)；
③US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs(2mg/mL)。
步骤：
除第(3)步配置含不同浓度TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的细胞培养基，按取0.004mg/mL，0.04mg/mL，2mg/mL纳米粒各100μL并分别加入1.5mL培养基的比例进行配制；吸出培养基，每孔加入含不同浓度TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的细胞培养基1.5mL，孵育24h，及第(5)步超声处理细胞的条件(强度1.5W/cm2，频率1MHz，时间90s，占空比50％)不同以外，其余步骤均同“六、体外SDT介导后B16F10细胞凋亡检测中的(一)”。
2、试验结果
FCM结果显示，当超声条件不变时(强度1.5W/cm2，频率1MHz，90s，50％占空比)，随着纳米粒浓度增加，细胞凋亡率逐渐增加，0.004mg/mL、0.04mg/mL及2mg/mL纳米粒组细胞凋亡率分别为17.39％±0.53％，26.39±0.51％，51.93％±1.55％，差异有统计学意义(P＜0.001)(图29和30)。
上述试验结果说明：恶性黑色素瘤B16F10细胞在INF-γ因子的刺激下可高表达PD-L1配体；本发明载PD-L1A仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)无明显细胞毒性，具有同源靶向及特异性靶向B16F10细胞的能力，并在一定浓度纳米粒、一定超声强度以及辐照时间的声动力条件下产生ROS，进而促进细胞凋亡，从而达到抑制黑色素瘤B16F10细胞生长的效果。本发明载PD-L1A仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)在一定浓度范围内具有生物安全性，为体内局部或静脉注射提供安全性理论基础。
试验例3、载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒声动力治疗恶性黑色素瘤的体内实验
一、小鼠B16F10移植瘤模型的建立
小鼠背部脱毛膏脱毛，碘伏消毒，用细针在背部近右前肢皮下层注入呈对数生长的B16F10细胞100μL(约7x 106个/只)，形成均一大小的皮丘，拔除针头后用无菌棉签按住注射点20s，保证细胞液无漏出后再将小鼠放入笼内饲养观察。
接种后约2d出现小黑点，5～7d成瘤，瘤体呈黑色，直径约5～8mm(图31)，用于后续实验。
二、小鼠B16F10移植瘤体内靶向性初步探索
(一)活体荧光成像
1、试验方法
实验分组(每组5只)：
①TiO2@PEG NPs组；
②TiO2@PEG/B16M NPs组；
③TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组。
步骤：
(1)将DiR工作液(0.3mg/mL)50μL分别加入上述各组纳米粒中染色30min，离心，重悬分别制备成DiR标记的TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
(2)取50μL DiR标记的各组纳米粒(2mg/mL)分别注入荷瘤小鼠瘤内，注射后即刻、1d、3d、6d、9d、12d后，将小鼠用异氟烷气体麻醉后置入活体荧光成像仪中，摆好体位，以748nm作为激发光波长，以780nm作为发射光波长，固定每次曝光时间为15s，进行活体荧光成像；
(3)Spectrum软件分析各组纳米粒平均荧光强度值(Mean fluorescenceintensity，MFI)。
2、试验结果
瘤内注射纳米粒后即刻观察，各组荷瘤小鼠的肿瘤内均可见荧光信号，其平均荧光强度值差异无统计学意义(P＞0.05)，荧光信号于注射1d后均达到峰值，第3d开始逐渐减弱并可见荧光信号向肿瘤周围扩散，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的荧光信号扩散相对较慢，TiO2@PEG NPs组的荧光信号扩散相对较快，TiO2@PEG/B16M NPs组扩散速度居中，直到观察第12d，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组仍可见相对较强的荧光信号(图32)。注射后不同时间点各组纳米粒在肿瘤内的MFI分析比较如图33，结果显示，注射后即刻各组肿瘤内MFI均较低且无明显差异，注射后1d各组肿瘤MFI均明显增高，其中TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的肿瘤MFI最高，与其他两组的MFI比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，各组注射后1d的肿瘤MFI与各自其他时间点的MFI比较，差异均有统计学意义(P均＜0.05)，上述结果表明TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs与肿瘤的结合能力较其他两种纳米粒强，致使瘤内纳米粒高浓度聚集，为后期肿瘤局部SDT治疗奠定基础。
(二)冰冻切片
1、试验方法
实验分组(每组5只)：
①TiO2@PEG NPs组；
②TiO2@PEG/B16M NPs组；
③TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组。
步骤：
(1)将DiO工作液(1mg/mL)15μL分别加入各组纳米粒中染色30min，离心，重悬分别制成DiO标记的TiO2@PEG NPs、TiO2@PEG/B16M NPs及TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs；
(2)取50μL DiO标记的各组纳米粒(2mg/mL)分别局部注入荷瘤小鼠肿瘤内，注射后12d，对小鼠进行麻醉后处死，完整取下肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏，分别置入冻存管后并立即放入液氮罐内保存；
(3)取出肿瘤及内脏，加入OCT包埋剂包埋并快速冷冻；
(4)采用冷冻切片机切片，将组织切成4μm薄片于粘附载玻片上；
(5)用10μL DAPI染细胞核10min，PBS洗3次，吸出多余液体；
(6)抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。
2、试验结果
观察第12d后，各组的肿瘤冰冻切片观察与活体成像结果基本一致，即TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组荧光信号相对较强，TiO2@PEG/B16M NPs组次之，TiO2@PEG NPs组偏低(图34)，而主要脏器的冰冻切片发现仅有肝脏组织切片发现纳米粒绿色荧光信号，且TiO2@PEG NPs组相对最多，而TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组相对较少，各组肿瘤及肝脏的MFI分析如图35，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。
三、小鼠B16F10移植瘤体内局部SDT抗肿瘤实验研究
1、试验方法
1.1实验分组(每组5只)
①对照组(NS组)；
②US组；
③TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组；
④US+TiO2@PEG NPs组；
⑤US+TiO2@PEG/B16M NPs组；
⑥US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组。
1.2实验步骤
(1)荷瘤小鼠采用0.3％戊巴比妥钠溶液按照1mL/100g的剂量行腹腔注射麻醉；
(2)按分组分别局部瘤内注入纳米粒50μL(2mg/mL)并按不同方式进行处理，超声条件为(强度3W/cm2，频率1MHz，占空比20％，5min)；
(3)在保证正常饮食的情况下，每隔三天对小鼠局部瘤内注射1次纳米粒后并按分组进行超声处理，共连续治疗6次；
(4)固定时间点测量荷瘤小鼠的体重，绘制小鼠体重随时间变化的曲线，计算治疗前后相对体重比；游标卡尺测量肿瘤的长径及短径并计算肿瘤体积，绘制相对肿瘤体积变化曲线，计算肿瘤抑制率；便携式超声诊断仪留取肿瘤超声图像(线阵探头5～10MHz，深度2.6cm)；相对体重比、肿瘤体积、抑瘤率(Tumor growth inhibition，TGI)计算公式如下：
Figure BDA0002647324910000191
Figure BDA0002647324910000192
Figure BDA0002647324910000193
(5)治疗结束时，各组小鼠均进行戊巴比妥钠麻醉后处死，切除肿瘤，行H&E染色，观察各组细胞形态；TUNEL法评估细胞凋亡；Masson染色观察肿瘤内胶原纤维沉积。整个SDT治疗流程如图36。
1.3 H&E染色步骤
(1)治疗结束后，戊巴比妥钠麻醉后处死，取出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及肿瘤组织，10％中性甲醛溶液中固定，制成石蜡切片，二甲苯液脱蜡5min×2次；
(2)各级乙醇脱水，100％乙醇2min，95％的乙醇1min，80％乙醇1min，75％乙醇1min；
(3)蒸馏水洗2min；苏木精染色5min，自来水冲洗；
(4)1％盐酸乙醇分化30s，自来水浸泡15min；
(5)伊红染色2min，95％乙醇1min×2次，100％乙醇1min×2次；
(6)二甲苯石碳酸液(3：1)脱水1min，二甲苯液透明1min×2次；
(7)中性树脂封片，显微镜下观察。
1.4 TUNEL法评估细胞凋亡
(1)肿瘤切片充分脱蜡和水化，0.85％NaCl浸洗5min，PBS洗5min；
(2)4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤5min×2次；
(3)加100μL蛋白酶(20μg/mL)的处理组织10min使细胞通透，PBS洗涤5min；
(4)加100μL平衡液，湿盒平衡10min；
(5)加入100μL荧光素12-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(12-2’-deoxyguanosine-5’-triphosphate，12-dUTP)标记断裂的脱氧核糖核酸链(Desoxyribonucleic acid，DNA)，湿盒中37℃反应1h；
(6)浸入2×盐水柠檬酸钠(Saline sodium citrate，SSC)缓冲液15min终止反应，PBS洗涤5min×3次；
(7)抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。使用Image J分析绿色荧光信号的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)。
1.5 Masson染色
(1)石蜡切片脱蜡至水；
(2)用苏木精液染核5～10min，充分水洗，如过染可盐酸酒精分化，蒸馏水洗；
(3)用丽春红酸性复红液5～10min；
(4)2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；
(5)1％磷钼酸水溶液分化3～5min；
(6)不经水洗，直接用苯胺蓝或绿液染色5min；0.2％冰醋酸水溶液浸洗；
(7)95％酒精、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察，使用Image J软件分析肿瘤相对胶原含量(Relative collagen content，RCC)。
2、试验结果
2.1荷瘤小鼠的肿瘤体积变化
治疗15d后各组的肿瘤体积出现不同程度的增长(图37)，治疗后各组小鼠及肿瘤标本如图38所示，NS组肿瘤体积最大，平均体积3759.34±715.89mm3，US组平均体积3640.11±677.83mm3，二者差异无统计学意义(P＞0.05)，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组也有一定的抑瘤效果(TGI 9.84±2.28％)，肿瘤体积(3389.25±280.57mm3)较NS组小，差异具有统计学意义(P＜0.001)；US+TiO2@PEG NPs组(1554.10±129.82mm3)、US+TiO2@PEG/B16M NPs组(1280.38±277.41mm3)及US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(798.26±172.22mm3)肿瘤体积均较TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组小，其中US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs组最小，上述3组的肿瘤抑瘤率TGI分别为58.66±1.05％，65.94±4.25％，78.77±7.08％，US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的抑瘤率最大，不同治疗组小鼠的TGI，差异具有统计学意义(图39)(P＜0.05)，说明TiO2@PEG/B16M NPs联合超声辐照具有相对较强的声动力抗肿瘤效果。
2.2荷瘤小鼠的体重变化
在保证正常饮食条件下，NS组治疗前、后的平均体重为22.40±1.14g、26.80±2.41g；TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组治疗前、后的平均体重为22.50±1.00g、25.70±1.60g；US组治疗前、后的平均体重为22.00±1.73g、25.70±1.60g；US+TiO2@PEG NPs组治疗前、后的平均体重为22.90±1.02g、26.80±1.35g；US+TiO2@PEG/B16M NPs组治疗前、后的平均体重为22.68±0.93g、25.50±1.97g；US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组治疗前、后的平均体重为23.50±0.78g、25.30±1.15g；各组的小鼠均没有出现体重下降的情况(图40)；各组小鼠的相对体重比率差异无统计学意义(P＞0.05)(图41)。
2.3病理组织切片H&E染色
各组小鼠内脏器官与肿瘤的H&E染色如图42。TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组、US+TiO2@PEG NPs组、US+TiO2@PEG/B16M NPs组及US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的荷瘤小鼠肿瘤标本中，出现不同程度的细胞坏死情况，主要表现为细胞皱缩，细胞核不完整，染色变浅；而NS组、及单纯US组肿瘤细胞排列紧密，细胞核大而完整，染色也较深。各组小鼠主要的器官心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏中均没有观察到明显的细胞病理变化或损伤，相比NS组，没有看到明显的差异，说明纳米粒联合低强度超声的SDT治疗方案能对肿瘤组织起到杀伤作用，但对机体内脏组织没有明显的潜在毒性，为将来的临床应用提供了理论依据。
2.4 TUNEL凋亡
单纯US组与NS组荧光显微镜下均未见明显肿瘤细胞凋亡信号，说明采用的超声条件对体内细胞是相对安全的，具有生物安全性；单纯TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组可见少量的凋亡绿色荧光信号；US+TiO2@PEG NPs组、US+TiO2@PEG/B16M NPs组及US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组肿瘤细胞在荧光显微镜下见不同程度的凋亡绿色荧光信号，其中US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组最多，凋亡效果最明显(图43)；各组肿瘤细胞凋亡的MFI分析，US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(24.60±0.87)＞US+TiO2@PEG/B16M NPs组(21.86±0.98)＞US+TiO2@PEG NPs组(19.64±1.02)＞TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组(10.21±1.35)，组间比较，差异具有统计学意义(图44)(P＜0.001)，说明TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs具有相对显著的声动力抗肿瘤效果。
2.5 Masson染色观察肿瘤胶原沉积
Masson染色显示，NS对照组及US组中可观察到大量相对有序排列的肿瘤内胶原纤维，呈蓝色，而其他治疗组均在一定程度上抑制肿瘤内胶原沉积，其中超声联合纳米粒组的胶原纤维较少，且排列相对紊乱(图45)。半定量分析，NS组、US组、TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs组、US+TiO2@PEG NPs组、US+TiO2@PEG/B16M NPs组及US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs组的相对胶原含量(Relative collagen content，RCC)分别为43.57±3.41％，44.67±4.23％，37.76±4.30％，21.34±5.32％，14.87±5.78％，10.87±5.57％，与其他治疗组相比，US+TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs的RCC最低，组间差异具有统计学意义(P＜0.001)，显示出相对更好的肿瘤胶原沉积抑制作用(图46)。
上述试验结果表明：本发明载PD-L1A仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1ANPs)具有一定的生物安全性，与其他TiO2纳米粒相比，在体内对小鼠B16F10移植瘤具有相对较强的靶向结合能力，在声动力条件下能够较好地抑制恶性黑色素瘤的生长，具有相对显著的局部抗肿瘤治疗效果。
综上，本发明成功制备了载PD-L1抗体的仿生靶向TiO2纳米粒(TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs)，该纳米粒粒径较小，B16F10细胞膜包被，同时抗体携载率较高，无明显细胞毒性。同时，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs能较好地同源靶向并特异性靶向结合B16F10细胞；在SDT条件下可产生ROS，进而引起不同程度的细胞凋亡。此外，TiO2@PEG/B16M-PD-L1A NPs具有生物安全性，瘤内注射后具有相对较强的靶向聚集能力，SDT条件下能够较好地抑制恶性黑色素瘤的生长。可用于肿瘤，特别是恶性黑色素瘤治疗，具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：它是载细胞程序性死亡受体-配体1抗体的仿生TiO2纳米粒；
所述仿生TiO2纳米粒由TiO2纳米粒、DSPE-PEG2000-NH2和细胞膜为原料制备而成；TiO2纳米粒、DSPE-PEG2000-NH2和细胞膜的质量比为(1～5)：(1～5)：(1～5)。
2.根据权利要求1所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体为活化细胞程序性死亡受体-配体1抗体；所述活化细胞程序性死亡受体-配体1抗体为将细胞程序性死亡受体-配体1抗体溶于溶剂后，加入EDC和NHS活化，即得；
优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和溶剂的体积比为(1～10)：100；所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体、EDC和NHS的质量比为(0.001～0.1)：(0.1～1)：(0.1～1)；
更优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和缓冲液的体积比为1：100；所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体、EDC和NHS的质量比为0.005：0.5：0.6。
3.根据权利要求2所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体为PD-L1单克隆抗体；
和/或，所述溶剂为缓冲液；
和/或，所述活化为冰水浴反应1～3h；
优选地，
所述缓冲液为MES缓冲液；
更优选地，
所述MES缓冲液浓度为0.1M，pH为5.0。
4.根据权利要求1所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：所述载细胞程序性死亡受体-配体1抗体的仿生TiO2纳米粒的制备方法包括如下步骤：
将细胞程序性死亡受体-配体1抗体加入仿生TiO2纳米粒溶液中，搅拌后离心，干燥，即得；
优选地，所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为(0.002～0.003)：1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液为TiO2纳米粒的PBS溶液；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌；
和/或，所述干燥为冷冻干燥；
更优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为0.0025：1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌过夜；
和/或，所述离心为离心力3600～3700g离心10min。
5.根据权利要求1所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：所述TiO2纳米粒、DSPE-PEG2000-NH2和细胞膜的质量比为2：1：1。
6.根据权利要求1所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：所述仿生TiO2纳米粒的制备方法包括如下步骤：
(1)将TiO2纳米粒溶于溶剂中，制备得到浓度为1～5mg/mL的TiO2纳米粒悬液；
(2)将DSPE-PEG2000-NH2溶于溶剂中，制备得到浓度为1～5mg/mL的DSPE-PEG液；
(3)将细胞膜用溶剂稀释成浓度为1～5mg/mL的细胞膜液；
(4)按质量比将TiO2纳米粒液、DSPE-PEG液和细胞膜液混合，超声分散，离心，弃上清液，冻干即得；
优选地，
步骤(1)中，所述TiO2纳米粒悬液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(1)中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液；
和/或，步骤(2)中，所述DSPE-PEG溶液液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(2)中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液；
和/或，步骤(3)中，所述细胞膜溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(3)中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：
步骤(1)中，所述TiO2纳米粒悬液制备时进行超声分散；
和/或，步骤(4)中，所述超声分散的功率162W，频率40KHz，时间30min；
和/或，步骤(4)中，所述离心为4℃离心；
优选地，
步骤(1)中，所述超声分散的功率162W，频率40KHz，时间10min；
和/或，步骤(4)中，所述离心力为3600～3700g离心10min。
8.根据权利要求1所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒，其特征在于：所述细胞膜为黑色素瘤细胞的细胞膜；
优选地，所述细胞膜为黑色素瘤B16F10细胞的细胞膜。
9.一种权利要求1～8任一项所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将细胞程序性死亡受体-配体1抗体加入仿生TiO2纳米粒溶液中，搅拌离心，干燥，即得；
优选地，所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为(0.002～0.003)：1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液为TiO2纳米粒的PBS溶液；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌；
和/或，所述干燥为冷冻干燥；
更优选地，
所述细胞程序性死亡受体-配体1抗体和仿生TiO2纳米粒的质量比为0.0025：1；
和/或，所述TiO2纳米粒溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，所述搅拌为冰浴搅拌过夜；
和/或，所述离心为离心力3600～3700g离心10min。
10.权利要求1～8任一项所述的载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒在制备抗肿瘤的材料和/或药物中的用途；所述材料为声敏剂；
优选地，所述声敏剂为用于声动力疗法的声敏剂；
更优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。
CN202010855790.7A 2020-08-24 2020-08-24 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途 Active CN112121015B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010855790.7A CN112121015B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010855790.7A CN112121015B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112121015A true CN112121015A (zh) 2020-12-25
CN112121015B CN112121015B (zh) 2022-03-18

Family

ID=73847058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010855790.7A Active CN112121015B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112121015B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113956466A (zh) * 2021-11-05 2022-01-21 首都医科大学附属北京口腔医院 钛修饰双亲性高分子材料及其制备方法和其在制备口腔材料用修饰外泌体中的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109646675A (zh) * 2019-01-29 2019-04-19 郑州大学 一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物
CN111228520A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 东华大学 一种细胞膜包覆的超小四氧化三铁纳米团簇及其制备和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109646675A (zh) * 2019-01-29 2019-04-19 郑州大学 一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物
CN111228520A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 东华大学 一种细胞膜包覆的超小四氧化三铁纳米团簇及其制备和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113956466A (zh) * 2021-11-05 2022-01-21 首都医科大学附属北京口腔医院 钛修饰双亲性高分子材料及其制备方法和其在制备口腔材料用修饰外泌体中的用途
CN113956466B (zh) * 2021-11-05 2023-04-25 首都医科大学附属北京口腔医院 钛修饰双亲性高分子材料及其制备方法和其在制备口腔材料用修饰外泌体中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN112121015B (zh) 2022-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108543074B (zh) 一种用于肿瘤治疗的外泌体包裹的纳米载药系统及其制备
Zhang et al. Tumor microenvironment responsive FePt/MoS 2 nanocomposites with chemotherapy and photothermal therapy for enhancing cancer immunotherapy
Shi et al. Tumor-targeting, enzyme-activated nanoparticles for simultaneous cancer diagnosis and photodynamic therapy
CN107893050A (zh) 一种细胞外囊泡及其制备方法和用途
CN111346226A (zh) 一种自产氧纳米粒及其介导肿瘤光动力治疗的应用
Wei et al. Orange-emissive carbon quantum dots for ligand-directed Golgi apparatus-targeting and in vivo imaging
CN110201169B (zh) 氧气自给型靶向纳米光动力治疗系统
CN110314136A (zh) 一种基于不饱和脂肪酸纳米粒的肿瘤靶向药物的制备及其应用
CN112121015B (zh) 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途
CN113861229A (zh) 一种光敏剂分子及其在提高肿瘤滞留时间增强大体积肿瘤治疗中的应用
CN114010783B (zh) 一种基于共价有机框架材料的多功能富硼纳米靶向制剂及制备方法和应用
Yao et al. Cascade nanozymes based on the “butterfly effect” for enhanced starvation therapy through the regulation of autophagy
CN109602917B (zh) 一种兼具肺癌靶向及增强光动力治疗效果的介孔过氧化钛纳米药物组合物及其制备方法
CN105440112A (zh) 多肽-白蛋白偶联药物、其制备方法及应用
CN104147608A (zh) 一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用
CN107569515A (zh) 碳量子点/氧化亚铜（CQDs/Cu2O）复合物在制备治疗癌症的药物中的应用
CN111450252A (zh) 一种用于靶向堵塞肿瘤血管的药物及其制备方法与应用
CN114225029B (zh) 一种声敏响应的纳米颗粒及其应用
CN114432264B (zh) 一种基于二茂铁和金丝桃素的复合纳米材料、制备方法及应用
CN105476956B (zh) 一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束及其制备方法和应用
Lin et al. Exosome-based rare earth nanoparticles for targeted in situ and metastatic tumor imaging with chemo-assisted immunotherapy
Li et al. Red blood cell membrane-coated biomimetic upconversion nanoarchitectures for synergistic chemo-photodynamic therapy
CN110227065A (zh) 叶酸靶向载NaHCO3脂质体及其在增强肿瘤免疫治疗效果方面的应用
CN116785230B (zh) 一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用
CN114699388B (zh) 靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant