CN107837400A - 一种新型纳米基因载体及其制备方法 - Google Patents

一种新型纳米基因载体及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107837400A
CN107837400A CN201711119318.1A CN201711119318A CN107837400A CN 107837400 A CN107837400 A CN 107837400A CN 201711119318 A CN201711119318 A CN 201711119318A CN 107837400 A CN107837400 A CN 107837400A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mnp
pll
sirna
nano
melanin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711119318.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107837400B (zh
Inventor
张瑞平
杨曦
王斌全
范博
范曲立
程霞
高伟
纪钰
徐雯
李小燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Province Tumor Hospital
Original Assignee
Shanxi Province Tumor Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Province Tumor Hospital filed Critical Shanxi Province Tumor Hospital
Priority to CN201711119318.1A priority Critical patent/CN107837400B/zh
Publication of CN107837400A publication Critical patent/CN107837400A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107837400B publication Critical patent/CN107837400B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及基因治疗领域，具体而言，涉及一种MNP/PLL/SIRNA新型纳米基因载体及其制备和双重疗效应用；由人体内源性物质合成的黑色素纳米颗粒MNP、聚赖氨酸PLL和基因SIRNA组成，用聚赖氨酸对黑色素纳米颗粒进行修饰和改性，合成MNP‑PLL,再通过静电作用与负电荷SIRNA结合，形成MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体；本方法合成工艺简单，成本较低；制备的纳米复合物自身所带电荷为正电荷，粒径小，易进入体内，易进人细胞核内发挥功效，且产物稳定性好，分散性好，生物相容性好，安全性高；且其尾静脉进入体内进行基因治疗和光热治疗的过程均容易操作。

Description

一种新型纳米基因载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，具体而言，涉及一种MNP/PLL/SIRNA新型纳米基因载体及其构建和双重疗效应用。
背景技术
癌症，即恶性肿瘤，是严重危害人类健康，导致人们死亡的首要恶疾。目前，癌症的治疗策略包括化疗，放疗，手术切除，生物治疗等。但这些措施均会对正常组织产生不可避免的毒副作用，使得治疗难以继续或者复发。2003年中国国家食品药品监督管理局(SFDA)将基因治疗定义为：以改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。
实质上基因治疗是指将外源性基因物质输送到靶细胞，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗目的。它是从病根上入手，直接作用于致病基因，阻断致病基因的表达或者产生大量的治疗蛋白，作为一种新的，具有革命性的治疗手段，治疗的有效性已得到临床验证。
RNA沉默技术是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA触发的转录后基因沉默机制，即通过双链RNA导致同源mRNA发生序列特异性降解的现象。在哺乳动物细胞中，RNAi的过程是指双链RNA在细胞内被dicer酶处理为长度21-23bp的小干扰RNA(SIRNA)，其与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合，进而以序列特异性的方式和同源mRNA结合，降解靶mRNA并抑制蛋白的合成，实现基因沉默。
然而，裸露的基因治疗药物(SIRNA,microRNA等)存在易被核酶降解、细胞内吞效果差和细胞靶向能力差等缺点，因此在哺乳动物细胞中，基因沉默作用的稳定持久实现需要基因载体来介导。目前，基因治疗的载体包括物理转染技术，病毒载药系统，非病毒载药系统。物理转染技术是利用电穿孔，基因枪等技术直接将裸露的核酸注射到肿瘤部位，虽操作简单，却受限于体表组织，且转染率低。病毒载药系统利用病毒将自身遗传物质导入宿主细胞的自然特性，将病毒与外源基因整合，凭其高转染效率，实现高效的基因输送，但却存在严重的安全性问题。非病毒载药系统指天然或人工合成的载体包裹输送核酸至肿瘤部位，其生物安全性高，可规模化生产，可控性好。目前，研究最多的包括阳离子脂质体、聚合物、树枝状大分子和多肽等有机纳米材料和金纳米粒，介孔氧化硅，磷酸钙等无机纳米材料。总之，无机纳米材料和有机纳米材料均存在着毒性、降解性、稳定性、生物安全性、生物相容性以及制备工艺等问题。因此，制备一种安全无毒，合成简单，稳定性好，转染率高的纳米基因载体是我们亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足，本发明公开一种新型基因纳米载体，将基因治疗、光热治疗、多模态成像及预后监测等功能融于一体，为癌症的治疗提供的新的方法，实现了纳米材料向临床的转化。
一种新型纳米基因载体，包括人体内源性物质合成的黑色素纳米颗粒MNP、聚赖氨酸PLL和基因SIRNA，所述聚赖氨酸对黑色素纳米颗粒进行修饰和改性，合成MNP-PLL,所述的MNP-PLL再通过静电作用与负电荷SIRNA结合形成MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体。
所述MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体粒径为60-70nm。
所述MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体用于基因治疗和光热治疗。
一种新型纳米基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备黑色素纳米颗粒MNP
取黑色素(melanin)，加入氢氧化钠溶液中，超声振荡至混匀完全溶解；缓慢加入HCl溶液中和，并将细胞粉碎，离心，水洗和冷冻干燥，得到黑色素纳米颗粒；
(2)黑色素纳米颗粒的改性
称取1mg黑色素纳米粒子溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解；取2mg聚赖氨酸溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解；将1mlMNP水溶液逐滴滴入1ml聚赖氨酸水溶液中，在25℃下，用磁力搅拌过夜；第二天，将溶液移入超滤离心管(3000KD)中，加超纯水进行离心洗涤，3500rpm/min,离心5次；
(3)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的构建
先将RNA干粉管放于掌上离心机进行离心，再加入125ulDEPC水溶解0.5OD RNA干粉，配成10pmol/ul的SIRNA,分装备用，按照不同质量比，每次取10pmol/ulRNA与等体积MNP-PLL在涡旋混合器上涡旋后静置，备用。
所述步骤(2)中黑色素纳米颗粒溶液和聚赖氨酸溶液的质量比为1：2。
所述步骤(3)中MNP-PLL溶液和SIRNA以质量比40开始，涡旋30s以后,静置20min,备用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明公开了一种MNP/PLL/SIRNA新型纳米基因载体及其制备方法和应用，其合成工艺简单，成本较低；制备的纳米复合物自身所带电荷为正电荷，粒径小，易进入体内，易进人细胞核内发挥功效，且产物稳定性好，分散性好，生物相容性好，安全性高；且其尾静脉进入体内进行基因治疗和光热治疗的过程均容易操作。
附图说明
图1为黑色素纳米颗粒MNP的透射电镜图；
图2为新型纳米基因载体MNP/PLL/SIRNA的透射电镜图；
图3为黑色素纳米颗粒MNP的动态光散射图；
图4为新型纳米基因载体MNP/PLL/SIRNA的动态光散射图；
图5为新型纳米基因载体MNP/PLL/SIRNA的不同质量比(0，1，5，10，20)的琼脂糖凝胶电泳图；
图6为SIRNA在不同环境中的体外释放率图；
图7为溶酶体逃逸图
图8为流式细胞术测细胞凋亡率图；
图9为激光共聚焦图；
图10为尾静脉注射后的肿瘤体积变化；
图11为不同处理组瘤体的病理切片染色图；
图12纳米材料的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种新型纳米基因载体，由人体内源性物质合成的黑色素纳米颗粒MNP、聚赖氨酸PLL和基因SIRNA组成，所述聚赖氨酸对黑色素纳米颗粒进行修饰和改性，合成MNP-PLL,再通过静电作用与负电荷SIRNA结合。黑色素纳米颗粒溶液和聚赖氨酸溶液的质量比为1∶2。MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体粒径为60-70nm。
一种新型纳米基因载体的制备方法，其步骤如下：
(1)黑色素纳米颗粒(MNP)的合成
取20mg黑色素(melanin)，加入4ml0.1mol/L的NaOH溶液中超声振荡混匀溶解；再缓慢加入2.5ml0.1mol/L的HCl溶液中，并超声振荡，调节PH值到7-8，离心15min；用双蒸水洗涤、离心3-10次；经冷冻干燥制得所述水溶性黑色素纳米颗粒。
(2)黑色素纳米颗粒的改性
称取1mg黑色素纳米粒子溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解；取2mg聚赖氨酸溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解。将1mlMNP水溶液逐滴滴入1ml聚赖氨酸水溶液中，在25℃下，用磁力搅拌过夜。第二天，将溶液移入超滤离心管(3000KD)中，加超纯水进行离心洗涤，3500rpm/min,离心5次。
(3)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的构建
先将RNA干粉管放于掌上离心机进行离心，再加入125ulDEPC水溶解0.5ODRNA干粉，配成10pmol/ul的SIRNA,分装备用。按照不同质量比，每次取10pmol/ul RNA与等体积MNP-PLL在涡旋混合器上涡旋30s，静置20min，备用。MNP-PLL溶液和SIRNA以质量比40开始，涡旋30秒，静置20min备用。
一种新型纳米基因载体用于基因治疗和光热治疗。
实施例1
黑色素纳米颗粒(MNP)的合成和表征
(1)黑色素纳米颗粒(MNP)的合成
取20mg黑色素溶于4ml氢氧化钠溶液中，超声震荡至完全溶解，加2.5ml盐酸中和，并行细胞粉碎，离心，水洗，冷冻干燥。称量得到的黑色素纳米颗粒，计算产率。
(2)黑色素纳米颗粒(MNP)的表征
A、电镜形态检测：取少量MNP水溶液，超声分散后滴到有膜铜网上，制的电镜样品，利用TEM观察其形态结构，在5万倍条件下任选20个视野进行拍照，再将图片扫描到计算机中，利用图像分析系统计算平均粒径，如图1所示为MNP的透射电镜图。
B、平均粒径检测：将制备好的MNP溶解于水，经超声震荡仪分散后，采用动态光散射法(DLS)行激光粒度仪检测。DLS数据分析利用ZetasizerSoftware软件分析，如图3为MNP的动态光散射图。
C、吸收光谱检测：取一定量黑色素水溶液，超声震荡，使用紫外-可见分光光度计检测其吸收光谱。
D、稳定性检测:将MNP分别溶于PBS和血清中，观察其外观形态、悬浮稳定等情况，并在4度避光放置，每日观察，持续2个月，进行记录比较。结果表明，纳米颗粒并没有聚集，粒径没有明显变化。
实施例2
多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的构建
①黑色素纳米颗粒的改性
称取1mg黑色素纳米粒子溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解；取2mg聚赖氨酸溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解。将1mlMNP水溶液逐滴滴入1ml聚赖氨酸水溶液中，25℃磁力搅拌过夜。将溶液移入超滤离心管(3000KD)中，加超纯水进行离心洗涤，3500rpm/min,离心5次。
②多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的构建
SIRNA：先将RNA干粉管放于掌上离心机进行离心，再加入125ulDEPC水溶解0.5ODRNA干粉，配成10pmol/ul,分装备用。按照不同质量比，每次取10pmol/ulRNA与等体积MNP-PLL在涡旋混合器上涡旋30s，静置20min,，备用。
实施例3
多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的表征
A、电镜形态检测：取少量合成的MNP-PLL-SIRNA溶液，超声分散后滴到有膜铜网上，制得电镜样品，利用TEM观察其形态结构，在5万倍条件下任选20个视野进行拍照，再将图片扫描到计算机中，利用图像分析系统计算平均粒径，如图2所示。
B、平均粒径及电动电势检测：将制备好的MNP-PLL-SIRNA溶液，超声震荡仪分散后，采用动态光散射法(DLS)行激光粒度仪检测、电动电势行Zpotential检测。DLS数据分析利用ZetasizerSoftware软件分析，如图4所示。
C、吸收光谱检测：取一定量MNP-PLL-SIRNA溶液，超声震荡，使用紫外-可见分光光度计检测其吸收光谱。
D、稳定性检测:将MNP-PLL-SIRNA溶液分别溶于PBS和10％血清中，在不同时间节点测量平均粒径，观察其外观聚集等情况，并在4度避光放置，进行记录比较。
E、体外释放实验：在恒温搅拌水浴锅中将装有纳米基因载体MNP-PLL-SIRNA溶液的透析袋悬浮于PBS缓冲液中和酸性溶液中，在规定的时间点取样2ml,测量SIRNA在260nm的吸光度，并算出浓度，画出体外释放曲线图，如图6所示。
F、纳米基因载体包封率(琼脂糖凝胶电泳)：制备2％琼脂糖凝胶并分别加入丙三醇、SDS、样品，120V电压分离20-30分钟后拍照，观察电泳条带检测SIRNA的包封率，如图5所示。
实施例4
多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的体外实验
A、细胞毒性检测
(1)肿瘤细胞铺板，每孔100UL8*103个细胞，轻轻拍瓶壁摇匀，放入敷箱培养24小时待80％的细胞聚集后，弃培养基。
(2)样品配制
1000ug/ul：取原液53.3ul+26.7ul的高压灭菌水。
500ug/ul：取1000ug/ul40ul+40ul的高压灭菌水。
200ug/ul：取1000ug/ul16ul+64ul的高压灭菌水。
100ug/ul：取1000ug/ul8l+72ul的高压灭菌水。
50ug/ul：取100ug/ul40ull+40ul的高压灭菌水。
20ug/ul：取100ug/ul16ul+64ul的高压灭菌水。
10ug/ul：取20ug/ul40ul+40ul的高压灭菌水。
5ug/ul：取20ug/ul20ul+60ul的高压灭菌水。
(3)取上述材料10ul与90ul无血清培养基放入孔中，放培养箱共培养24小时。
(4)将材料及培养基吸出，用PBS轻轻的洗一遍，取10ulcck8与100ul培养基混匀，每孔加入100ul，放敷箱1-4小时，上机检测。检测结果表明材料浓度在1000ug/ul时，细胞生存率为70％，其余均在80％以上，表明材料本身毒性很小。
B.体外RNAi实验：
(1)肿瘤细胞铺板每孔100UL8*103个细胞，轻轻拍打瓶壁摇匀，放入敷箱培养24小时待70-80％的细胞聚集。
(2)样品配制(每组8个副孔，共两组)
0.5O.DRNA+125ulDEPC水配成10pmol/ul，取11ul10pmol/ul+99ulDEPC水，即110ul1pmol/ul。
分别配制质量比为10，20，40时的MNP-PLL
质量比为40时，取15ul原液+35ul高压灭菌水
质量比为20时，取20ul0.528ug/ul材料+20ul高压灭菌水
质量比为10时，取10ul0.528ug/ul材料+30ul高压灭菌水
(3)取上述材料10ul与90ul无血清培养基放入孔中，放培养箱共培养24小时。
(4)将材料及培养基吸出，用PBS轻轻的洗一遍，取10ulcck8与100ul培养基混匀，每孔加入100ul，放敷箱1-4小时，上机检测。观察细胞凋亡，如图8所示。
C、细胞摄取率检测(激光共聚焦显微镜)：
1、铺板每孔2ml15*104个细胞轻轻拍打瓶壁摇匀，放入敷箱培养24小时。
2、配制样品
(1)裸FAM-RNA1pmol/ul100ul
0.5O.DFAM-RNA+125ulDEPC水配成10pmol/ul，取11ul的10pmol/ul+99ulDEPC水，即110ul1pmol/ul，取100ul+1900ul无血清培养基加入皿内。
(2)质量比20FAM-RNA100pmol/ul
18ul1.5ug/ul原液+92ul高压灭菌水即可配成110ul质量比20的MNP-PLL。
取11ul的10pmol/ul+99ulDEPC水，即110ul1pmol/ulFAM-RNA各取100ul涡旋混合30s，静置20min，与1800ul无血清培养基加入皿内。
(3)质量比20FAM-RNA200pmol/ul
36ul1.5ug/ul原液+74ul高压灭菌水即可配成110ul质量比20的MNP-PLL。
取22ul的10pmol/ul+88ulDEPC水，即110ul1pmol/ulFAM-RNA各取100ul涡旋混合30s，静置20min，与1800ul无血清培养基加入皿内。
(4)质量比20FAM-RNA100pmol/ul
36ul1.5ug/ul原液+74ul高压灭菌水即可配成110ul质量比20的MNP-PLL。
取11ul的10pmol/ul+99ulDEPC水，即110ul1pmol/ulFAM-RNA，各取100ul涡旋混合30s，静置20min，与1800ul无血清培养基加入皿内。
3、吸弃之前的培养基，用无血清培养基清洗一次或者PBS清洗2次(洗得时候沿壁，轻晃)
4、每孔加入200ul混合好的MNP-PLL-RNA和1800ul无血清培养基，共培养4-6小时，之后，换完全培养基孵育18小时。
5、吸弃材料和培养基，用温的PBS冲洗3次，每次2ml,3-5min。
6、加1ml4％多聚甲醛固定20min。
7、用温的PBS冲洗3次，每次2ml,3-5min。
8、每孔加入150ulDAPI染色液，轻轻摇晃，让其均匀着色7min。
9、用温的PBS冲洗3次，每次2ml,3-5min。
10、每个皿中加1mlPBS锡箔纸包裹，放4度冰箱等待检测，如图9所示。
D、流式细胞数测细胞凋亡分析：
1、铺板每孔2ml20*104个细胞,轻轻拍打瓶壁摇匀,放入敷箱培养24小时，待70％-80％细胞帖壁。
2、配制样品
(1)裸SIRNA1pmol/ul100ul
(2)质量比20SIRNA200pmol
MNP-PLL：36ul原液+74ul高压水,RNA：22ul10pmol/ul+88ulDEPC水,各取100ul涡旋30s静置20min,与1800ul无血清培养基一起加入。
(3)质量比40SIRNA100pmol
MNP-PLL：36ul原液+74ul高压水RNA：11ul10pmol/ul+99ulDEPC水,各取100ul涡旋30s静置20min,与1800ul无血清培养基一起加入。
(4)质量比40SIRNA200pmol
MNP-PLL：72ul原液+38ul高压水RNA：22ul10pmol/ul+88ulDEPC水,各取100ul涡旋30s静置20min,与1800ul无血清培养基一起加入。
3、共培养4-6小时后，吸出材料及培养基，换为2ml完全培养基继续培养18小时
4、用温的PBS冲洗两次，动作轻柔
5、每孔加入1ml胰酶消化，敷箱放置5分钟
6、每孔加入4ml完全培养基中和，1000rpm/min离心5分钟。
7、倒掉上清，细胞团块用2mlPBS冲散，摇匀，放口袋保温送至流式室检测。
E溶酶体逃逸实验
1分组：裸siRNA200pm；质量比40-siRNA200pmol；
质量比40-siRNA200pmol+light
2样品制备：裸siRNA200pmol 100ul
取20ul+80ulDEPC水＝100ul2pmol/ul质量比40-siRNA
200pmol
即将1.5ug/ul稀释到1.056ug/ul
即取70.5ul1.5ug/ul原液+29.5ul高压灭菌水
3铺板：每孔2ml15*104细胞，轻拍瓶壁，使细胞均匀分散，孵育24小时，用无血清培养基洗一次或者pbs冲洗两次(沿壁添加，轻晃)
4每孔加入200ulmnp-pll-rna和1800ul无血清培养，共培养3-4小时，第3组光照。
5用温的pbs冲洗1次，每次2ml，3-5min。
6加lyso-tracker@redndn-99，每个玻璃皿内的浓度为75nmol/l，2ml培养基，至少孵育1-2小时。
8加1ml多聚甲醛固定20min。
9用温的pbs冲洗3次，每次2ml，3-5min。
10每孔加入170ulDAPI染色液，均匀覆盖7min。
11用温的pbs冲洗3次，每次2ml，3-5min。
12每个皿中加入1mlpbs，锡箔纸包好等待检测。
实施例5
(1)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的体外PAI成像
材料的PAI体外实验：取一定量的MNP-PLL-SIRNA溶液，等比稀释后将不同浓度的溶液和PBS液分别封闭于PE管中，利用光声成像系统检测其光声信号强度。
细胞的PAI体外实验：将一定浓度的多功能纳米基因载体和对照组PBS液分别加入到喉癌细胞共孵育，然后重新悬浮于PBS液中，细胞悬液按比例稀释后分别封闭于PE管中，利用光声成像系统检测其光声信号强度。
(2)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的体内PAI成像
裸鼠喉癌模型建立：将1×106个喉癌细胞种植到裸鼠的右肩部皮下，等待3-4周后，瘤体形成模型建立成功。
喉癌模型的PAI：尾静脉注射多功能纳米基因载体为实验组，设立PBS组为对照组，分别于不同时间段分别行PAI，观察其在喉癌动物模型中的成像效果，确定纳米载体在肿瘤部位的最佳聚集时间，为后续治疗提供依据。
实施例6
(1)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的光热治疗(PTT)
材料的光热效果：取不同质量比(质量比为5，10，15，20，30)的MNP-PLL-SIRNA溶液和PBS液分别在808nm近红外光照射下(0.5w/cm^2,0.75w/cm^2,
1w/cm^2,1.5w/cm^2,2w/cm^2,2.5w/cm^2)照射5min，记录材料的温度可升至56℃，可有效达到治疗所需温度。
细胞的PTT体外实验：将一定浓度的多功能纳米基因载体和对照组PBS液分别加入到喉癌细胞共孵育，然后重新悬浮于PBS液中，细胞悬液按比例稀释后分别封闭于PE管中，用近红外光照射，观察细胞死亡情况。
裸鼠喉癌模型建立：将1×106个喉癌细胞种植到裸鼠的右肩部皮下，等待3-4周后，瘤体形成模型建立成功。
喉癌模型的PTT：尾静脉注射多功能纳米基因载体为实验组，设立PBS组为对照组，分别于不同时间段分别行近红外光照射，观察喉癌动物模型中瘤体的体积和重量的变化，绘制肿瘤生长曲线。
(2)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的基因治疗
基因治疗：尾静脉注射多功能纳米基因载体为实验组，注射PBS为对照组，不同的组经相应处理后，记录肿瘤体积，裸鼠体重及裸鼠生存率，如图10所示。最后一次注射结束15天后，处死裸鼠，处死小鼠收集肿瘤组织，检测基因水平(Rt-PCR)和蛋白水平(WesternBlot)的变化。
组织病理学检测：在最后一次注射15天后，处死动物模型，分别取小鼠肿瘤组织，用4％多聚甲醛溶液进行固定，石蜡切片，切片厚度为5μm，进行H&E染色、免疫组织化学染色(TUNEL、Ki-67等)检测肿瘤组织的坏死率和凋亡率，如图11所示。
实施例7
多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的生物安全性评估
定期收集裸鼠血液进行血液分析检测相关标记物，并用临床生化检测评估肝肾功能，结果表明各项指标均没有明显改变，显示出其生物安全性。
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种新型纳米基因载体，其特征在于：包括人体内源性物质合成的黑色素纳米颗粒MNP、聚赖氨酸PLL和基因SIRNA，所述聚赖氨酸对黑色素纳米颗粒进行修饰和改性，合成MNP-PLL,所述的MNP-PLL再通过静电作用与负电荷SIRNA结合形成MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体。
2.根据权利要求1所述的一种新型纳米基因载体，其特征在于：所述MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体粒径为60-70nm。
3.根据权利要求1所述的一种新型纳米基因载体，其特征在于：所述MNP/PLL/SIRNA纳米基因载体用于基因治疗和光热治疗。
4.一种新型纳米基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备黑色素纳米颗粒MNP
取黑色素(melanin)，加入氢氧化钠溶液中，超声振荡至混匀完全溶解；缓慢加入HCl溶液中和，并将细胞粉碎，离心，水洗和冷冻干燥，得到黑色素纳米颗粒；
(2)黑色素纳米颗粒的改性
称取1mg黑色素纳米粒子溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解；取2mg聚赖氨酸溶于1ml超纯水中，超声震荡至完全溶解；将1ml MNP水溶液逐滴滴入1ml聚赖氨酸水溶液中，在25℃下，用磁力搅拌过夜；第二天，将溶液移入超滤离心管(3000KD)中，加超纯水进行离心洗涤，3500rpm/min,离心5次；
(3)多功能纳米基因载体(MNP-PLL-SIRNA)的构建
先将RNA干粉管放于掌上离心机进行离心，再加入125ul DEPC水溶解0.5OD RNA干粉，配成10pmol/ul的SIRNA,分装备用，按照不同质量比，每次取10pmol/ul RNA与等体积MNP-PLL在涡旋混合器上涡旋后静置，备用。
5.根据权利要求4所述的一种新型纳米基因载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中黑色素纳米颗粒溶液和聚赖氨酸溶液的质量比为1：2。
6.根据权利要求4所述的一种新型纳米基因载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中MNP-PLL溶液和SIRNA以质量比40开始，涡旋30s以后,静置20min,备用。
CN201711119318.1A 2017-11-14 2017-11-14 一种新型纳米基因载体及其制备方法 Active CN107837400B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711119318.1A CN107837400B (zh) 2017-11-14 2017-11-14 一种新型纳米基因载体及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711119318.1A CN107837400B (zh) 2017-11-14 2017-11-14 一种新型纳米基因载体及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107837400A true CN107837400A (zh) 2018-03-27
CN107837400B CN107837400B (zh) 2022-05-20

Family

ID=61678743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711119318.1A Active CN107837400B (zh) 2017-11-14 2017-11-14 一种新型纳米基因载体及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107837400B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110787294A (zh) * 2019-10-30 2020-02-14 西北农林科技大学 一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法
CN113262240A (zh) * 2021-05-31 2021-08-17 中山大学 一种间充质干细胞递送载体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1462763A (zh) * 2003-06-09 2003-12-24 湖南大学 多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用
WO2016006744A1 (ko) * 2014-07-11 2016-01-14 주식회사 프로셀테라퓨틱스 세포 내 분자 전송 펩티드를 이용한 경피 전달용 펩티드-sirna 복합체 및 이의 용도
CN105816877A (zh) * 2015-01-04 2016-08-03 中国科学院大连化学物理研究所 一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用
WO2017039074A1 (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 한국과학기술원 금 나노입자의 광열효과를 이용한 효율적인 세포내 유전자 전달방법
WO2017061673A1 (ko) * 2015-10-06 2017-04-13 전남대학교 산학협력단 멜라닌을 이용한 광열치료용 조성물과 이의 제조방법
CN107096040A (zh) * 2016-02-22 2017-08-29 复旦大学 一种基因-光热联合的纳米粒及其制备方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1462763A (zh) * 2003-06-09 2003-12-24 湖南大学 多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用
WO2016006744A1 (ko) * 2014-07-11 2016-01-14 주식회사 프로셀테라퓨틱스 세포 내 분자 전송 펩티드를 이용한 경피 전달용 펩티드-sirna 복합체 및 이의 용도
CN105816877A (zh) * 2015-01-04 2016-08-03 中国科学院大连化学物理研究所 一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用
WO2017039074A1 (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 한국과학기술원 금 나노입자의 광열효과를 이용한 효율적인 세포내 유전자 전달방법
WO2017061673A1 (ko) * 2015-10-06 2017-04-13 전남대학교 산학협력단 멜라닌을 이용한 광열치료용 조성물과 이의 제조방법
CN107096040A (zh) * 2016-02-22 2017-08-29 复旦大学 一种基因-光热联合的纳米粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QINJIANG 等: "Red blood cell membrane-camouflaged melanin nanoparticles for enhanced photothermal therapy", 《BIOMATERIALS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110787294A (zh) * 2019-10-30 2020-02-14 西北农林科技大学 一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法
CN110787294B (zh) * 2019-10-30 2022-01-04 西北农林科技大学 一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法
CN113262240A (zh) * 2021-05-31 2021-08-17 中山大学 一种间充质干细胞递送载体及其应用
CN113262240B (zh) * 2021-05-31 2022-03-11 中山大学 一种间充质干细胞递送载体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107837400B (zh) 2022-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108543074B (zh) 一种用于肿瘤治疗的外泌体包裹的纳米载药系统及其制备
CN106924755B (zh) 一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法
Zhang et al. Tumor microenvironment responsive FePt/MoS 2 nanocomposites with chemotherapy and photothermal therapy for enhancing cancer immunotherapy
CN103877066B (zh) 载多西他赛和莱菔硫烷的自组装纳米粒的制备方法与应用
CN111346226A (zh) 一种自产氧纳米粒及其介导肿瘤光动力治疗的应用
CN109666695A (zh) 一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用
Liu et al. CdSe/ZnS quantum dots-labeled mesenchymal stem cells for targeted fluorescence imaging of pancreas tissues and therapy of type 1 diabetic rats
CN112915205B (zh) 一种抗肿瘤光动力学增敏治疗的光敏剂/酶组合递送系统及其制备方法
Nicholas et al. Exploiting a Rose Bengal-bearing, oxygen-producing nanoparticle for SDT and associated immune-mediated therapeutic effects in the treatment of pancreatic cancer
CN109620956A (zh) 一种智能巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统及其制备方法和应用
CN112999153A (zh) 载化疗药物/光敏剂的纳米胶束及其制备方法和应用
CN107837400A (zh) 一种新型纳米基因载体及其制备方法
CN104974343A (zh) 改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染载体试剂中的应用
CN109172821A (zh) 碳酸钙包覆纳米金星荧光探针、制备方法及应用
CN108524470A (zh) 一种治疗三阴性乳腺癌的纳米药物系统及其制备方法和应用
CN106880847B (zh) 多功能非晶铁纳米材料及其制备方法和应用
CN112121015A (zh) 一种载PD-L1抗体仿生靶向TiO2纳米粒及其制备方法和用途
CN103990134A (zh) 一种能共传输药物和基因的纳米囊泡、制造方法及其应用
Zhang et al. Multifunctional Cu x S-and DOX-loaded AuNR@ mSiO 2 platform for combined melanoma therapy with inspired antitumor immunity
CN106924748A (zh) 高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建及其促进细胞及细胞膜制剂向肿瘤聚集的作用
CN110237256A (zh) 一种载n2o微泡及其制备方法与应用
CN105687137A (zh) 叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用
CN107550885A (zh) 一种包含模式识别受体中tlr3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用
CN113398135B (zh) 一种用于hili原位检测与释药的纳米系统
CN114225029A (zh) 一种声敏响应的纳米颗粒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant