CN110787294B - 一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸‑黑色素纳米粒子的制备方法,该方法通过Schiff base反应/Michael addition反应将氨基化的透明质酸与黑色素纳米粒子结合,得到透明质酸‑黑色素纳米粒子,在增强天然黑色素纳米粒子生物相容性的同时,提高天然黑色素纳米粒子的细胞摄取效率,使天然黑色素纳米粒子对于癌细胞具有靶向识别特性。制得的透明质酸‑黑色素纳米粒子具有优良的生物相容性,无毒性,分散性与稳定性均优于修饰前,且透明质酸表面富含羧基和羟基,可以通过修饰与多种抗癌药物连接,为抗癌治疗提供可利用的载体。
Description
技术领域
本发明属于纳米复合材料领域,特别涉及一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法。
背景技术
在癌症治疗中,传统的手术疗法、放射疗法和化学疗法会伤害到体内正常的组织以及带来一些其他的副作用。近年来,利用近红外光热转换的光热治疗(PTT)已经被广泛地应用于癌症治疗。相对于传统的肿瘤治疗方法,光热治疗表现出很多优势,例如,精确性、可控性、高渗透性以及对正常组织的低副作用等。目前,广泛研究的光热材料主要包括无机材料以及有机材料。无机材料主要集中在以金、银、钯为基础的新型金属纳米颗粒、碳纳米材料以及以铜为基础的半导体纳米材料。但是这些材料在作为光热治疗材料时存在着不可忽略的问题,如金属纳米粒子的生物代谢差、长期毒性以及碳纳米材料诱发的毒性反应。
发明内容
针对现有技术中的缺陷和不足,本发明提供了一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,增强天然黑色素纳米粒子生物相容性的同时,提高天然黑色素纳米粒子的细胞摄取效率,使天然黑色素纳米粒子对于癌细胞具有靶向识别特性。
为达到上述目的,本发明采取如下的技术方案:
一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,该方法通过Schiff base反应/Michael addition反应将氨基化的透明质酸与黑色素纳米粒子结合,得到透明质酸-黑色素纳米粒子。
本发明还包括如下技术特征:
具体包括如下步骤:
步骤一:制备天然黑色素纳米粒子;
步骤二:透明质酸的氨基化:将透明质酸溶解在磷酸盐缓冲溶液PBS中制成4mg/mL的透明质酸溶液,再加入胱胺二盐酸盐,搅拌并调节溶液的pH值至4.75,再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC以活化透明质酸的羧基,混合液搅拌15分钟,期间反应液一直保持在酸性条件pH=4.75;待反应结束,用氢氧化钠溶液调节反应液的pH值至7淬灭反应;再用透析袋在NaCL和去离子水中透析72h,冻干反应液,得到氨基化的透明质酸,并在4℃下备用;
步骤三:黑色素纳米粒子与氨基化的透明质酸的结合:将步骤一制得的黑色素纳米粒子溶于pH=8.5的Tris-HCL缓冲溶液中制成黑色素纳米粒子溶液;称取步骤二制得的氨基化的透明质酸溶解于Tris-HCL缓冲溶液中,并在其中加入配好的黑色素纳米粒子溶液,室温避光搅拌24小时;将反应液用透析袋在去离子水中透析48h,冻干反应液,得到透明质酸-黑色素纳米粒子。
具体的,步骤二制得的氨基化的透明质酸的结构式为:
具体的,所述步骤二中:透明质酸的分子量为6KDa;
磷酸盐缓冲溶液PBS的物质的量浓度为0.01M,pH=7.4;
胱胺二盐酸盐的物质的量是透明质酸的20倍;
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC的物质的量与透明质酸相等;
所用透析袋的分子量为3500,透析液NaCL的物质的量浓度为0.1M。
具体的,所述步骤三中:黑色素纳米粒子溶液的浓度为1mg/mL;黑色素纳米粒子、氨基化的透明质酸的质量比为1:3~1:6。
本发明与现有技术相比,有益的技术效果是:
1.本发明利用酰胺键的形成将生物相容性优良的透明质酸氨基化,通过保持反应的pH值在酸性条件下,快速高效地对透明质酸进行了氨基化修饰。同时,核磁共振氢谱直观地鉴定氨基的取代比例,为后续的黑色素纳米粒子的修饰打下基础。
2.通过一步的常规化学反应Schiff base reaction/Michael addition反应在天然黑色素纳米粒子的表面包裹透明质酸,简便的操作在增强天然黑色素纳米粒子生物相容性的同时,提高天然黑色素纳米粒子的细胞摄取效率,使天然黑色素纳米粒子对于癌细胞具有靶向识别特性。
3.通过改变反应的物料比,可以控制包裹的透明质酸的厚度从而调节制得纳米粒子的大小,以供实际应用。
4.制得的透明质酸-黑色素纳米粒子具有优良的生物相容性,无毒性,分散性与稳定性均优于修饰前,且透明质酸表面富含羧基和羟基,可以通过修饰与多种抗癌药物连接,为抗癌治疗提供可利用的载体。
附图说明
图1为按照实例1氨基化的透明质酸的氢谱图,溶剂为水。
图2为按照实例1透明质酸-黑色素纳米粒子的红外光谱图。
图3为未修饰的黑色素纳米粒子的粒径分布图。
图4为按照实例1透明质酸-黑色素纳米粒子的粒径分布图。
图5为按照实例2透明质酸-黑色素纳米粒子的粒径分布图。
图6为透明质酸、氨基化的透明质酸、黑色素纳米粒子、按照实例1透明质酸-黑色素纳米粒子、按照实例2透明质酸-黑色素纳米粒子的Zeta电位图。
图7为纯的黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。
图8为按照实例2透明质酸-黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。
图9为按照实例3不同浓度的透明质酸-黑色素纳米粒子对于肝癌细胞HepG2的抑制活性。
图10为按照实例3不同浓度的透明质酸-黑色素纳米粒子对于肝细胞HL7702的抑制活性。
图11为按照实例4黑色素纳米粒子与透明质酸-黑色素纳米粒子分别溶解在蒸馏水中的图,(a)黑色素纳米粒子溶解在水中的图;(b)透明质酸-黑色素纳米粒子溶解在水中的图。
图12为按照实例4黑色素纳米粒子与透明质酸-黑色素纳米粒子分别溶解在蒸馏水中2℃静置30天后的图,(a)黑色素纳米粒子溶解在水中2℃下静置30天后的图;(b)透明质酸-黑色素纳米粒子溶解在水中2℃下静置30天后的图。
具体实施方式
黑色素纳米粒子因其优良的生物相容性、较高的光热转化效能和生物降解性,能够有效地降低生物系统的副作用,成为一种具有优势的光热生物医用材料。在黑色素纳米粒子作用于癌细胞的过程中,虽然增强渗透和滞留效应(EPR)能够提供被动的靶向性,黑色素纳米粒子经尾静脉注射后仍可被网状内皮系统作为外源性异物识别并迅速清除,最终导致有限的治疗效果。若能够修饰一种增强其水溶性的同时,又能赋予黑色素纳米粒子靶向性的载体,则能够大大改善黑色素纳米粒子的光热效能。透明质酸(HA)是一种由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺交替连接的两个糖单元组成的线性大分子粘多糖,它本身具有良好的生物相容性、生物可降解性、高粘弹性,并且透明质酸受体CD44在上皮细胞、造血细胞和神经元细胞表面上以低水平表达,但在许多肿瘤细胞中却过度表达。此外,在透明质酸的主链上富含如羧基、羟基、N-乙酰基等有利于化学修饰的活性基团。因此,在黑色素纳米粒子的表面修饰HA作为载体将有助于增强黑色素纳米粒子的水溶性并使载体具有靶向性。
本实施方式中,通过Schiff base反应/Michael addition反应将氨基化的透明质酸与黑色素纳米粒子结合,得到透明质酸-黑色素纳米粒子。其中,Schiff base反应:由含羰基的醛、酮类化合物与一级胺类化合物进行亲核加成反应,亲核试剂是胺类化合物,其化合物结构由带有孤对电子对的氮原子进攻羰基基团上带有正电荷的碳原子,完成亲核加成反应,形成中间物ɑ-羟基胺类化合物,然后进一步脱水形成Schiff base。Michael加成反应是一个亲电的共轭体系和一个亲核的碳负离子进行共轭加成。
下面结合附图和实施例对本发明的制备方法作进一步说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。下述实例中的实验方法,如无特殊说明均为常规实验方法;实例中所用的材料,如无特殊说明,均购自常规化学试剂公司。
实施例1:
本实施例提供一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,具体包括如下制备步骤:
步骤一:天然黑色素纳米粒子的分离提取
冷冻北太平洋鱿鱼(Ommastrephes bartrami)墨囊解冻挤压去表皮膜和内部网状膜,过滤得鱿鱼墨汁,以等体积的冰水浸泡过夜,离心弃上清液,沉淀部分加入2~3倍体积的水,然后再次离心,重复4-6次,直至离心后上清液颜色基本无黑色为止;所得沉淀真空冷冻干燥,即得黑色素纳米粒子样品;
步骤二:透明质酸(HA)氨基化
分子量为6KDa的透明质酸(100mg,0.1mmol)溶解在25ml的PBS缓冲溶液中(0.01M,pH=7.4)制成4mg/mL的溶液,搅拌溶解完全后,加入446.5mg(2mmol)的胱胺二盐酸盐,搅拌并用0.1N的盐酸与0.1N的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至4.75,加入19.3mg(0.1mmol)的EDC盐酸盐到HA溶液中以活化HA的羧基,混合液搅拌15分钟,期间反应液的pH值要一直保持在4.75;待反应结束,用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节反应液的pH值至7淬灭反应;反应液用(MWCO 3500)的透析袋在0.1M NaCL和去离子水中透析72h以去除未反应的胱胺二盐酸盐,未耦合的试剂EDC;冻干反应液,并在4℃下备用。
步骤三:黑色素纳米粒子与氨基化的透明质酸的结合
称取2mg步骤一制备的黑色素纳米粒子溶于2mL pH为8.5的Tris-HCL缓冲溶液中制成黑色素纳米粒子溶液;称取6mg步骤二制得的氨基化的透明质酸溶解于8mL Tris-HCL缓冲溶液中,加入2mL1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液,室温避光搅拌24小时;反应结束后,反应液用(MWCO 3500)的透析袋在去离子水中透析48h,冻干反应液,并在4℃下备用。
实施例2:
本实施例提供一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,本实施例与实施例1的不同在于,步骤三中,称取步骤一制得的黑色素纳米粒子溶于pH为8.5的Tris-HCL缓冲溶液中制成浓度为1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液;称取12mg步骤二中制得的氨基化的透明质酸溶解于8mL Tris-HCL缓冲溶液中,并在其中加入2mL1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液,室温避光搅拌24小时;反应结束后,反应液用(MWCO 3500)的透析袋在去离子水中透析48h,冻干反应液,并在4℃下备用。
实施例3:
本实施例提供一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,本实施例与实施例1的不同在于,步骤三中,称取步骤一制得的黑色素纳米粒子溶于pH为8.5的Tris-HCL缓冲溶液中制成浓度为1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液;称取10mg氨基化比例为40%的透明质酸溶解于8mL Tris-HCL缓冲溶液中,并在其中加入2mL1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液,室温避光搅拌24小时;反应结束后,反应液用分子量为3500(MWCO 3500)的透析袋在去离子水中透析48h,冻干反应液,并在4℃下备用。
实施例4:
本实施例提供一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,本实施例与实施例1的不同在于,步骤三中,称取步骤一制得的黑色素纳米粒子溶于pH为8.5的Tris-HCL缓冲溶液中制成浓度为1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液;称取90mg氨基化比例为40%的透明质酸溶解于72mL Tris-HCL缓冲溶液中,并在其中加入18mL1mg/mL的黑色素纳米粒子溶液,室温避光搅拌24小时;反应结束后,反应液用分子量为3500(MWCO 3500)的透析袋在去离子水中透析48h,冻干反应液,并在4℃下备用。
结果表征:
(一)氨基化的透明质酸的氢谱图中可以验证氨基取代的比例。图1为按照实例1氨基化的透明质酸的氢谱图,溶剂为水;从图1中化学位移值为2.0与2.9附近氢的积分面积的比值可以得知,氨基取代的比例为40%。
(二)对制备的透明质酸进行红外光谱、动态光散射粒度仪以及透射电子显微镜的测试。
图2为按照实例1透明质酸-黑色素纳米粒子的红外光谱图;图2红外光谱的特征吸收峰的改变可以看出透明质酸成功与黑色素纳米粒子结合。
图3为未修饰的黑色素纳米粒子的粒径分布图,图4为按照实例1透明质酸-黑色素纳米粒子的粒径分布图。图3、图4可以看出透明质酸-黑色素纳米粒子的粒径增加了13.9nm。图5为按照实例2透明质酸-黑色素纳米粒子的粒径分布图;图4、图5可以看出当黑色素纳米粒子与氨基化的透明质酸的质量比从1:3增至1:6时,透明质酸-黑色素纳米粒子的粒径增加了7.9nm。
图6为透明质酸、氨基化的透明质酸、黑色素纳米粒子、按照实例1透明质酸-黑色素纳米粒子、按照实例2透明质酸-黑色素纳米粒子的Zeta电位图。图6的Zeta电位图可以看出透明质酸-黑色素纳米粒子的电位比纯的黑色素纳米粒子低,且当黑色素纳米粒子与氨基化的透明质酸的质量比增至1:6时,透明质酸-黑色素纳米粒子的电位比按1:3的比例反应时电位更低。
图7为纯的黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图,图8为按照实例2透明质酸-黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。从图7、图8对比可以看出,透明质酸-黑色素纳米粒子形成明显的壳核结构。
(三)透明质酸-黑色素纳米粒子复合物材料毒性的研究
将肝癌细胞HepG2和肝细胞HL7702分别铺在96孔板中,培养24小时。去除旧培养基,加入含有不同浓度实施例3制得的透明质酸-黑色素纳米粒子的新培养基(透明质酸-黑色素纳米粒子的浓度分别为5、10、30、50、100μM)。在暗条件下,共培养24小时。之后,取尽旧培养基,向96孔板中加入MTT(0.5mg/mL,100μl),共培养4小时。取尽培养基,加入100μlDMSO,放在摇床上摇晃10分钟。用酶标仪检测,计算细胞存活率。图9为按照实例3不同浓度的透明质酸-黑色素纳米粒子对于肝癌细胞HepG2的抑制活性;图10为按照实例3不同浓度的透明质酸-黑色素纳米粒子对于肝细胞HL7702的抑制活性。从图9、图10中可以看出对于不同浓度的透明质酸-黑色素纳米粒子,其对于肝癌细胞HepG2与肝细胞HL7702均没有明显的抑制活性。
(四)透明质酸-黑色素纳米粒子复合物分散性与稳定性研究
称取少量实施例4制备获得的透明质酸-黑色素纳米粒子复合物与等质量单纯的黑色素纳米粒子,分别溶于少量蒸馏水中,观察纳米粒子在水中的分散性。将制备的溶液于2℃下静置30天,观察纳米粒子的分散状态,进行对比分析。图11为按照实例4黑色素纳米粒子(图11左a图)与透明质酸-黑色素纳米粒子(图11右b图)分别溶解在蒸馏水中的图;图12为按照实例4黑色素纳米粒子与透明质酸-黑色素纳米粒子分别溶解在蒸馏水中2℃静置30天后的图。从图11发现修饰有透明质酸的黑色素纳米粒子的分散性显著优于单纯的黑色素纳米粒子,且在静置30天后,从图12中可以看出,仍未有明显的沉淀产生。
Claims (4)
1.一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,其特征在于,该方法通过Schiff base反应/Michael addition反应将氨基化的透明质酸与黑色素纳米粒子结合,得到透明质酸-黑色素纳米粒子;
具体包括如下步骤:
步骤一:制备天然黑色素纳米粒子;
步骤二:透明质酸的氨基化:将透明质酸溶解在磷酸盐缓冲溶液PBS中制成4mg/mL的透明质酸溶液,再加入胱胺二盐酸盐,搅拌并调节溶液的pH值至4.75,再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC以活化透明质酸的羧基,混合液搅拌15分钟,期间反应液一直保持在酸性条件pH=4.75;待反应结束,用氢氧化钠溶液调节反应液的pH值至7淬灭反应;再用透析袋在NaCL和去离子水中透析72h,冻干反应液,得到氨基化的透明质酸,并在4℃下备用;
步骤三:黑色素纳米粒子与氨基化的透明质酸的结合:将步骤一制得的黑色素纳米粒子溶于pH=8.5的Tris-HCL缓冲溶液中制成黑色素纳米粒子溶液;称取步骤二制得的氨基化的透明质酸溶解于Tris-HCL缓冲溶液中,并在其中加入配好的黑色素纳米粒子溶液,室温避光搅拌24小时;将反应液用透析袋在去离子水中透析48h,冻干反应液,得到透明质酸-黑色素纳米粒子。
3.如权利要求1所述的透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述步骤二中:透明质酸的分子量为6KDa;
磷酸盐缓冲溶液PBS的物质的量浓度为0.01M,pH=7.4;
胱胺二盐酸盐的物质的量是透明质酸的20倍;
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC的物质的量与透明质酸相等;
所用透析袋的分子量为3500,透析液NaCL的物质的量浓度为0.1M。
4.如权利要求1所述的透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述步骤三中:黑色素纳米粒子溶液的浓度为1mg/mL;黑色素纳米粒子、氨基化的透明质酸的质量比为1:3~1:6。
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