CN103877066B - 载多西他赛和莱菔硫烷的自组装纳米粒的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，提供了一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒，及其制备方法与在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明纳米粒的微观结构包括疏水的PLGA核心和亲水的HA外壳，其中PLGA核心用于包载药物DTX或SFN，而亲水外壳HA可以靶向CD44受体高表达的乳腺癌干细胞。本发明经体外细胞毒性实验表明载药纳米粒比游离药物发挥了更好的抗分化乳腺细胞和乳腺癌干细胞的能力；经体内肿瘤抑制实验表明较游离药物及联用的游离药物更有效，并且系统毒性小。本发明的纳米粒可达到同时靶向分化乳腺癌细胞核乳腺癌干细胞的作用，为乳腺癌治疗提供了一种新策略。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体的说，涉及制备载多西他赛（DTX）和莱菔硫烷（SFN）的PLGA-HA自组装纳米粒，靶向已分化的乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞，以达到根治乳腺癌的目的。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在我国发病率有逐年上升的趋势，并且发病率趋于年轻化。因此，乳腺癌的预防和治疗成为我国医药研究的一项重要任务。目前乳腺癌的治疗已从单一的手术治疗发展到包括手术、化疗、放疗、生物治疗在内的综合疗法。这些方法主要表现为以下几个方面：(1)术后辅助化疗，这种疗法采用互不交叉耐药的多种化疗药物按时序和不同的药物组合进行联合治疗。旨在降低化疗药物的用药剂量、更好的控制药物剂量强度和剂量累计，从而降低化疗药物对正常组织的损伤。(2)术后辅助内分泌治疗，乳腺癌组织中雌激素暴露时间的延长会增加乳腺癌的危险性，基于这样的背景原因，减少或切断雌激素来源，或者设法抵抗雌激素的作用就有可能阻止雌激素对乳腺癌细胞的刺激，抑制乳腺癌的生长。(3)分子靶向治疗，这是基于乳腺癌细胞表面抗原、生长因子受体或细胞内信号转导通路中重要的酶或者蛋白质等的一种治疗方法。其中包括表皮生长因子受体靶向(如赫赛汀)、血管生成抑制因子(如贝伐单抗)以及表皮生长因子受体-酪氨酸酶抑制剂(如吉非替尼)。
尽管，以上的综合疗法与单一的手术治疗、放疗、化疗相比取得了很大的进展，但是这些方法依旧面临着一些问题：(1)辅助化疗和内分泌治疗尽管降低了用药剂量，也减轻了对正常组织的损伤。临床上依旧采用的是全身给药，药物在肿瘤组织中的积累量仅仅是给药量的一小部分，并且药物在体内难以达到长循环的作用很快便代谢消除，需要对患者反复的给药，这对于肿瘤患者来说是雪上加霜。(2)分子靶向给药尽管在靶向性上有了提高，但是这种作用往往是针对乳腺癌病理过程中的某一个单一环节，对于不同的患者而言具有很大 的个体差异性。(3)目前的治疗方法存在一个共同问题：这些疗法中用于乳腺癌治疗的一线药物针对的都是已分化的肿瘤细胞，可以在较短时间内杀灭这类细胞，使肿瘤体积减小甚至消失，然而难以根除乳腺癌的复发，没有从根源上对乳腺癌进行治疗。
随着人们对乳腺癌发生、发展机制的深入研究，近年来在干细胞学说的基础上提出了肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)学说，该学说认为肿瘤干细胞是肿瘤发生的根源。CSC是存在于肿瘤组织中极小部分的未分化的细胞，这类细胞具很强的自我更新能力和分化潜能，并且能不断地产生新的肿瘤干细胞和肿瘤细胞，最新的研究表明乳腺癌干细胞细胞表型为CD44+CD24-。传统的肿瘤治疗如手术切除、放疗、化疗均是针对整个肿瘤组织进行的，虽然消除了大多数的已分化肿瘤细胞，但由于CSC表达多种耐药蛋白如多药耐药蛋白-1，ATP结合盒蛋白等，导致其对化疗、放疗及其他的一些诱导凋亡的治疗不敏感。治疗后残余的CSC进一步增值分化形成新的肿瘤组织，导致肿瘤的复发。靶向肿瘤干细胞治疗为从本质上根除肿瘤提供了一条新的途径。
多西他赛（DTX），是一线化疗药物，其主要的剂型为多西他赛注射液（商品名：泰索帝）,该产品不具备肿瘤靶向性，易产生骨髓抑制，皮肤红斑以及胃肠道反应。并且其溶剂为吐温-80，不实用于对吐温-80过敏的患者使用。另外，莱菔硫烷（SFN）是抗乳腺癌干细胞特异性的药物，但由于其体外对热和碱性条件的不稳定性以及体内的快速消除，其临床运用受到极大的限制。
聚乳酸羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）由于具有良好的组织相容性和生物可降解性而广泛用于组织工程支架。透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA-b-HA）可主动结合乳腺癌及乳腺癌干细胞上高表达的CD44受体，从而介导纳米粒的主动靶向。
目前尚无文献报道载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法。本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的纳米粒，以及该纳米粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
本发明拟将多西他赛和莱菔硫烷联用同时消除分化的乳腺癌及乳腺癌干 细胞，以达到更好的治疗乳腺癌的目的。
进一步地，本发明拟将多西他赛和莱菔硫烷两药包载于纳米粒中，利用PLGA-b-HA纳米粒对肿瘤组织的EPR效应以及主动靶向性，以达到提高疗效降低副作用的目的。
本发明的主要技术方案是选择一线化疗药物-多西他赛和抗乳腺癌干细胞特异性的药物-莱菔硫烷，将其用生物可降解的PLGA-b-HA嵌段共聚物包载后用于乳腺癌的靶向治疗。载多西他赛（DTX）的PLGA-b-HA纳米粒（DTX/NPs）用于消除肿瘤内已分化的乳腺癌细胞，载莱菔硫烷（SFN）的PLGA-b-HA纳米粒（SFN/NPs）用于消除乳腺癌干细胞。
本发明的技术方案包括：
PLGA-b-HA的嵌段共聚物的合成；
载多西他赛和莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒的制备；
载药纳米粒体外抗乳腺癌和乳腺癌干细胞活性；
载药纳米粒体内外抗乳腺癌和乳腺癌干细胞效果分析。
本发明的第一方面，是提供了一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
A、PLGA-b-HA的嵌段共聚物的合成
HA的末端经还原胺化形成丁二胺化的HA，然后再和PLGA的琥珀酰亚胺酯形成两亲嵌段共聚物；
B、载药PLGA-bHA纳米粒的制备
将药物（DTX,SFN）和PLGA-b-HA嵌段聚合物同时溶解于DMSO/DMF（v/v=3:1）的混合溶剂中，磁力搅拌15分钟让材料和药物尽可能的溶解。然后再缓慢的加入一定量的去离子水，继续搅拌15min后将该溶液转入到透析袋中(Spectra/Por,MWCO12000-14000)，透析12小时除去有机溶剂，每两小时换水一次。
步骤A中，所形成的PLGA-b-HA的嵌段共聚物属于线性高分子，并且水性环境中可形成核-壳结构的球形纳米粒。其中的还原胺化的方法为本领域公知方法，可参考文献“Jeong YI,Kim do H,Chung CW,Yoo JJ,Choi KH,Kim CH,et al.Self-assembled nanoparticles of hyaluronic acid/poly(DL-lactide-co-glycolide)block copolymer.Colloids Surf B Biointerfaces2012;90:28-35”，将聚乳酸-羟基乙 酸共聚物（PLGA）和透明质酸（HA）首位相连形成嵌段共聚物。
所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）可选用分子量为10000-35000Da，最佳分子量为13600Da。
所述的透明质酸（HA）可选用分子量为3000-10000Da，最佳分子量为5600Da。
优化的方法为：
(1)末端胺化的HA的制备：按质量比1:30将HA溶解于醋酸/醋酸钠（pH=5.6，2%w/w）的缓冲液中，待HA完全溶解后加入1.0ml的1,4-丁二胺。50℃磁力搅拌形成亚胺，其后加入五分之一于HA质量的氰基硼氢化钠，然后将pH值调节到弱碱性继续于50℃磁力搅拌，并且在接下来连续两天分别再加入同等质量的氰基硼氢化钠；反应结束后，将反应溶液装入透析袋中(Spectra/Por,MWCO3500)，在去离子水中透析；透析结束将袋内溶液冻干待用；
(2)NHS活化的PLGA的制备：按1:10（m/v）的比例将PLGA溶解于二氯甲烷中，再分别加入5倍于PLGA摩尔质量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），室温下磁力搅拌，反应结束后产物用冰冷的乙醚沉淀，再用冰冷的乙醚/甲醇混合液（50/50，v/v）冲洗三次以去除过量的NHS和EDC·HCl，然后将产物真空干燥待用；
(3)PLGA-b-HA的合成：精密称取一定量的PLGA-NHS和1.5倍于PLGA-NHS摩尔质量的丁二胺化的HA将其尽可能分散到一定量的DMSO中最终使PLGA-NHS的含量为25μg/ml，再加入N,N-二异丙基乙胺使其最终含量为1μg/ml，然后在50℃下搅拌48小时，反应结束后将该溶液装入透析袋中(Spectra/Por,MWCO12000-14000)，在去离子水中透析，透析结束将袋内溶液冻干即得PLGA-b-HA嵌段共聚物。
步骤(1)中，可采用：1.0g的HA、30.0ml的醋酸/醋酸钠、1.0ml的1,4-丁二胺、0.2g的氰基硼氢化钠；
步骤(2)中，可采用：1.0g的PLGA、10ml的二氯甲烷中、48.0mg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、80.0mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）；
步骤(3)中，可采用：0.5g的PLGA-NHS、0.35g的胺化的HA、20.0ml的DMSO中、20μl的N,N-二异丙基乙胺。
步骤B中，为了提高药物的载药量，在溶剂-透析法的基础上我们稍作修改，具体的方法为：在含有聚合和药物的有机相中缓慢加入水相，给予聚合物充足的时间将药物包载到疏水核心中，有利于载药量的提高。
步骤B较佳的步骤为：
将PLGA-b-HA嵌段聚合物和DTX按20:1的比例（SFN按1:1的比例）溶解于一定体积的DMSO/DMF（v/v=3:1）的混合溶剂中，使PLGA-b-HA的最终浓度为5-10mg/ml，然后在磁力搅拌下缓慢加入4.0ml的去离子水，继续搅拌将该溶液转入到透析袋中(Spectra/Por,MWCO12000-14000)，透析除去有机溶剂。
步骤B中，可采用：10mg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和0.5mg的DTX，或10mg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和10mg SFN分别溶解于1ml的DMSO/DMF（v/v=3:1）的混合溶剂中。
本发明的第二方面，是提供了根据上述方法制备得到的载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒。
本发明的第三方面，是提供了上述的纳米粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
该应用具体靶向已分化的乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞。
本发明的载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒（载药纳米粒）体外抗乳腺癌和乳腺癌干细胞活性：
本发明采用MTT法测定细胞在经不同药物浓度处理后细胞存活率，来评价药物和载药纳米粒的细胞毒性。细胞的生存曲线经对数模拟后，计算细胞的IC50来定量比较其细胞毒性大小。
莱菔硫烷和载莱菔硫烷的纳米粒的体外抗干细胞活性，乳腺癌细胞在经不同浓度SFN及SFN纳米粒处理后，在无血清悬浮培养基中所形成的乳腺球的数量和大小来评价。
本发明的载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒（载药纳米粒）体内外抗乳腺癌和乳腺癌干细胞效果分析：
（1）体内抗瘤效果评价：
在BABL/c裸鼠的乳垫下注射乳腺癌细胞悬液，建立原位乳腺癌荷瘤小鼠模型。待肿瘤生长到一定体积，药物经尾静脉注射，每三天注射一次，一共注射四次。每两天测定肿瘤的大小（肿瘤体积=长边×短边2/2）和称量小鼠的体 重，分别用于评价抗肿瘤生长作用和毒副作用。荷瘤小鼠经34天治疗观察后，麻醉处死将肿瘤剥离，用PBS洗净血渍，并用滤纸片吸干水分后，称量肿瘤的重量。
（2）体内抗肿瘤干细胞活性评价：
经不同药物组分治疗后的离体肿瘤，经消毒处理后，消化成单细胞悬液，再经无血清培养后，计算乳腺球的的成球率和大小。在蛋白水平上，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定乳腺癌干细胞相关蛋白（β-连环蛋白和细胞周期素D1）。
本发明的PLGA-b-HA可以形成具有核-壳结构的球型纳米粒，该纳米粒的微观结构包括疏水的PLGA核心和亲水的HA外壳，其中PLGA核心用于包载药物（DTX or SFN），而亲水外壳HA可以靶向CD44受体高表达的乳腺癌干细胞。体外细胞毒性实验表明载药纳米粒比游离药物发挥了更好的抗分化乳腺细胞和乳腺癌干细胞的能力。体内肿瘤抑制实验表明载多西他赛纳米粒和莱菔硫烷纳米粒联用后较游离药物及联用的游离药物更有效，并且系统毒性小。体内抗干细胞活性表明SFN的使用可以明显的降低体内干细胞的数量。
因此，本发明的载多西他赛和莱菔硫烷的PLGA-b-HA自组装纳米粒可达到同时靶向分化乳腺癌细胞核乳腺癌干细胞的作用。这是乳腺癌治疗的一种新策略，利用纳米载体的优势，再结合化疗药物和抗干细胞药物的联用效果，可以从其根源上治疗乳腺癌，具有广阔的运用前景。
附图说明
图1是PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成；
其中A为末端丁二胺化的透明质酸的合成；B为PLGA02H活泼酰亚胺酯的合成；C为PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成。
图2是溶剂透析法制备载药的PLGA-b-HA自组装纳米粒。
图3是PLGA-b-HA纳米粒的表征；
其中A为PLGA-b-HA纳米粒的水化粒径分布图；B，C为PLGA-b-HA纳米粒在不同的放大倍率下的透射电镜图片；D，E为PLGA-b-HA的原子力显微镜图片。
图4是载药PLGA-b-HA纳米粒对分化乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞的半数抑制浓度（IC50）；
其中A1和B1为48小时抑制曲线；A2和B2为72小时的抑制曲线。
图5是载莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒体外抗乳腺癌干细胞活性；
其中A，B分别为不同浓度的SFN和载SFN的PLGA-b-HA的纳米粒对乳腺球的形成数量和大小的影响。
图6是载多西他赛和莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒联用体外抗乳腺癌活性评价。
图7是载多西他赛和莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒联用体内抗瘤活性及系统毒性评价；
其中A为不同给药组的肿瘤生长曲线图；B为不同给药组小鼠的体重变化（系统毒性评价）；C为不同给药组小鼠肿瘤离体图片；D为不同给药组治疗34天后离体肿瘤的重量。
图8是体内抗干细胞活性评价；
其中A为经游离药物和载药纳米粒治疗后离体肿瘤细胞再经悬浮培养后形成乳腺球的数量。B，C分别为荷瘤小鼠经不同给药组治疗后β-连环蛋白（β-catenin）和细胞周期素D1（Cyclin D1）在肿瘤组织中的表达分析。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
材料和仪器
PLGA(502H,13600Da)，德国Boehringer Ingelheim公司；
透明质酸(HA,5600Da)，山东福瑞达生物医药有限公司；
多西他赛原料药(>98%)，上海瀚香生物科技有限公司；
D,L-莱菔硫烷（>90%），美国Sigma-aldrich公司；
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，上海阿拉丁试剂有限公司；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，上海阿拉丁试剂有限公司；
碱性成纤细胞生长因子(bFGF)，以色列prospec公司；
内皮生长因子(EGF)、胰岛素，以色列prospec公司；
胎牛血清、胰酶、青链双抗、B27添加物，美国Gibico公司；
其他化学试剂均购自上海国药集团；
杜氏磷酸缓冲液(D-PBS),美国Thermo公司；
万分之一电子天平AL104,梅特勒托利多公司；
十万分之一电子天平MS205DU,梅特勒托利多公司；
数显恒温磁力搅拌器HJ-3,上海和欣科教设备有限公司;
透射电子显微镜JEM2100F，日本JEOL公司；
原子力显微镜Nanoscope IV,美国Veeco公司；
Zetasizer nano ZS激光粒度分析仪，英国马尔文公司；
岛津高效液相色谱仪LC-20A，日本岛津公司。
实施例1:PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成
在参考文献“Jeong YI,Kim do H,Chung CW,Yoo JJ,Choi KH,Kim CH,et al.Self-assembled nanoparticles of hyaluronic acid/poly(DL-lactide-co-glycolide)block copolymer.Colloids Surf B Biointerfaces2012;90:28-35”的基础上，采用还原胺化的方法将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA和透明质酸（HA）首位相连形成嵌段共聚物。
选择型号为RG502H的PLGA和分子量为5600Da的HA作为载体的疏水和亲水端。具体的制备方法为三步，如图1所示：
(1)末端胺化的HA的制备，精密称量1.0g的HA溶解于30.0ml的醋酸/醋酸钠（pH=5.6，2%w/w）的缓冲液中，待HA完全溶解后加入1.0ml的1,4-丁二胺。50℃磁力搅拌24小时形成亚胺，其后加入0.2g的氰基硼氢化钠，然后将pH值调节到弱碱性（pH=8.0）继续于50℃磁力搅拌，并且在接下来连续两天分别再加入0.2g的氰基硼氢化钠。反应结束后，将反应溶液装入透析袋中(Spectra/Por,MWCO3500)，在去离子水中透析72小时，其中前24更换透析液6次其后每12h更换一次透析液。透析结束将袋内溶液冻干待用。
(2)NHS活化的PLGA的制备，精密称取1.0g的PLGA502H溶解于10ml的二氯甲烷中，再分别加入48.0mg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和80.0mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）。室温下磁力搅拌24小时，反应结束后产物用冰冷的乙醚沉淀，再用冰冷的乙醚/甲醇混合液（50/50，v/v）冲洗三次以去除过量的NHS和EDC·HCl。然后将产物真空干燥待用。
(3)PLGA-b-HA的合成，精密称取0.5g的PLGA-NHS和0.35g的胺化的HA将其尽可能分散到20.0ml的DMSO中再加入20μl的N,N-二异丙基乙胺，然后在50℃下搅拌48小时。反应结束后将该溶液装入透析袋中(Spectra/Por,MWCO 12000-14000)，在去离子水中透析72小时，其中前24更换透析液6次其后每12h更换一次透析液。透析结束将袋内溶液冻干即得PLGA-b-HA嵌段共聚物。
实施例2:载多西他赛和莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒的制备
本发明在溶剂透析法（参见：Shahin M,Lavasanifar A.Novel self-associating poly(ethylene oxide)-bpoly(epsilon-caprolactone)based drug conjugates and nano-containers for paclitaxel delivery.Int J Pharm2010;389:213e22.）的基础上做了相应的改良来制备载药的PLGA-b-HA纳米粒。溶剂透析法是直接将药物和聚合物材料溶解于水溶性有机溶剂，然后在去离子水或者缓冲盐中透析去除有机溶剂得到载药纳米粒，而我们修改后方法是：在溶解了药物和聚合物材料的有机相中缓慢加入去离子水搅拌下形成载药纳米粒，然后再透析去除有机溶剂。这样改进的目的是能提高药物的载药量（图2）。利用该方法我们分别制备载多西他赛的PLGA-b-HA纳米粒（DTX/NPs）和载莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒（SFN/NPs）。
DTX/NPs具体制备步骤：将10mg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和0.5mg的DTX溶解于1ml的DMSO/DMF（v/v=3:1）的混合溶剂中，磁力搅拌15分钟让材料和药物尽可能的溶解。然后再缓慢的加入4.0ml的去离子水，继续搅拌15min后将该溶液转入到透析袋中(Spectra/Por,MWCO12000-14000)，透析12小时除去有机溶剂，每两小时换水一次。收集形成的载药纳米粒测定其粒径，冷冻干燥后测载药量和包封率。
SFN/NPs具体制备步骤：将10mg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和10mg SFN溶解于1ml的DMSO/DMF（v/v=3:1）的混合溶剂中，磁力搅拌15分钟让材料和药物尽可能的溶解。然后再缓慢的加入4.0ml的去离子水，继续搅拌15min后将该溶液转入到透析袋中(Spectra/Por,MWCO12000-14000)，透析12小时除去有机溶剂，每两小时换水一次。收集形成的载药纳米粒测定其粒径，冷冻干燥后测载药量和包封率。
通过溶剂透析发制备的PLGA-b-HA纳米粒的水化粒径为110nm（图3A），透射电镜(图3B和图3C)和原子力显微镜(图3D和图3E)表明本发明制备的PLGA-b-HA纳米粒为球形的，具备典型的核-壳结构，其疏水内核包载DTX和SFN提供必要的条件，而亲水的外壳是主动靶向乳腺癌干细胞的配体。通过该实验表明本发明制备的PLGA-b-HA自组装纳米粒具备明确的微观结构。
实施例3:载药纳米粒体外对乳腺癌和乳腺癌干细胞的半数抑制浓度（IC50）
本发明采用MTT法（参见Tim Mosmann，Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays，Journal of Immunological Methods,，1983，65(1–2):55–6,3）评价载药纳米粒对乳腺癌和乳腺癌干细胞的体外细胞毒性，即IC50值。现在分别阐述对乳腺癌细胞（MCF-7）和乳腺癌干细胞（通过悬浮培养筛选）体外毒性的评价。
1.对乳腺癌的毒性评价：
（1）对数生长期的MCF-7细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度至5×104个/mL，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，即每孔加入0.1ml的单细胞悬液，接种好的细胞于37℃，5%CO2的条件下培养12h让细胞贴壁。
（2）含药培养基的配置。
空白对照：培养基
阴性对照：细胞+培养基
实验组：细胞+不同含药培养基
按如下药物浓度分别配置好含有游离药物和载药PLGA-b-HA纳米粒的培养基。
DTX：50,25,12.5,6.25,3.13,1.56,0.78,0.39,0.20nM
SFN：50,40,30,25,20,12.5,6.25,3.13,1.56μM
（3）待细胞贴壁后将培养基更换为含药培养于37℃，5%CO2的条件下培养48h，其后每孔加入20μl的MTT溶液（5mg/ml溶解于pH=7.4的PBS）再孵育4h。
（4）小心去除96孔板的液体，每孔加入150μl的DMSO溶解形成的甲瓒，摇床上振摇10分钟，以溶解紫色甲瓒结晶，使其充分溶解混匀，然后置于酶标仪于490nm测定各孔OD值。
细胞生存率（%）＝（实验组OD值－空白组OD值）/（阴性对照组OD值－空白组OD值）×100%。
2.对乳腺癌干细胞的毒性评价
对乳腺癌干细胞的毒性评价与乳腺癌类似，但由于干细胞的特性和其培养方式的不同（乳腺癌干细胞为悬浮细胞）操作步骤上略有差异。
（1）成球生长的乳腺癌干细胞细胞，经胰酶消化后，用PBS洗涤三次除去 胰酶和血清等，调整细胞密度至5×104个/mL，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，即每孔加入0.1ml的单细胞悬液，接种好的细胞于37℃，5%CO2的条件下培养12h让细胞恢复良好的状态。
（2）含药培养基的配置。
空白对照：培养基
阴性对照：细胞+培养基
实验组：细胞+不同含药培养基
按如下药物浓度分别配置好含有游离药物和载药PLGA-b-HA纳米粒的无血清培养基，此培养基为最终浓度的两倍浓度。
DTX：200,100,50,25,12.5,6.25,3.13,1.56,0.78nM
SFN：100,80,60,50,40,25,12.5,6.25,3.13,1.56μM
（3）待细胞孵育12小时恢复状态后在原有的100μl的无血清培养基的基础上加入100μl的含药培养基，使其最终药物浓度均：
DTX：100,50,25,12.5,6.25,3.13,1.56,0.78,0.39nM
SFN：50,40,30,25,20,12.5,6.25,3.13,1.56μM
再于37℃，5%CO2的条件下培养48h，其后每孔加入20μl的MTT溶液（上海生工生物工程公司生产，5mg/ml溶解于pH=7.4的PBS）再孵育4h。
（4）将96孔板于3000转下离心15分钟，让悬浮的细胞和甲瓒均离心到底部，小心除去老的培养基后每孔加入150μl的DMSO溶解形成的甲瓒，摇床上振摇10分钟，以溶解紫色甲瓒结晶，使其充分溶解混匀，然后置于酶标仪于490nm测定各孔OD值。
以细胞生存率对药物浓度作图，得到乳腺癌和乳腺癌干细胞在不同处理组下的生存曲线图，通过对数模拟曲线计算各药物对乳腺癌及乳腺癌干细胞的IC50值
通过乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的生存曲线，可以初步确定载药的PLGA-b-HA纳米粒比游离的药物具有更强的杀伤效果(图4A和图4B)。
经对数模拟后计算的IC50值可以看出在48小时和72小时的时候载药纳米粒都显示了更佳的疗效，说明本发明的载药PLGA-b-HA纳米粒的确可以取得很好的乳腺癌和乳腺癌干细胞向效果(表1)。
表1：游离药物和载药纳米粒对分化乳腺癌和乳腺癌干细胞的IC50值
实施例4:载莱菔硫烷的PLGA-b-HA的体外抗干细胞活性分析
由于已分化的乳腺癌细胞在无血清悬浮培养下无法生存，而乳腺癌干细胞可以在该条件下以悬浮球的形态进行增值。因此，本发明采用形成悬浮球的数量及大小来评价SFN及SFN/NPs的抗干细胞活性。
（1）对数期的MCF-7细胞，经胰酶消化，PBS洗涤三次后用无血清悬浮培养基调节细胞密度至5000个/ml，取0.1ml接种于96孔板中即500个/孔，将细胞置于细胞于37℃，5%CO2的条件下培养12h让细胞恢复良好的状态。
（2）含药培养基的配置
对照组：无血清培养基
空白纳米粒组：空白纳米粒+无血清培养基
实验组：SFN:1,2,5,10μM
（3）待细胞孵育12小时恢复状态后在原有的100μl的无血清培养基的基础上加入100μl的含药培养基，使其最终药物浓度均：SFN:0.5,1,2.5,5μM。将给药后的细胞在37℃，5%CO2的条件下培养7天。计算形成乳腺球的数量并记录其图片。
如图5所示，空白的PLGA-b-HA纳米粒对乳腺球的形成率和大小均无影响。载SFN的PLGA-b-HA纳米粒与同等浓度的游离SFN相比，乳腺球的形成率明显降低(图5A)，并且乳腺球的大小也相对更小(图5B)，说明在体外SFN的
PLGA-b-HA纳米粒显比游离的SFN具有更好的抗乳腺癌干细胞的活性。本实验可以证明本发明中的载PLGA-b-HA的纳米粒能靶向乳腺癌干细胞。
实施例5:载药纳米粒体外联用抗乳腺癌的活性分析
（1）对数期的MCF-7细胞经胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度至5×104个/mL，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，即每孔加入0.1ml的单细胞悬液，接种好的细胞于37℃，5%CO2的条件下培养12h让细胞贴壁。
（2）实验分组
将DTX的浓度固定于5nM(DTX对MCF-7的IC50值为8.5±1.1)，SFN的浓度分别为1,5,10,15μM，具体分组如下：
空白组：培养基
游离药物组：DTX(5nM);SFN(1,5,10,15μM)
游离药联用组：DTX(5nM)+SFN(1,5,10,15μM)
纳米粒联用组：DTX/NPs(5nM)+SFN/NPs(1,5,10,15μM)
（3）待细胞贴壁后将培养基更换为含药培养于37℃，5%CO2的条件下培养48h，其后每孔加入20μl的MTT溶液（5mg/ml溶解于pH=7.4的PBS）再孵育4h。
（4）小心去除96孔板的液体，每孔加入150μl的DMSO溶解形成的甲瓒，摇床上振摇10分钟，以溶解紫色甲瓒结晶，使其充分溶解混匀，然后置于酶标仪于490nm测定各孔OD值。细胞生存率（%）＝（实验组OD值－空白组OD值）/（阴性对照组OD值－空白组OD值）×100%。
图6显示了多西他赛和不同比例的莱菔硫烷联用后对MCF-7的细胞毒性，可以得到以下结果。
（1）SFN浓度为1,5μM时对MCF-7的抑制作用较弱，但SFN/NPs在所有浓度下（1,5,10,15μM)对MCF-7的抑制作用强于SFN。
（2）当固定DTX的浓度于5nM并与不同浓度的SFN联通后对MCF-7的抑制作用要明显优于5nM的DTX和同等浓度下的SFN，说明DTX和SFN的联用可发挥更好的疗效。
（3）SFN/NPs+DTX/NPs5nM对MCF-7的抑制作用要强于游离药物组（SFN+DTX5nM），说明载药纳米粒可增强对乳腺癌细胞的抑制作用。
实施例6:载药纳米粒体内治疗乳腺癌效果分析
对数期的MCF-7细胞经胰酶消化后，用血清/基质胶（v/v=1:1）调节细胞密度至2×107个/ml，置于4℃保存待用。在BABL/c裸鼠（5-6周六龄）左边乳垫注射0.1ml的已配置好的细胞悬液（2×106个细胞/只）。待肿瘤体积增长到150mm3后将荷瘤小鼠随机分为7组每组6只：(1)PBS;(2)DTX;(3)SFN;(4)DTX+SFN;(5)DTX/NPs;(6)SFN/NPs;(7)DTX/NPs+SFN/NPs。药物和载药纳米粒经尾静脉注射，其中DTX和SFN均按10mg/Kg的剂量给药，每三天给 药一次，一共注射4次。每两天测定小鼠的体重和肿瘤体积，肿瘤体积（V）=长边×短边2/2。通过生长曲线及最终肿瘤的重量来评价抗瘤效果，通过平均体重来表征各组分的系统毒性。
图7显示了DTX和SFN及其纳米粒体内抗瘤效果，可以得到以下结果：(1)经游离药物或者载药纳米粒治疗后，肿瘤的生长明显受到抑制（图7A）；
(2)DTX和SFN联用以后，比其中任何药物单用取得更好的治疗效果（图7B）；
(3)载药纳米粒组均比游离药物组对肿瘤的抑制作用明显，其中DTX/NPs+SFN/NPs组取得最佳治疗效果（图7B）；
(4)DTX具有明显的系统毒性（体重降低），并且联合SFN治疗后也有相当大的副作用，而载药纳米粒可以明显的降低这种副作用（图7D）
因此，体内抗瘤实验证明载药后PLGA-b-HA可以有效的靶向乳腺癌并且降低副作用。
实施例7:体内抗干细胞活性分析
1.乳腺球形成率
小鼠经麻醉后处死，取出肿瘤保存于4℃待用。取离体肿瘤组织0.1g用75%的乙醇浸泡5min除菌后，用PBS洗涤3次，用手术剪将肿瘤组织剪成1mm3的小块，然后用2倍于肿瘤组织的1mg/ml的胶原酶Ⅰ溶液（50mM TES，0.36mM的CaCl2，pH=7.4）在37℃消化15min。消化后的组织液过40μm的细胞滤网，得到单细胞悬液，用含10%血清的DMEM培养基37℃，5%CO2的条件下培养12h，让活细胞贴壁。PBS洗涤三次去除死细胞后，经胰酶消化，再用PBS洗涤3次，用无血清培养基稀释成细胞密度为2000个/ml，取1.0ml的该细胞悬液接种于6孔板中，再添加3.0ml的无血清培养基，摇匀后于37℃，5%CO2的条件下培养7天，计算肿瘤球的形成率。
2.β-连环蛋白和细胞周期素D1的测定
取离体肿瘤组织0.1g用PBS冲洗干净，用组织匀浆器将其制备成1.0ml的组织匀浆，再于-20冻存。反复冻融两次破裂细胞，在5000g下离心5min，取上清液待用。上清液中的β-连环蛋白和细胞周期素D1的浓度分别用β-连环蛋白和细胞周期素D1的ELISA试剂盒测定。将所得的浓度换算为以对照组（PBS组）的相对浓度：相对浓度(RC)=（C实验组/C对照组）×100%。
本发明将治疗后的离体肿瘤细胞再次悬浮培养，以形成乳腺球的数量来评价其体内抗乳腺癌干细胞活性。另外从蛋白的角度，考察了经治疗后的离体肿瘤细胞中乳腺癌干细胞相关蛋白（β-连环蛋白和细胞周期素D1）的表达。
实验结结果如图8所示：
（1）经DTX和DTX/NPs治疗后，乳腺球的比例较生理盐水处理组更高，这可能是DTX杀死分化的乳腺癌细胞，最后导致乳腺癌干细胞在肿瘤中的比例有所上升，这也是化疗后乳腺癌复发的原因（图8A）。
（2）经SFN及SFN/NPs治疗后，乳腺球的生成有明显的降低，并且SFN/NPs取得了更好的效果，说明SFN/NPs也可以在体内靶向乳腺癌干细胞（图8A）。
（3）经含有SFN及SFN/NPs成分治疗后的肿瘤中所含的β-连环蛋白和细胞周期素D1有明显的降低（图8B）
本实验说明本发明在体内起着抗干细胞活性的成分是SFN，并且载药的SFN纳米粒可更好的靶向乳腺癌干细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (9)
1.一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
A、PLGA-b-HA的嵌段共聚物的合成
HA的末端经还原胺化形成丁二胺化的HA，然后再和PLGA的琥珀酰亚胺酯形成两亲嵌段共聚物，具体为：
(A1)末端胺化的HA的制备：按质量比1:30将HA溶解于pH＝5.6、2％w/w的醋酸/醋酸钠缓冲液中，待HA完全溶解后加入1.0ml的1,4-丁二胺；50℃磁力搅拌形成亚胺，其后加入五分之一于HA质量的氰基硼氢化钠，然后将pH值调节到弱碱性继续于50℃磁力搅拌，并且在接下来连续两天分别再加入同等质量的氰基硼氢化钠；反应结束后，将反应溶液装入Spectra/Por,MWCO 3500的透析袋中，在去离子水中透析；透析结束将袋内溶液冻干待用；
(A2)NHS活化的PLGA的制备：按1:10m/v的比例将PLGA溶解于二氯甲烷中，再分别加入5倍于PLGA摩尔质量的N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌，反应结束后产物用冰冷的乙醚沉淀，再用冰冷的v/v为50/50的乙醚/甲醇混合液冲洗三次以去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后将产物真空干燥待用；
(A3)PLGA-b-HA的合成：精密称取一定量的PLGA-NHS和1.5倍于PLGA-NHS摩尔质量的丁二胺化的HA将其分散到一定量的DMSO中最终使PLGA-NHS的含量为25μg/ml，再加入N,N-二异丙基乙胺使其最终含量为1μg/ml，然后在50℃下搅拌48小时，反应结束后将该溶液装入Spectra/Por,MWCO 12000-14000的透析袋中，在去离子水中透析，透析结束将袋内溶液冻干即得PLGA-b-HA嵌段共聚物；
B、载药PLGA-b-HA纳米粒的制备
将多西他赛和步骤A制备得到的PLGA-b-HA嵌段聚合物按重量比为1:20的比例同时溶解于v/v＝3:1的DMSO/DMF混合溶剂中，磁力搅拌15分钟；然后再缓慢的加入一定量的去离子水，继续搅拌15min后将该溶液转入到Spectra/Por,MWCO 12000-14000的透析袋中，透析12小时除去有机溶剂，每两小时换水一次；
将莱菔硫烷和步骤A制备得到的PLGA-b-HA嵌段聚合物按重量比为1:1的比例同时溶解于v/v＝3:1的DMSO/DMF混合溶剂中，磁力搅拌15分钟；然后再缓慢的加入一定量的去离子水，继续搅拌15min后将该溶液转入到Spectra/Por,MWCO 12000-14000的透析袋中，透析12小时除去有机溶剂，每两小时换水一次；
收集载多西他赛的PLGA-b-HA纳米粒和载莱菔硫烷的PLGA-b-HA纳米粒联用。
2.根据权利要求1所述的一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000-35000Da。
3.根据权利要求1所述的一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为13600Da。
4.根据权利要求1所述的一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述的透明质酸的分子量为3000-10000Da。
5.根据权利要求1所述的一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述的透明质酸的分子量为5600Da。
6.根据权利要求1所述的一种载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤B为：
将PLGA-b-HA嵌段聚合物和多西他赛按重量比为20:1的比例溶解于v/v＝3:1的DMSO/DMF混合溶剂中，使PLGA-b-HA的最终浓度为5-10mg/ml，然后在磁力搅拌下缓慢加入4.0ml的去离子水，继续搅拌将该溶液转入到Spectra/Por,MWCO 12000-14000的透析袋中，透析除去有机溶剂；
将PLGA-b-HA嵌段聚合物和莱菔硫烷按重量比为1:1的比例溶解于v/v＝3:1的DMSO/DMF混合溶剂中，使PLGA-b-HA的最终浓度为5-10mg/ml，然后在磁力搅拌下缓慢加入4.0ml的去离子水，继续搅拌将该溶液转入到Spectra/Por,MWCO 12000-14000的透析袋中，透析除去有机溶剂。
7.一种如权利要求1-6任一方法制备得到的载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒。
8.一种如权利要求7所述的载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的载多西他赛和莱菔硫烷的透明质酸修饰的聚乳酸羟基乙酸共聚物自组装纳米粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，该应用具体靶向已分化的乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞。
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