CN104436203A

CN104436203A - 一种维生素e琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104436203A
Application number: CN201410652132.2A
Authority: CN
Inventors: 侯琳; 任俊晓; 张振中; 冯倩华; 单晓宁; 王亚婷; 杨晓敏; 石宇洋
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明涉及维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法及其应用，可有效解决维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备，并实现在抗肿瘤药物中的应用问题，方法是，将透明质酸分别通过亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺为连接臂和维生素E琥珀酸酯按重量比1:1~100共价连接，在水介质中形成纳米胶束；所述透明质酸为分子量大于等于600道尔顿且小于等于400 kd的低分子量透明质酸；所述连接臂为碳原子数2~12的亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺，二硫代亚烷基二胺中的二硫键在体内具有氧化还原敏感性，能够在肿瘤细胞内部靶向的释放抗肿瘤药物，本发明以HA为骨架，载药量高，药物易释，有效用于制备抗肿瘤药物，解决治疗肿瘤的用药问题，是治疗肿瘤药物上的一大创新。

Description

一种维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸作为药物载体的一种维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法及其应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的主要疾病,肿瘤的化疗已成为当今治疗恶性肿瘤最有效、最具潜力的方法,也是临床上常用的治疗癌症的主要手段。近年来,随着化疗药物不断问世,使得临床肿瘤治疗康复水平有了很大提高。但是也存在许多肿瘤化疗效果不理想的问题,肿瘤细胞对药物的耐药性严重地影响了药物的临床化疗效果。据美国癌症协会估计,90％以上的肿瘤患者死于不同程度的肿瘤细胞耐药性。因此开发抗肿瘤耐药性的药物制剂势在必行。

研究发现，CD44是一种在许多肿瘤细胞表面过表达的跨膜糖蛋白，已成为肿瘤靶向制剂的热点靶点之一。CD44与透明质酸(hyaluronic acid,HA)结合的高度特异性和HA良好的生物相容性是设计和制备HA介导的肿瘤靶向给药系统的关键。卵巢癌、结肠癌、胃癌、急性白血病等多种癌症的肿瘤细胞都大量表达了HA受体CD44和RHAMM，因此，这些肿瘤细胞具有很高的HA结合和吸收能力。有实验证明，HA很容易与肿瘤细胞细胞膜结合，并且能够很快地通过HA与受体的相互作用进入细胞内，这就意味着HA能够作为一个很好的载体把抗癌药物运输进入肿瘤细胞。

维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然维生素E的酯化衍生物，可诱导肿瘤细胞凋亡，却对正常细胞组织没有毒性作用。研究报道VES作用于白血病细胞、前列腺癌细胞等后，Bcl-2蛋白表达下降。Bcl-2蛋白是一种重要的细胞凋亡抑制蛋白，有研究报道，Bcl-2可使肿瘤细胞对紫杉醇产生抗药性，而降低细胞Bcl-2的水平则可使细胞对紫杉醇敏感。这种特点使得VES成为一种很有前途的抗肿瘤耐药性的药物。但如何制备维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，并实现制备抗肿瘤药物中的应用，至今未见有公开的报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法及其应用，可有效解决维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备，并实现在抗肿瘤药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法，将透明质酸分别通过亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺为连接臂和维生素E琥珀酸酯按重量比1:1～100共价连接，在水介质中形成纳米胶束；所述透明质酸为分子量大于等于600道尔顿且小于等于400kd的低分子量透明质酸；所述连接臂为碳原子数2～12的亚烷基二胺(如乙二胺、1,2-丙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,10-癸胺等)或二硫代亚烷基二胺(如胱胺、3,3’-二硫代二丙胺、4,4’-二硫代二丁胺等)；所述二硫代亚烷基二胺中的二硫键在体内具有氧化还原敏感性，能够在肿瘤细胞内部靶向的释放抗肿瘤药物，具体步骤如下：

(1)透明质酸(HA)的氨化：将20～200mg透明质酸溶于10～100ml有机溶剂或缓冲液中，以100～500mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、50～300mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温反应10～200min，得反应溶剂；将亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺按与透明质酸5～10︰1的摩尔比加入上述反应溶剂中，室温反应6-48h，再加入丙酮沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得氨化的透明质酸；

所述的有机溶剂为甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的一种；

所述的缓冲液为pH7～10的磷酸盐缓冲液；

(2)将50～300mg维生素E琥珀酸酯溶于10～100ml反应溶剂中，以100～500mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、50～300mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，维生素E琥珀酸酯的羧基和上述氨化的透明质酸中的氨基按摩尔比1︰1进行缩合反应6-48h，得反应液，再加入反应液体积2-3倍的丙酮进行沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，一端具有亲水性，另一端具有疏水性，在水介质中形成纳米胶束；

所述反应溶剂为水、或甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂，或其它类似溶剂以及其它类似溶剂的混合物。

该维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸可有效用于制备抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物为抗肿瘤药物组合物，该组合物是由维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸和药学活性或药理活性分子按重量比1:1～5制成载药纳米胶束，所述药学活性或药理活性分子为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌的抗肿瘤药物，该抗肿瘤组合药物可以加工为注射剂、冻干粉针、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂或凝胶剂，有效用于对癌症的治疗，有效克服肿瘤的耐药性。

由上述可以看出，本发明以HA为骨架，在其羧基上通过亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺为连接臂，引入含羧基的VES，由于HA-VES含有亲水性多糖部分HA和疏水性部分VES，使其具有了两亲性，故HA-VES可作为抗肿瘤耐药性的药物载体，构建一种新型的抗肿瘤耐药性的药物传递系统，兼具聚合物胶束的特征：(1)HA-VES可在水介质中自发形成纳米胶束，从而能够避免使用有机溶剂、表面活性剂、交联剂等；(2)HA-VES胶束的内核具有疏水性，能够利用物理包埋的方式增溶疏水性抗肿瘤药物，进而提高载药量；(3)由于疏水性药物是以非共价的方式结合到HA-VES胶束的内核中，所以药物能够较为容易的释放出来，有效用于制备抗肿瘤药物，解决治疗肿瘤的用药问题，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：

(1)透明质酸(HA)的氨化：将80-140mg透明质酸溶于40-70ml有机溶剂或缓冲液中，以200-400mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、100-200mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温反应10～200min，得反应溶剂；将亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺按与透明质酸6-8︰1的摩尔比加入上述反应溶剂中，室温反应6-48h，再加入丙酮沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得氨化的透明质酸；

(2)将100-200mg维生素E琥珀酸酯溶于40-70ml反应溶剂中，以200-400mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、100-200mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，维生素E琥珀酸酯的羧基和上述氨化的透明质酸中的氨基按摩尔比1︰1进行缩合反应6-48h，得反应液，再加入反应液体积2-3倍的丙酮进行沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，一端具有亲水性，另一端具有疏水性，在水介质中形成纳米胶束。

实施例2

本发明在具体实施中，还可由以下方法实现：

(1)透明质酸(HA)的氨化：将110mg透明质酸溶于55ml有机溶剂或缓冲液中，以300mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、175mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温反应10～200min，得反应溶剂；将亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺按与透明质酸7.5︰1的摩尔比加入上述反应溶剂中，室温反应6-48h，再加入丙酮沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得氨化的透明质酸；

(2)将175mg维生素E琥珀酸酯溶于55ml反应溶剂中，以300mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、175mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，维生素E琥珀酸酯的羧基和上述氨化的透明质酸中的氨基按摩尔比1︰1进行缩合反应6-48h，得反应液，再加入反应液体积2-3倍的丙酮进行沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，一端具有亲水性，另一端具有疏水性，在水介质中形成纳米胶束。

实施例3

本发明在具体实施中，还可由以下方法实现：

(1)、取100mg透明质酸、498mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、300mg羟基琥珀酰亚胺，溶解在10ml甲酰胺中，室温搅拌30min。将上述反应液缓慢滴入0.5M乙二胺的甲酰胺溶液中，冰浴条件下滴加1h，升至室温反应3h。反应结束后，加入丙酮，沉淀，抽滤，加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得用乙二胺氨化的透明质酸(HA-EN)；

(2)、取50mg维生素E琥珀酸酯溶于30ml二甲基甲酰胺中，加入60mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、35mg羟基琥珀酰亚胺，室温反应15min，成反应液，在反应液中加入20mg乙二胺氨化的透明质酸，室温反应24h，反应结束后，加入丙酮，沉淀，抽滤，加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物——乙二胺作为连接臂的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸(HA-EN-VES)。

实施例4

本发明在具体实施中，还可由以下方法实现：

(1)、取100mg透明质酸，溶解于25ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入498mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、300mg羟基琥珀酰亚胺搅拌活化15min，加入561mg胱胺，室温搅拌反应4h，反应液用0.1mmol/L的NaCl溶液透析1d后再用纯水透析1d，冷冻干燥即得用胱胺氨化的透明质酸(HA-CYS)；

(2)、取50mg维生素E琥珀酸酯溶于30ml二甲基甲酰胺中，加入60mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、35mg羟基琥珀酰亚胺，室温反应15min，成反应液，在反应液中加入20mg胱胺氨化的透明质酸，室温反应24h，反应结束后，加入丙酮，沉淀，抽滤，加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物——胱胺作为连接臂的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸(HA-CYS-VES)。

上述方法制备的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸可有效用于制备抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物为抗肿瘤药物组合物，该组合物是由维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸和药学活性或药理活性分子按重量比1:1～5制成载药纳米胶束，所述药学活性或药理活性分子为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌的抗肿瘤药物，该抗肿瘤组合药物可以加工为注射剂、冻干粉针、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂或凝胶剂，有效用于对癌症的治疗，有效克服肿瘤的耐药性。

所述的制成载药纳米胶束，是10mg维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸与水按重量比3～50:1000的比例探头超声溶解，与经0.5～5ml溶剂溶解的10～50mg抗肿瘤药物物理混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌24小时后采用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂及游离药物，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束，所述溶剂为水、无水乙醇、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

由上述可以看出，本发明的目的是提供一种兼具抗肿瘤耐药性、肿瘤细胞靶向性以及良好生物相容性的HA-VES，本发明使用了亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺作为连接臂，载体的合成工艺和化学结构均较为简单，避免了为提高生物相容性、抗肿瘤耐药性、稳定性及靶向性而引入多种分子基团，此外，可物理包裹疏水性抗肿瘤药物，从而达到治疗耐药性肿瘤的效果。

本发明的另一个目的是提供包含上述HA-VES的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供上述HA-VES及包含上述HA-VES药物组合物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述HA-VES及其药物组合物在制药中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是将HA通过亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺作为连接臂和VES共价连接，从而在水介质中自发形成纳米胶束，物理包裹疏水性抗肿瘤药物，构成HA-VES/药物组合物。由于VES具有抗肿瘤耐药性，故该体系可实现对耐药性肿瘤的治疗，并经有关实验得到了充分证明，有关实验资料如下：

1、负载药学活性或药理活性分子的HA-EN-VES纳米胶束的制备和表征

(1)、制备工艺：维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸2mg，溶解于5ml水中搅拌30min，冰浴条件下探头超声30min，5mg药学活性或药理活性分子溶解在乙醇中，然后二者混合，冰浴条件下探头超声30min，室温搅拌过夜，重蒸水透析1d，离心(4000rpm)15min，冷冻干燥即得负载药学活性或药理活性分子的HA-EN-VES纳米胶束。

(2)、维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸纳米胶束中药学活性或药理活性分子含量的测定

采用紫外分光光度法，于227nm波长处测定药学活性或药理活性分子的含量，以式(1)计算载药量：

式(1)

以负载紫杉醇的HA-EN-VES纳米胶束的制备和表征为例，将HA-EN-VES 2mg，溶解于5ml水中搅拌30min，冰浴条件下探头超声30min。5mg紫杉醇(PTX)溶解在乙醇中，然后二者混合，冰浴条件下探头超声30min，室温搅拌过夜，重蒸水透析1d，离心(4000rpm)15min，冷冻干燥即得负载紫杉醇的HA-EN-VES纳米胶束(HA-EN-VES/PTX)，采用紫外分光光度法，于227nm波长处测定紫杉醇的含量，以式(1)计算样品的载药量，载药量达到30％；取适量HA-EN-VES/PTX溶解于水中，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为145.8nm和-18.78±0.24mv。

负载紫杉醇的HA-CYS-VES纳米胶束的制备和表征

1、制备工艺：HA-CYS-VES 2mg，溶解于5ml水中搅拌30min，冰浴条件下探头超声30min。5mg紫杉醇(PTX)溶解在乙醇中，然后二者混合，冰浴条件下探头超声30min，室温搅拌过夜，重蒸水透析1d，离心(4000rpm)15min，冷冻干燥即得负载紫杉醇的HA-CYS-VES纳米胶束(HA-CYS-VES/PTX)。

2、HA-CYS-VES/PTX纳米胶束中紫杉醇含量的测定

采用紫外分光光度法，于227nm波长处测定紫杉醇的含量。以式(1)计算样品的载药量。载药量达到34％。

3、HA-CYS-VES/PTX纳米胶束的粒径和电位的测定

取适量HA-CYS-VES/PTX溶解于水中，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为144.2nm和-17.78±0.41mv。

HA-EN-VES/PTX，HA-CYS-VES/PTX纳米胶束对耐紫杉醇EC109细胞的增殖抑制实验

采用MTT法,选择对数生长期的耐紫杉醇EC109细胞,调整细胞数为2.5×10⁴/ml接种于96孔培养板,每孔200μ1,24h后,实验组分别给予终浓度为0,0.1,1,5,10,20mg/L PTX、PTX+VES物理混合、HA-EN-VES/PTX和HA-CYS-VES/PTX，同时设立二甲基亚砜(DMSO)和RPM I1640液为对照。每组的每个浓度设3个复孔。48h后,每孔加入20μl 5g/L MTT，孵育4h后弃上清，加入DMSO终止反应。微振荡后,于酶标仪波长570nm处测吸光度(A)。计算抑制率(％)＝(1-实验组A/对照组A)×100％，由此得出上述样品的半数抑制浓度(IC50)依次为10.11，8.47，1.53，1.12mg/L。

耐紫杉醇EC109细胞对HA-EN-VES/PTX，HA-CYS-VES/PTX纳米胶束的摄取实验

将处于对数生长期的耐紫杉醇EC109细胞以3×10⁵个/孔接种于6孔板，贴壁生长24h后加药，依次为PTX、PTX+VES物理混合、HA-EN-VES/PTX和HA-CYS-VES/PTX，药物终浓度设为5μg/ml，另设有空白细胞对照组以及FITC摄取组。加药后在37℃，5％CO₂条件下培养4h后，将孔内含药培养基移入10mlEP管中，1ml PBS洗两遍，PBS移入上述10mlEP管中，每孔加入500μl不含EDTA的胰酶消化细胞，加1ml培养基终止消化，将细胞悬液移入上述10mlEP管中。1000rpm,10min离心，弃去上清，加2mlPBS重悬，1000rpm,10min离心，弃去上清，加500μl PBS重悬，转移至1.5mlEP管中，用流式细胞仪测定，发现耐紫杉醇EC109细胞对PTX的摄取量为20.1％，对PTX+VES物理混合的摄取量为25.2％，对HA-EN-VES/PTX的摄取量为78.5％，对HA-CYS-VES/PTX的摄取量为83.7％。

HA-EN-VES/PTX，HA-CYS-VES/PTX纳米胶束的药效学实验

裸鼠50只(雌性，3～4周龄)，接种处于对数生长期的耐紫杉醇EC109细胞，7天后测量肿瘤体积，取其中30只肿瘤体积≥100mm³且肿瘤体积和体重相似的荷瘤裸鼠，将其随机分为5组，每组6只。具体分组如下：空白组、PTX组、PTX+VES物理混合组、HA-EN-VES/PTX组和HA-CYS-VES/PTX组。5组裸鼠的给药方式均采用尾静脉注射，隔天一次，共给药7次。整个实验过程中保证裸鼠每日正常饮食，每隔一天称量每只裸鼠的体重，并使用数显游标卡尺测量荷瘤裸鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V＝A×B²/2计算肿瘤体积。记录的数据表明，给药结束时与给药前相比，空白组裸鼠的瘤体积增长70％，PTX组裸鼠的瘤体积增加20％,PTX+VES物理混合组裸鼠的瘤体积减小30％，HA-EN-VES/PTX组裸鼠的瘤体积减小了52％,HA-CYS-VES/PTX组裸鼠的瘤体积减小了59％。实验表明，本发明方法制备的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸可有效用于对肿瘤的治疗，实现在制备抗肿瘤药物中的应用，与现有技术相比，具有以下显著的有益效果：

(1)本发明选择具有抗肿瘤耐药性的VES为修饰分子，以亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺为连接臂，用一种简单经济和容易实现工业化生产的方法对HA进行修饰，条件温和、反应简单、产率高；

(2)本发明提供的HA-VES结构较为简单，具有优良的生物相容性和稳定性，还能够实现肿瘤特异性靶向及抗肿瘤耐药性。

(3)本发明提供的HA-VES，能够物理包裹疏水性抗肿瘤药物，从而达到治疗耐药性肿瘤的效果，是经科学研究、实验和对实践总结作出的创造性劳动结晶，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。

Claims

1.一种维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法，其特征是，将透明质酸分别通过亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺为连接臂和维生素E琥珀酸酯按重量比1:1~100共价连接，在水介质中形成纳米胶束；所述透明质酸为分子量大于等于600道尔顿且小于等于400 kd的低分子量透明质酸；所述连接臂为碳原子数2~12的亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺；所述二硫代亚烷基二胺中的二硫键在体内具有氧化还原敏感性，能够在肿瘤细胞内部靶向的释放抗肿瘤药物，具体步骤如下：

（1）透明质酸的氨化：将20~200mg透明质酸溶于10~100ml有机溶剂或缓冲液中，以100~500mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、50~300mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温反应10~200min，得反应溶剂；将亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺按与透明质酸 5~10︰1的摩尔比加入上述反应溶剂中，室温反应6-48h，再加入丙酮沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得氨化的透明质酸；

所述的缓冲液为pH7~10的磷酸盐缓冲液；

（2）将50~300mg维生素E琥珀酸酯溶于10~100ml反应溶剂中，以100~500mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、50~300mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，维生素E琥珀酸酯的羧基和上述氨化的透明质酸中的氨基按摩尔比1︰1进行缩合反应6-48h，得反应液，再加入反应液体积2-3倍的丙酮进行沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，一端具有亲水性，另一端具有疏水性，在水介质中形成纳米胶束；

所述反应溶剂为水、或甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）透明质酸的氨化：将80-140mg透明质酸溶于40-70ml有机溶剂或缓冲液中，以200-400mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、100-200mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温反应10~200min，得反应溶剂；将亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺按与透明质酸 6-8︰1的摩尔比加入上述反应溶剂中，室温反应6-48h，再加入丙酮沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得氨化的透明质酸；

（2）将100-200mg维生素E琥珀酸酯溶于40-70ml反应溶剂中，以200-400mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、100-200mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，维生素E琥珀酸酯的羧基和上述氨化的透明质酸中的氨基按摩尔比1︰1进行缩合反应6-48h，得反应液，再加入反应液体积2-3倍的丙酮进行沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，一端具有亲水性，另一端具有疏水性，在水介质中形成纳米胶束。

3.根据权利要求1所述的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）透明质酸的氨化：将110mg透明质酸溶于55ml有机溶剂或缓冲液中，以300mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、175mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温反应10~200min，得反应溶剂；将亚烷基二胺或二硫代亚烷基二胺按与透明质酸7.5︰1的摩尔比加入上述反应溶剂中，室温反应6-48h，再加入丙酮沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得氨化的透明质酸；

（2）将175mg维生素E琥珀酸酯溶于55ml反应溶剂中，以300mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、175mg羟基琥珀酰亚胺为活化剂，维生素E琥珀酸酯的羧基和上述氨化的透明质酸中的氨基按摩尔比1︰1进行缩合反应6-48h，得反应液，再加入反应液体积2-3倍的丙酮进行沉淀，抽滤，得沉淀，加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥，得维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸，一端具有亲水性，另一端具有疏水性，在水介质中形成纳米胶束。

4.根据权利要求1所述的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、取100 mg 透明质酸、498 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、300mg羟基琥珀酰亚胺，溶解在10 ml 甲酰胺中，室温搅拌30 min，将上述反应液缓慢滴入0.5 M乙二胺的甲酰胺溶液中，冰浴条件下滴加1 h，升至室温反应3h，反应结束后，加入丙酮，沉淀，抽滤，加水复溶沉淀，在水中透析2 d，冷冻干燥即得用乙二胺氨化的透明质酸；

（2）、取50 mg维生素E琥珀酸酯溶于30 ml二甲基甲酰胺中，加入60 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、35mg羟基琥珀酰亚胺，室温反应15 min，成反应液，在反应液中加入20mg 乙二胺氨化的透明质酸，室温反应24h，反应结束后，加入丙酮，沉淀，抽滤，加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物——乙二胺作为连接臂的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸。

5.根据权利要求1所述的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、取100mg透明质酸，溶解于25ml 磷酸盐缓冲液中，加入498 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、300mg羟基琥珀酰亚胺搅拌活化15min，加入561mg胱胺，室温搅拌反应4h，反应液用0.1mmol/L的NaCl溶液透析1d后再用纯水透析1d，冷冻干燥即得用胱胺氨化的透明质酸；

（2）、取50 mg 维生素E琥珀酸酯溶于30 ml二甲基甲酰胺中，加入60 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、35mg羟基琥珀酰亚胺，室温反应15 min，成反应液，在反应液中加入20 mg 胱胺氨化的透明质酸，室温反应24h，反应结束后，加入丙酮，沉淀，抽滤，加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物——胱胺作为连接臂的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸。

6.权利要求1或2-5任一项所述方法制备的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的权利要求1或2-5任一项所述方法制备的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗肿瘤药物组合物，该组合物是由维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸和药学活性或药理活性分子按重量比1:1~5制成载药纳米胶束，所述药学活性或药理活性分子为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱或米托蒽醌的抗肿瘤药物。

8.根据权利要求7所述的权利要求1或2-5任一项所述方法制备的维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸在制备抗肿瘤组合药物中的应用，其特征在于，所述的制成载药纳米胶束，是10mg维生素E琥珀酸酯修饰的透明质酸与水按重量比3~50:1000的比例探头超声溶解，与经0.5~5ml溶剂溶解的10~50mg抗肿瘤药物物理混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌24小时后采用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂及游离药物，冻干制得粒径为10~1000 nm的纳米胶束，所述溶剂为水、无水乙醇、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。