CN104945538A - 一种透明质酸维生素e衍生物及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种透明质酸维生素E衍生物，以生物材料透明质酸和维生素E琥珀酸酯为原材料，在水性介质中形成胶束。本发明提供的胶束能在水溶液中自主装形成胶束给药体系，实现非水溶性药物的运载，继而实现药物靶向作用。本发明以天然大分子透明质酸为原料，无毒，保湿，且具有优良的生物相容性和生物降解性。将疏水性的维生素E琥珀酸酯连接到透明质酸主链上，形成一种透明质酸维生素E的衍生物。本发明制备方法设计合理，方法简易，反应易进行，得到胶束形态规整，粒径较小。透明质酸维生素E胶束具有优良的生物相容性，亲水性，生物降解性，较高疏水性药物包裹能力，与CD44受体特异性结合能力，可作为优良的靶向药物传递载体。结构式：

Description

一种透明质酸维生素E衍生物及制备和应用

技术领域

本发明属于高分子聚合物与药物制剂技术领域。涉及一种透明质酸维生素E衍生物及其合成方法和制药用途。

胶束制备和应用，将维生素E琥珀酸酯连接到透明质酸的主链上，形成透明质酸维生素E衍生物，该衍生物在水溶液中能自主装形成胶束给药系统，

 背景技术

胶束是两亲性物质在溶液中的浓度到达某一临界值（即临界胶束浓度CMC）及超过该值后，其分子或离子自动缔合成的胶体大小的聚集体质点微粒，这种胶体质点与离子之间处于平衡状态。胶束作为药物载体具有很多优良的性能,如体内外稳定性高、对难溶性药物的增溶作用等。聚合物胶束是药物载体家族中的新成员,对难溶性药物的增溶和靶向给药具有自身独特的优点。但是，现行胶束给药系统多为非生物活性材料，存在生物相容性以及生物毒性等问题，作为载药系统有诸多限制。

透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸（Hyaluronan），又称糖醛酸、透明质酸，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。透明质酸分子能携带500倍以上的水分，为当今所公认的最佳保湿成分，广泛的应用在保养品跟化妆品中。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合，保水作用等。透明质酸作为一种天然多聚糖，具有较高稳定性、安全、低毒性、亲水性、易于化学修饰和可生物降解等特性，HA受体CD44和HA介导能动性的受体（receptor for hyaluronic acid-mediated motility, RHAMM）在多种正常组织细胞（骨髓充间质干细胞，软骨细胞，破骨细胞等）和肿瘤细胞中表面均有不同程度的表达，可以与HA发生特异性结合，利用这一特性，以透明质酸为基础的给药系统可以实现治疗药物在细胞水平上的特异型靶向作用。透明质酸因富含羟基和羧基，可进一步被修饰，其作为药物的载体材料，有许多关于基于透明质酸共聚物和其作为药物传递系统的文献报道。来自韩国的Jae Hyung Park等在Biomaterials杂志上发表了一种基于透明质酸衍生物胶束给药系统，通过将胆酸通过化学反应连接到透明质酸骨架上，从而形成一种两亲性的透明质酸衍生物，其在水溶液中可以自聚集形成胶束，文章中使用这一载体包裹药物，实现了结肠癌的治疗。此外还有Dae-Duk Kim等人使用其构建的透明质酸衍生物给药系统实现肿瘤靶向治疗的报道。

维生素E（VitaminE）是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视发生和发展。维生素E琥珀酸酯(VitaminEsuccinate,VES)是维生素E的一种衍生物,具有水溶性维生素的特点且稳定性良好,可作为维生素E替代品而广泛用于医药、食品和化妆品等领域。有关研究表明,维生素E琥珀酸酯具有抑制人乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞生长,而对正常细胞生长无细胞毒性及抑制作用的特殊功能。华中科技大学王智等通过研究维生素E琥珀酸酯对体外培养的人晶状体上皮细胞生长的影响,发现维生素E琥珀酸酯可以抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的生长,呈时间、剂量依赖性,提示其在临床上具有潜在的防治后发性白内障的作用；Shuyuan Yeh等在PNAS杂志上发表了维生素E琥珀酸酯通过抑制雄激素受体作用从而抑制前列腺癌的报道。

利用化学反应将亲水性的透明质酸与疏水性的维生素E琥珀酸酯相连接，得到在水性介质中可自主装形成胶束的透明质酸维生素E衍生物，利用该材料优良的生物安全性、载药能力以及对于CD44特异性的结合能力，实现安全有效地靶向药物治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种透明质酸维生素E衍生物（HAVES），具有以下结构式：

其中：X,Y=氧元素O或者氮元素N,R为脂肪链或者带有其他基团的脂肪链或者任何一种能连接透明质酸和维生素E琥珀酸酯的化合物，n+m为2-3500，n/（n+m）为0-0.5。

本发明的另一个目的提供所述的透明质酸维生素E衍生物的合成方法，该衍生物以生物材料透明质酸和维生素E琥珀酸酯为原材料，在水性介质中形成胶束，具有生物安全、生物可降解、能装载疏水性药物、CD44特异性结合的特征。

它的设计思路是：（1）用胱胺（或己二胺）连接一定分子量的透明质酸和维生素E琥珀酸酯，形成两亲性的胶束；（2）该胶束能在水溶液中自主装形成胶束给药体系，以此为载体，实现非水溶性药物的运载，继而实现药物靶向作用。

本发明透明质酸维生素E衍生物（HAVES）合成方法通过以下步骤实现：

 (1)维生素E琥珀酸酯和连接物在催化剂的作用下，在有机溶剂中反应得到反应液；所述催化剂选自1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐, 1- 羟基-苯并-三氮唑、N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或几种，化学反应温度控制为20-60℃。连接物选用己二胺，胱胺，3-氨基丙醇，γ-氨基丁酸，乙二胺，丙二胺，丁二胺，辛二胺，对苯二胺等；有机溶剂选用甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲酰胺中的一种或者多种的混合溶液；

 (2)将一定分子量的透明质酸钠在水和有机溶剂混合溶液中溶解，加入催化剂活化，将步骤（1）中的反应液缓慢滴加到透明质酸钠溶液中，得到反应液；所述催化剂选自1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐, 1- 羟基-苯并-三氮唑、N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或几种，化学反应温度为20-60℃。有机溶剂选用甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲酰胺中的一种或者多种的混合溶液；所用的透明质酸钠相对分子量在1×10³Da～1.3×10⁶Da之间；

 (3)将步骤（2）中的反应液经纯水透析，冷冻干燥得到透明质酸维生素E衍生物；

 (4)将步骤（3）中的产物溶解在水性介质中，搅拌得到自聚集形成的透明质酸维生素E胶束溶液。自聚集形成的胶束粒径在20nm-450nm之间，呈规整的球形，亲水性较好，临界胶束浓度在10-500 μg/ml之间。

本发明的再一个目的是提供所述的透明质酸维生素E胶束在作为药物载体制备靶向药物中的应用。本发明提供的胶束能在水溶液中自主装形成胶束给药体系，以此为载体，实现非水溶性药物的运载，继而实现药物靶向作用。本发明衍生物所形成的胶束，对疏水性药物有较强的载药能力,疏水性药物为喜树碱，紫杉醇，阿霉素，长春碱，雌二醇，雷诺昔芬，己烯雌酚，桌炔诺孕酮，地塞米松，骨化三醇，阿法骨化醇，姜黄素，尼莫地平，辛伐他丁等。所制备的衍生物具有较高的生物安全性，即使 1mg/ml浓度，对人乳腺癌细胞（MCF-7）和人脑胶质瘤细胞（U87-MG）共孵育≤72小时，均未造成细胞超过半数的死亡。

本发明的主要优点在于：

1.本发明以天然大分子透明质酸为原料，为生物材料，无毒，保湿，且具有优良的生物相容性和生物降解性。

2.维生素E（Vitamin E）是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。维生素E琥珀酸酯(Vitamin E succinate, VES)是维生素E的一种衍生物,具有良好的稳定性、生物安全性，并具有一定的药理活性。将疏水性的维生素E琥珀酸酯连接到透明质酸主链上，形成一种透明质酸维生素E的衍生物。

3.在水溶液中疏水的VES可形成疏水区域，自主装形成胶束。胶束制备方法简易，反应易进行，得到胶束形态规整，粒径较小。透明质酸维生素E胶束具有优良的生物相容性，亲水性，生物降解性，较高疏水性药物包裹能力，与CD44受体特异性结合能力，可作为优良的靶向药物传递载体。

附图说明

图1-1是透明质酸钠 (a) 的氢核磁图谱。

图1-2是维生素E琥珀酸脂（b）的氢核磁图谱。

图1-3是己二胺（c）的氢核磁图谱。

图1-4是胱胺（d）的氢核磁图谱。

图1-5是以己二胺（e）为连接物的透明质酸维生素E衍生物（HAVES-1）的氢核磁图谱。

图1-6是以胱胺（f）为连接物的透明质酸维生素E衍生物（HAVES-2））的氢核磁图谱。

图2-1是透明质酸维生素E胶束(HAVES-1)的TEM。

图2-2是透明质酸维生素E胶束(HAVES-2)的TEM。

图3-1是透明质酸维生素E胶束(HAVES-1)的CMC。

图3-2是透明质酸维生素E胶束(HAVES-2)的CMC。

图4-1是透明质酸维生素E衍生物（HAVES-1）的细胞毒性。

图4-2是透明质酸维生素E衍生物（HAVES-2）的细胞毒性。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1：

 (1) 透明质酸维生素E衍生物合成

称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜（DMSO），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g己二胺，用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为6700（n+m=17）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g珀酰亚胺（NHS）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌4h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES-1。

（e）：以己二胺为连接物的透明质酸维生素E衍生物（HAVES-1）结构式：

(2)透明质酸维生素E胶束的制备

称取0.1gHAVES-1，溶于50ml去离子水中，超声溶解10min得到2mg/ml的HAVES-1胶束水溶液。

对上述得到的胶束溶液进行如下理化性质表征：

1.氢核磁图谱

取透明质酸衍生物HAVES-1 10 mg溶于0.5 mL D2O中，使其最终浓度为20 mg/mL，用磁共振仪记录核磁共振氢谱，通过对比透明质酸钠（HA）和维生素E琥珀酸酯（VES）的核磁共振氢谱，对嫁接物HAVES-1进行结构分析。结果见附图1-1至图1-6，HA氢核磁图谱（a）中δ=1.92归属为-NHCOCH3上的H特征峰；维生素E琥珀酸酯（VES）氢核磁图谱（b）中δ=0.98归属为VES长链上的甲基峰；透明质酸衍生物HAVES-1（e），同时出现了上述两种物质的特征峰，说明VES成功嫁接到了透明质酸的骨架上。

2. 透射电镜观察

精密称取HAVES-1衍生物10 mg，分散于去离子水中，用去离子水定容至20 mL，得到浓度为0.5 mg/mL透明质酸衍生物HAVES溶液。取数滴上述溶液滴加在覆盖有碳膜的电镜铜网上，用滤纸吸去多余液体，然后滴加1滴2%磷钨酸染色,待风干后用透射电镜观察聚合物的形态和大小。结果见附图2-1，从图中可以看出，透明质酸衍生物HAVES-1空白胶束的微粒形态均为较规则的球形 ，形态较为均一。

3.临界胶束浓度测定

以芘为荧光探针，采用荧光分光光度法测定透明质酸衍生物HAVES-1在水溶液中的临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）。精密称取芘12 mg， 置于100 mL容量瓶，用丙酮定容，使最终浓度为0.12 mg/mL。用移液管移取1mL上述溶液于100 mL容量瓶，用丙酮定容，使最终浓度为0.0012 mg/mL。精密称定透明质酸衍生物HAVES-130 mg，分散于去离子水中，探头超声30次（400W，工作2 s停3 s）后，用去离子水定容至30 mL，得到浓度为1.0 mg/mL透明质酸衍生物HAVES-1溶液，以此作为母液。再用去离子水稀释该母液，得到不同浓度（终浓度范围从0.003 mg/mL到1.0 mg/mL）的透明质酸衍生物HAVES-1溶液各5 mL。分别精密移取0.5 mL芘的丙酮溶液 (芘浓度为0.0012 mg/mL)，置于10 mL玻璃试管中，50℃下将试管中的丙酮挥发完全后，分别加入5 mL上述系列浓度的透明质酸衍生物HAVES-1溶液，使得芘的终浓度为6.0×10-7 M），室温下水浴超声30 min。用荧光分光光度计扫描芘的激发光谱和发射光谱（激发光波长337 nm，发射波长范围为300-470 nm激发光狭缝与发射光狭缝分别为10 nm和2.5 nm），记录第一个峰值（I1=374 nm）和第三个峰值（I3=385 nm），计算二者的比值（I1/I3），从而得到透明质酸衍生物HAVES-1的临界胶束浓度。结果见附图3-1，透明质酸衍生物HAVES-1的CMC数值分别为0.104 μg/mL，VES作为疏水链段，是构成胶束内核的部分，在水溶液中自发聚集形成胶束，所合成衍生物具有较低的CMC。

4.透明质酸衍生物HAVES包载紫杉醇（PTX）

用透析法制备透明质酸维生素E衍生物HAVES-1载紫杉醇胶束。方法如下：精密称取透明质酸维生素E衍生物HAVES-1 10mg，分散溶解于10mL去离子水中，探头超声30次（400W，工作2s停3s）后，得到1.0mg/mL的透明质酸维生素E衍生物HAVES-1空白胶束溶液。在室温磁力搅拌下，向该溶液中逐渐滴加不同量紫杉醇乙醇溶液(紫杉醇的投药质量分别为5%和10%)，继续搅拌10min后转移至透析袋中，用去离子水透析24小时除去乙醇。将透析后的产物低速离心（4000rpm）10分钟除去尚未增溶的紫杉醇固体，取上清夜。

利用高效液相色谱（HPLC）测定HAVES-1包载紫杉醇中紫杉醇的含量。实验所用色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相为乙腈一水(体积比60：40)；流速为1mL／min；柱温：25℃；检测波长为227nm，进样体积20uL。采用标准曲线测定紫杉醇的含量，标准曲线制备方法如下：取1.0mg/mL的紫杉醇甲醇（PTX/methanol）溶液,用流动相稀释成一系列浓度，通过HPLC检测其色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，紫杉醇浓度为横坐标，绘制得到紫杉醇标准曲线。

采用有机溶剂提取法测定HAVES-1包载紫杉醇的药物包封率及载药量。方法如下：取上述HAVES-1包载紫杉醇清液1.0mL，用甲醇稀释5倍，快速斡旋5min破坏胶束结构后，用HPLC法测定并得出紫杉醇的浓度。HAVES-1包载紫杉醇胶束包封率（EE%）和载药量（DL%）的计算公式分别为如下：

包封率（EE %）=(胶束中的药物量／总投药量)×100％

载药量（DL %）=(胶束中的药物量／载药胶束总量)×100％

结果见表1，透明质酸衍生物HAVES-1对紫杉醇（PTX）的包封率和载药量为60.2%和3.0%（5%的投料），62.9%和6.3%（10%的投料）。

5.细胞毒性实验

采用四唑蓝比色法（MTT Assay）评价透明质酸衍生物HAVES-2的体外细胞毒性。取对数生长期的MCF-7细胞和U87-MG细胞，经胰酶消化后，用含10%新生牛血清的1640培养基调整细胞密度为5×10³个/mL，接种于96孔培养板（NalgeNunc International，Naperville，IL，USA），每孔0.2mL，37℃，5%CO2孵箱中培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度透明质酸衍生物HAVES-1溶液，以未处理的空白细胞为对照，每孔设3个平行组。继续培养72h后，每孔加入20 μL 的MTT溶液 (浓度为5.0 mg/mL)，于孵箱中继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入200 μL DMSO，恒温振荡20分钟，用酶标仪测定570 nm处吸光度，按公式计算细胞存活率：

式中：I%——细胞存活率；Acontrol——空白对照组570nm处的吸光度； Atreat——样品组570nm处的吸光度。

结果见附图4-1，透明质酸衍生物HAVES-1在1mg/ml高浓度下，对人乳腺癌细胞（MCF-7）和人脑胶质瘤细胞（U87-MG）共孵育72小时，均未造成细胞超过90%的死亡，说明其具有优越的生物安全性。

实施例2：

（1）称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜（DMSO），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g胱胺，用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为6700（n+m=17）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g珀酰亚胺（NHS）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌8h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES-2。

（f）：以胱胺为连接物的透明质酸维生素E衍生物（HAVES-2））结构式：

(2)称取0.1gHAVES-2，溶于50ml去离子水中，超声溶解10min得到2mg/ml的HAVES-2胶束水溶液。

（3）HAVES-2的氢核磁图谱、所形成胶束TEM观察、CMC测定、对紫杉醇的包封绿荷载药量以及细胞毒性研究，其结果分别见附图1-6，图中透明质酸衍生物HAVES-2（f），同时出现HA氢核磁图谱（a）中δ=1.92和VES氢核磁图谱（b）中δ=0.98的特征峰，说明VES成功嫁接到了透明质酸的骨架上。图2-2中可以看出，透明质酸衍生物HAVES-1空白胶束的微粒形态均为较规则的球形 ，形态较为均一。图3-2中透明质酸衍生物HAVES-2的CMC数值为0.451 g/mL，在水溶液中自发聚集形成胶束，所合成衍生物具有较低的CMC。表2中透明质酸衍生物HAVES-2对紫杉醇（PTX）的包封率和载药量为90.7%和4.54%（5%），92.9%和9.3%（10%）。

细胞毒性实验结果见附图4-2，透明质酸衍生物HAVES-2即使 在1mg/ml高浓度下，对人乳腺癌细胞（MCF-7）和人脑胶质瘤细胞（U87-MG）共孵育72小时，均未造成细胞超过90%的死亡，说明其具有优越的生物安全性。

实施例3：

（1）称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜（DMSO），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g 3-氨基丙醇，用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为6700（n+m=17）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g 4-二甲氨基吡啶（DMAP）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌8h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES-3。

（f）：以3-氨基丙醇为连接物的透明质酸维生素E衍生物（HAVES-3）结构式：

(2)称取0.1gHAVES-3，溶于50ml去离子水中，超声溶解10min得到2mg/ml的HAVES-3胶束水溶液。

实施例4：

（1）称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），1ml氯化亚砜装入25ml单口烧瓶中，加入10ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2gγ-氨基丁酸，用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为6700（n+m=17）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g 4-二甲氨基吡啶（DMAP）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌8h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES-4。

（f）：以γ-氨基丁酸为连接物的透明质酸维生素E衍生物（HAVES-4）结构：

(2)称取0.1gHAVES-4，溶于50ml去离子水中，超声溶解10min得到2mg/ml的HAVES-4胶束水溶液。

实施例5：

称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜（DMSO），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g已二胺（或胱胺），用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为1000（n+m=2）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g珀酰亚胺（NHS）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌4h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES。

实施例6：

称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜（DMSO），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g已二胺（或胱胺），用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为42000（n+m=105）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g珀酰亚胺（NHS）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌4h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES。

实施例7：

称取0.5g维生素E琥珀酸酯（VES），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜（DMSO），常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g已二胺（或胱胺），用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。

称取0.38g分子量约为1300000（n+m=3200）透明质酸钠（HA-Na），0.45g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），0.1g珀酰亚胺（NHS）装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌4h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES。

实施例8：

精密称取透明质酸维生素E衍生物HAVES-1或者HAVE-2 10mg，分散溶解于10mL去离子水中，探头超声30次（400W，工作2s停3s）后，得到1.0mg/mL的透明质酸维生素E衍生物HAVES-1或HAVES-2空白胶束溶液。在室温磁力搅拌下，向该溶液中逐渐滴加不同量雌二醇乙醇溶液(雌二醇的投药质量分别为5%和10%)，继续搅拌10min后转移至透析袋中，用去离子水透析24小时除去乙醇。将透析后的产物低速离心（4000rpm）10分钟除去尚未增溶的雌二醇固体，取上清液。

实施例9：

精密称取透明质酸维生素E衍生物HAVES-1或者HAVE-2 10mg，分散溶解于10mL去离子水中，探头超声30次（400W，工作2s停3s）后，得到1.0mg/mL的透明质酸维生素E衍生物HAVES-1或HAVES-2空白胶束溶液。在室温磁力搅拌下，向该溶液中逐渐滴加不同量姜黄素乙醇溶液(姜黄素的投药质量分别为5%和10%)，继续搅拌10min后转移至透析袋中，用去离子水透析24小时除去乙醇。将透析后的产物低速离心（4000rpm）10分钟除去尚未增溶的姜黄素固体，取上清液。

实施例10：

精密称取透明质酸维生素E衍生物HAVES-1或者HAVE-2 10mg，分散溶解于10mL去离子水中，探头超声30次（400W，工作2s停3s）后，得到1.0mg/mL的透明质酸维生素E衍生物HAVES-1或HAVES-2空白胶束溶液。在室温磁力搅拌下，向该溶液中逐渐滴加不同量雷诺昔芬甲醇溶液(雷诺昔芬的投药质量分别为5%和10%)，继续搅拌10min后转移至透析袋中，用去离子水透析24小时除去甲醇。将透析后的产物低速离心（4000rpm）10分钟除去尚未增溶的雷诺昔芬固体，取上清液。

上述实例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1. 一种透明质酸维生素E衍生物，其特征在于，其结构式为：

                                                 

其中，X,Y=氧元素O或者氮元素N,R为脂肪链或者带有其他基团的脂肪链或者任何一种能连接透明质酸和维生素E琥珀酸酯的化合物，n+m为2-3500，n/(n+m)为0-0.5。

2.根据权利要求1所述的一种透明质酸维生素E衍生物，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)维生素E琥珀酸酯和连接物在在催化剂的作用下，在有机溶剂中通过化学反应得到反应液；

(2) 将透明质酸钠在水和有机溶剂混合溶液中溶解，加入催化剂活化，将步骤（1）中的反应液缓慢滴加到透明质酸钠溶液中，得到反应液；

(3)将步骤(2)中的反应液经纯水透析、冷冻干燥得到透明质酸维生素E衍生物；

(4)将步骤(3)中的产物溶解在水性介质中，搅拌得到自聚集形成的透明质酸维生素E胶束溶液。

3.根据权利要求2所述的透明质酸维生素E衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中选择的连接物为己二胺，胱胺，3-氨基丙醇，γ-氨基丁酸，乙二胺，丙二胺，丁二胺，辛二胺或对苯二胺。

4.根据权利要求2所述的透明质酸维生素E衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中的催化剂选用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、1- 羟基-苯并-三氮唑、N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的透明质酸维生素E衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中选择的透明质酸钠相对分子量在1×10³Da～1.3×10⁶Da之间。

6.根据权利要求2所述的透明质酸维生素E衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中以水和有机溶剂为混合溶液，有机溶剂选用甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲酰胺中的一种或者多种的混合溶液。

7.根据权利要求2所述的透明质酸维生素E衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中所述化学反应温度为20-60℃。

8.根据权利要求2所述的透明质酸维生素E衍生物的制备方法，其特征在于，步骤（4）中制得的胶束的粒径在20nm-450nm之间，呈规整的球形，亲水性好，临界胶束浓度在10-500 μg/ml之间。

9.根据权利要求2所述方法制备的一种透明质酸维生素E衍生物胶束在作为药物载体制备靶向药物中的应用。