CN109395102B - 一种胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒，所述磁性纳米粒由以下成分及方法制成：CKAAKN‑透明质酸‑维生素E琥珀酸酯聚合物胶束、四氧化三铁磁性纳米粒溶液、去离子水，由CKAAKN多肽修饰的透明质酸‑维生素E琥珀酸酯共聚物经过包裹超小顺磁性Fe3O4磁性纳米粒而成，本发明设计为经CKAAKN多肽靶向修饰的聚合物磁性纳米粒能模拟Wnt蛋白通过Wnt信号通路与胰腺癌细胞膜受体特异性结合，同时肿瘤细胞表面亦可高度表达透明质酸受体——CD44与透明质酸介导自动性受体(RHAMM)，故在胰腺癌早期诊断中能特异性靶向胰腺癌细胞，从而为胰腺癌早期诊断提供一种特异性和显像能力更强的双靶向磁共振造影剂。

Description

一种胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
目前胰腺癌诊断主要通过影像学诊断和血清肿瘤标志物的检测。糖类抗原CA19-9，仍是当前临床中使用最为广泛的胰腺癌诊断及复发监测血清肿瘤标记物，对胰腺癌有较高的诊断价值，但近年来发现其在一些良性胰腺疾病中也有较高表达，因此缺乏足够的特异性。胰腺癌常用的影像学检测手段包括体表超声、磁共振成像(MRI)、计算机断层成像(CT) 和正电子发射计算机断层扫描(PET)等，但这些影像学诊断技术对直径小于2cm的胰腺肿瘤常常束手无策，无法进行精准的诊断。因此，为了提高早期胰腺癌的诊断率和诊断水平，开发一种特异性强和安全性更高的新型胰腺癌靶向分子探针意义重大。
本研发团队经过对胰腺癌特性长期研究，对胰腺癌诊断技术做出了一定的贡献，如发明人汪祖华曾经参与研发的技术申请的中国发明专利，申请号：201510141402.8，发明名称:靶向聚合物胶束磁性纳米粒及制备和应用，公开了磁性纳米粒由94％F-68溶液、4％CKAAKN多肽-聚乙二醇- 聚乳酸-羟基乙酸嫁接物、1％四氧化三铁纳米溶液及1％油酸乙醇组成。制备方法为：
(1)CKAAKN-PEG-PLGA的合成取市售聚乳酸-羟基乙酸溶于二甲基亚枫溶液中，分别加入N,N'-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，在氩气保护下室温磁力搅拌反应24h后，慢慢滴加含聚乙二醇的二甲基亚枫溶液，继续反应6h后，经透析、离心、冷冻干燥后用丙酮溶解，再用去离子水复溶，经冷冻干燥后得到PEG-PLGA共聚物，取PEG-PLGA共聚物、CKAAKN多肽和N,N'-二环己基碳二亚胺溶解在二甲基亚枫溶液中，室温下磁力搅拌反应8h后，用去离子水混合，并透析、离心、干燥，即得到CKAAKN-PEG-PLGA嫁接物，其结构通过氢谱核磁共振进行确证；(2) 胰腺癌特异靶向聚合物胶束磁性纳米粒的制备秤取CKAAKN-PEG-PLGA嫁接物溶于去离子水中，在超声搅拌条件下，加入油溶性的Fe3O4为核心的磁性纳米粒溶液，超声搅拌10min后，在60℃水浴条件下旋蒸，得聚合物胶束磁性纳米粒：CKAAKN-PEG-PLGA-USPIO。
以上技术也是汪祖华研发团队经过大量的实验而得，也取得了较好的成果，但研发人员经过进一步研究后，发现其使用的聚合物材料,其生物可降解性、安全性、肿瘤特异性和显像能力均需进一步提高。
现有技术中中国专利申请，申请号：201510356845.9，发明名称：一种透明质酸维生素E衍生物及制备和应用，其制备方法为：
(1)透明质酸维生素E衍生物合成
称取0.5g维生素E琥珀酸酯(VES)，0.45g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS) 装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜(DMSO)，常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g己二胺，用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。
称取0.38g分子量约为6700(n+m＝17)透明质酸钠(HA-Na)，0.45g1- 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.1g珀酰亚胺 (NHS)装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液A，常温下搅拌4h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES-1。
(2)透明质酸维生素E胶束的制备
称取0.1gHAVES-1，溶于50ml去离子水中，超声溶解10min得到 2mg/ml的HAVES-1胶束水溶液。
本研发团队发现201510356845.9反应条件较为苛刻且操作更为复杂，不适合下一步的量化生产，且该专利中并未将其用作磁共振成像也未对其进行胰腺癌靶向多肽修饰，若作为磁共振造影剂的递送载体或存在以下缺陷:1、注射量较大，对人体的毒副作用相对较大；2、胰腺癌的肿瘤选择性较差；3、磁共振显像能力较弱。
基于以上发明的缺陷，本发明人在原技术基础上进行了深入的研究，研发了一种生物安全性和生物降解性更好的双靶向聚合物载体用于磁共振造影剂的传递、使其在胰腺癌早期诊断中能更有效地特异性靶向胰腺癌细胞，并能产量化生产，作为胰腺癌早期诊断提供一种特异性和显像能力更强的靶向磁共振造影剂。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的以下缺陷：
1、现有技术中所使用的材料生物降解性能和生物安全性需进一步提高；
2、现有技术中的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束未经过多肽的修饰，用于磁共振成像有以下缺陷：1)对比剂的注射量较大，对人体有潜在毒副作用；2)对胰腺癌的肿瘤选择性较差；3)特异性和显像能力较弱。
本发明另一个目的是提供一种能解决上述缺陷的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒。
本发明的另一个目的是提供一种能解决上述缺陷的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备方法。
本发明的另一个目的是提供双靶向聚合物磁性纳米粒在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒由以下成分组成： CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束、四氧化三铁磁性纳米粒溶液、去离子水。
优选的，本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒由以下成分组成：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束40-60mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液50-150μL、去离子水16-24ml。
进一步优选的，本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒由以下成分组成：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束50mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液100μL、去离子水20ml。
本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒由以下方法制成：以透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束作为载体，并在其表面修饰 CKAAKN胰腺癌靶向配体，在聚合物胶束的疏水内核包载油溶性的四氧化三铁纳米微粒。
本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒具体由以下步骤制成：称取CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于去离子水中，在超声搅拌下加入油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15- 25min后，在45-65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒： CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
本发明所述的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束由以下成分及方法合成：
成分：CKAAKN 15-25mg、透明质酸钠0.5-1.5g、维生素E琥珀酸酯 0.40-1.10g；
合成方法：
1)称取0.40-1.10g维生素E琥珀酸酯,用2-5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入1-4g碳二亚胺和0.5-2g N-羟基琥珀酰亚胺，在50-70℃磁力搅拌下反应0.5-2h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.08-3.01g用1-3ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中,继续磁力搅拌反应4-8h，得反应液A；
2)称取0.5-1.5g透明质酸钠用3-7ml二甲基亚砜溶液和3-7ml去离子水溶解，再加入1.20-5.45g碳二亚胺和0.75-3.29gN-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6-10h后用去离子水透析，在-85℃至-42℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称0.4g-0.6g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用8-12mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与15-25mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证。
优选的，本发明所述的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束由以下方法合成：
成分：CKAAKN 18-22mg、透明质酸钠0.8-1.2g、维生素E琥珀酸酯 0.50-0.75g；
合成方法：
1)称取0.50-0.75g维生素E琥珀酸酯,用2.5-4.5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2-3g碳二亚胺和1.0-1.6g N-羟基琥珀酰亚胺，在55-65℃磁力搅拌下反应1.0-1.5h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.15-2.90g用1.2-2.83ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应5-7h，得反应液A；
2)称取0.8-1.2g透明质酸钠，用4-6ml二甲基亚砜溶液和3-7ml 去离子水溶解，再加入1.320-5.00g碳二亚胺和0.91-3.12g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应7-9h后用去离子水透析，在-70℃至-50℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.45g-0.55g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用9-11mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与18-22mg 胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的 CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
进一步优选的，所述的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束由以下成分及方法合成：
成分：CKAAKN 20mg、透明质酸钠1.0g、维生素E琥珀酸酯0.68g
制备方法：
1)称取0.68g维生素E琥珀酸酯(VES,Mw:530.78),用3ml二甲基亚砜(DMSO)溶液在超声下溶解均匀，然后加入2.47g碳二亚胺(EDC, Mw:191.7)和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,Mw:115.09)，在60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺(Mw:152.27)1.99g用1.5ml二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A；
2)称取1.0g透明质酸钠(HA，Mw≈48000)，用5ml二甲基亚砜溶液和5ml去离子水溶解，再加入1.44g碳二亚胺和0.85g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，在-55℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.5g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用10ml去离子水溶解，在碳二亚胺存在下进一步与20mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN(Mw:633.77)发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的 CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束。
本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备方法为：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.40-1.10g维生素E琥珀酸酯,用2-5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入1-4g碳二亚胺和0.5-2gN-羟基琥珀酰亚胺，在50-70℃磁力搅拌下反应0.5-2h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.08-3.01g用1-3ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应4-8h，得反应液A；
2)称取0.5-1.5g透明质酸钠，用3-7ml二甲基亚砜溶液和3-7ml 去离子水溶解，再加入1.20-5.45g碳二亚胺和0.75-3.29g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6-10h后用去离子水透析，在-85℃至-42℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.4g-0.6g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用8-12mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与15-25mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的 CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取40-60mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于16-24ml去离子水中，在超声搅拌下加入50-150μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15-25min后，在45-65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
优选的，本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备方法为：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.50-0.75g维生素E琥珀酸酯,用2.5-4.5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2-3g碳二亚胺和1.0-1.6g N-羟基琥珀酰亚胺，在55-65℃磁力搅拌下反应1.0-1.5h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.15-2.90g用1.2-2.83ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应5-7h，得反应液A；
2)称取0.8-1.2g透明质酸钠，用4-6ml二甲基亚砜溶液和3-7ml 去离子水溶解，再加入1.320-5.00g碳二亚胺和0.91-3.12g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应7-9h后用去离子水透析，在-70℃至-50℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.45g-0.55g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用9-11mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与18-22mg 胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的 CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取45-55mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于18-22ml去离子水中，在超声搅拌下加入80-120μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌18-22min后，在48-62℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
进一步优选的，本发明所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备方法为：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.68g维生素E琥珀酸酯,用3ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2.47g碳二亚胺和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺，在60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.99g用1.5ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A；
2)称取1.0g透明质酸钠，用5ml二甲基亚砜溶液和5ml去离子水溶解，再加入1.44g碳二亚胺和0.85g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，在-55℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)用0.5g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束用 10ml去离子水溶解，在碳二亚胺存在下进一步与20mg胰腺癌靶向多肽 CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸- 维生素E琥珀酸酯聚合物胶束。
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取50mgCKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于20ml 去离子水中，在超声搅拌下加入100μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌20min后，在55-60℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
本发明所述的靶向聚合物磁性纳米粒在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
所述维生素E琥珀酸酯可简写为：VES,其Mw:530.78。
所述二甲基亚砜可简写为；DMSO。
所述碳二亚胺可简写为：EDC,其Mw:191.7。
所述N-羟基琥珀酰亚胺可简写为：NHS,其Mw:115.09。
胱胺其Mw:152.27。
所述透明质酸钠可简写为：HA，其Mw≈48000。
CKAAKN其Mw:633.77。
所述的四氧化三铁磁性纳米粒溶液在试剂公司购买，溶剂是甲苯，为油溶性的，浓度为5mg/mL，磁性纳米粒溶液中的四氧化三铁粒径为5nm。
本发明具有以下有益效果：
1、将经CKAAKN多肽修饰后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束作为磁共振对比剂载体，构建USPIO装载的聚合物胰腺癌靶向对比剂，进一步提高对比剂的肿瘤靶向性；降低对比剂的注射剂量，减少对比剂对人体的毒副作用。
2、本发明人在现有技术基础上进行了深入的研究，将透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束进行CKAAKN多肽修饰，并采取将透明质酸、维生素E琥珀酸酯两种物质分开进行反应，与申请号201510141402.8的技术相比，无需在氩气保护下室温磁力搅拌反应，反应条件和操作更为简单，适合量化生产。
3、本发明所制备得到的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒具有肿瘤双靶向、生物安全性和降解性更好的特点，在胰腺癌早期诊断中能特异性靶向胰腺癌细胞，可为胰腺癌早期诊断提供一种特异性和显像能力更强的靶向磁共振造影剂-胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒。
4、本发明在前期的研究工作基础上，采用溶剂扩散法制备对胰腺癌具有特异性靶向功能的聚合物磁性纳米粒，该材料的出现，以及经过进一步的应用研究，将加快推进胰腺癌的靶向磁共振对比剂发展。
5、本发明所提供的聚合物磁性纳米粒可制备成对胰腺癌具有特异性靶向功能的新型磁共振对比剂，可用于生物医学领域，有望实现更安全、快速的胰腺癌靶向分子影像成像；提高我国磁共振对比剂研发的自主创新能力；为开拓我国磁共振新型对比剂的研发，提供理论与技术基础。
6、本发明所提供的聚合物磁性纳米粒使用了一种广泛存在于人体内的源性材料透明质酸，由于人体内存在可降解透明质酸的透明质酸酶，故以透明质酸作为磁性纳米粒传递的载体，故生物降解性能更好且更安全。
附图说明：
图1：胰腺癌靶向聚合物CKAAKN-HA-VES的1HNMR谱图
图2：CKAAKN-HA-VES、磁性纳米粒和CKAAKN-HA-VES@USPIO磁性纳米粒的透射电子显微镜图
图3：HA-VES和CKAAKN-HA-VES聚合物的临界胶束浓度
图4：CKAAKN-HA-VES靶向聚合物的细胞毒性分析
图5：CKAAKN-HA-VES@USPIO靶向聚合物磁性纳米粒的细胞毒性分析
图6：靶向聚合物磁性纳米粒在HPDE6-C7和BxPC-3细胞中的竞争性摄取共聚焦显微镜图
图7：CKAAKN-HA-VES@USPIO在HPDE6-C7和BxPC-3细胞中的竞争性摄取荧光半定量分析
图8：CKAAKN-HA-VES@USPIO在HPDE6-C7和BxPC-3细胞中的体外磁共振成像
图9：CKAAKN-HA-VES@USPIO在HPDE6-C7和BxPC-3细胞中的体外磁共振信号强度半定量分析
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束、四氧化三铁磁性纳米粒溶液、去离子水。
制备方法：
称取CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于去离子水中，在超声搅拌下加入油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15-25min后，在45-65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒： CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
实施例2
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束40mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液50μL、去离子水16ml。
制备方法：
称取CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于去离子水中，在超声搅拌下加入油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15min后，在45℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒： CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
实施例3
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束60mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液150μL、去离子水24ml。
制备方法：
称取CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于去离子水中，在超声搅拌下加入油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌25min后，在65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒： CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
实施例4
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束50mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液100μL、去离子水20ml。
制备方法：
称取CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于去离子水中，在超声搅拌下加入油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌20min后，在55℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒： CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
实施例5
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束
成分：CKAAKN 15mg、透明质酸纳0.5g、维生素E琥珀酸酯0.4g
合成方法：
1)称取0.40g维生素E琥珀酸酯,用2ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入1g碳二亚胺和0.5g N-羟基琥珀酰亚胺，在50℃磁力搅拌下反应0.5h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.08g用1ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中,继续磁力搅拌反应4-8h，得反应液A；
2)称取0.5g透明质酸钠用3ml二甲基亚砜溶液和3ml去离子水溶解，再加入1.20g碳二亚胺和0.75g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6h后用去离子水透析，在-85℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称0.4g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用 8mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与15mg胰腺癌靶向多肽 CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸- 维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证。
实施例6
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束
成分：CKAAKN 25mg、透明质酸纳1.5g、维生素E琥珀酸酯1.10g
合成方法：
1)称取1.10g维生素E琥珀酸酯,用5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入4g碳二亚胺和2g N-羟基琥珀酰亚胺，在70℃磁力搅拌下反应2h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺 3.01g用3ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中,继续磁力搅拌反应 8h，得反应液A；
2)称取1.5g透明质酸钠用7ml二甲基亚砜溶液和7ml去离子水溶解，再加入5.45g碳二亚胺和3.29gN-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应10h后用去离子水透析，在-42℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称0.6g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用 12mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与25mg胰腺癌靶向多肽 CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸- 维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证。
实施例7
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束
成分：CKAAKN 18mg、透明质酸纳0.8g、维生素E琥珀酸酯0.5g
合成方法：
1)称取0.50g维生素E琥珀酸酯,用2.5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2g碳二亚胺和1.0g N-羟基琥珀酰亚胺，在55℃磁力搅拌下反应1.0h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.15g用1.2ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应5h，得反应液A；
2)称取0.8g透明质酸钠，用4ml二甲基亚砜溶液和3ml去离子水溶解，再加入1.320g碳二亚胺和0.91g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应7h后用去离子水透析，在-70℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.45g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用9mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与18mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸 -维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
实施例8
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束
成分：CKAAKN 22mg、透明质酸纳1.2g、维生素E琥珀酸酯0.75g
合成方法：
1)称取0.75g维生素E琥珀酸酯,用4.5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入3g碳二亚胺和1.6g N-羟基琥珀酰亚胺，在55-65℃磁力搅拌下反应1.5h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺2.90g用2.83ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应7h，得反应液A；
2)称取1.2g透明质酸钠，用6ml二甲基亚砜溶液和7ml去离子水溶解，再加入5.00g碳二亚胺和3.12g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应9h后用去离子水透析，在-50℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.55g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用11mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与22mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
实施例9
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束
成分：CKAAKN 20mg、透明质酸纳1.0g、维生素E琥珀酸酯0.68g
合成方法：
1)称取0.68g维生素E琥珀酸酯,用3ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2.47g碳二亚胺和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺，在60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.99g用1.5ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A；
2)称取1.0g透明质酸钠，用5ml二甲基亚砜溶液和5ml去离子水溶解，再加入1.44g碳二亚胺和0.85g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，在-55℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.5g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用10ml去离子水溶解，在碳二亚胺存在下进一步与20mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸 -维生素E琥珀酸酯聚合物胶束。
实施例10
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束40mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液50μL、去离子水16ml。
制备方法：
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.40g维生素E琥珀酸酯,用2ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入1g碳二亚胺和0.5gN-羟基琥珀酰亚胺，在50℃磁力搅拌下反应0.5h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.08g用1ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应4h，得反应液A；
2)称取0.5g透明质酸钠，用3ml二甲基亚砜溶液和3ml去离子水溶解，再加入1.20g碳二亚胺和0.75g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6-10h后用去离子水透析，在-85℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.4g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用8mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与15mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸 -维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取40mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于 16ml去离子水中，在超声搅拌下加入50μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15min后，在45℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
应用：在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
实施例11
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束60mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液150μL、去离子水24ml。
制备方法：
CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取1.10g维生素E琥珀酸酯,用5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入4g碳二亚胺和2gN-羟基琥珀酰亚胺，在70℃磁力搅拌下反应2h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺 3.01g用3ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应 8h，得反应液A；
2)称取1.5g透明质酸钠，用7ml二甲基亚砜溶液和7ml去离子水溶解，再加入5.45g碳二亚胺和3.29g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6-10h后用去离子水透析，在-42℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.6g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用12mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与25mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取60mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于 24ml去离子水中，在超声搅拌下加入150μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌25min后，在65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
应用：在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
实施例12
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束45mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液80μL、去离子水18ml。
制备方法：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.50g维生素E琥珀酸酯,用2.5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2g碳二亚胺和1.0g N-羟基琥珀酰亚胺，在55℃磁力搅拌下反应1.0h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.15g用1.2ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应5h，得反应液A；
2)称取0.8g透明质酸钠，用4ml二甲基亚砜溶液和3ml去离子水溶解，再加入1.320g碳二亚胺和0.91g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应7h后用去离子水透析，在-70℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.45g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用9mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与18mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸 -维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取45mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于 18ml去离子水中，在超声搅拌下加入80μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌18min后，在48℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
应用：在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
实施例13
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束55mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液120μL、去离子水22ml。
制备方法：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.75g维生素E琥珀酸酯,用4.5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入3g碳二亚胺和1.6g N-羟基琥珀酰亚胺，在65℃磁力搅拌下反应1.5h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺2.90g用2.83ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应7h，得反应液A；
2)称取1.2g透明质酸钠，用6ml二甲基亚砜溶液和7ml去离子水溶解，再加入5.00g碳二亚胺和3.12g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应9h后用去离子水透析，在-50℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.55g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用11mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与22mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取55mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于 22ml去离子水中，在超声搅拌下加入120μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌22min后，在62℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
应用：在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
实施例14
胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒
成分：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束50mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液100μL、去离子水20ml。
制备方法：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.68g维生素E琥珀酸酯,用3ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2.47g碳二亚胺和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺，在60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.99g用1.5ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A；
2)称取1.0g透明质酸钠，用5ml二甲基亚砜溶液和5ml去离子水溶解，再加入1.44g碳二亚胺和0.85g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，在-55℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)用0.5g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束用 10ml去离子水溶解，在碳二亚胺存在下进一步与20mg胰腺癌靶向多肽 CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸- 维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取50mgCKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于20ml 去离子水中，在超声搅拌下加入100μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌20min后，在55-60℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
应用：在胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
为了进一步阐述本发明的内容，发明人做了大量的试验，具体如下：
一、本发明成分说明：
聚合物胶束是一种由两亲性聚合物自发形成的热力学稳定体系，它同时具有亲水性和疏水性基团，可在水中自组装形成纳米级的聚合物胶束，因此对难溶性药物普遍具有良好的增溶效果，同时又能降低药物的毒副作用，提高其生物利用度。由于其狭小的尺寸使其可以通过实体瘤组织自身特有的EPR效应(Enhanced Permeability and Retentioneffect)，即高通透性和滞留性效应，使其被动靶向到肿瘤部位，既显著提高了磁共振对比剂在肿瘤部位的浓度及诊断效率，又大大降低了对正常细胞的毒副作用。
透明质酸是一种在体内广泛存在的糖胺多糖，也是人和动物皮肤、玻璃体、软骨组织和关节滑液的重要组成成分，由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成。透明质酸分子能携带500倍以上的水分，因此被誉为天然的保湿因子，具有非常良好的生物相容性和生物可降解性，降解产物为内源性等特点。透明质酸具有较高稳定性和安全性，由于分子中富含羟基和羧基等可修饰基团，可进行多种化学反应和功能性修饰，常被作为载体材料用于药物或生物造影剂的递送。此外，其重要的生物学功能还表现在，透明质酸能直接与肿瘤细胞表面的CD44受体(在大多数肿瘤中均有高表达)特异性结合，因此以透明质酸为基础的给药系统可以实现治疗药物或磁共振对比剂在细胞水平上的特异性靶向作用。
CKAAKN多肽是一种通过噬菌体展示技术筛选出的对胰腺癌细胞及其肿瘤新生血管具有极高亲和力和特异性靶向功能的氨基酸多肽。CKAAKN 多肽能模拟Wnt蛋白通过Wnt信号通路与胰腺癌细胞膜受体特异性结合，具有非常好的生物活性和肿瘤选择性。因此，以CKAAKN多肽作为靶向探针，用于具有胰腺癌磁共振对比剂的靶向传递，对于改善磁共振成像对比剂对肿瘤细胞的选择性，降低对比剂的不良反应有着重要的意义。
二、本发明试验例：
1、胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒来源说明：
(一)本发明人经过对胰腺癌特性长期研究，对胰腺癌诊断技术做出了一定的贡献，如：申请号：201510141402.8，发明名称:靶向聚合物胶束磁性纳米粒及制备和应用，公开了磁性纳米粒由94％F-68溶液、 4％CKAAKN多肽-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嫁接物、1％四氧化三铁纳米溶液及1％油酸乙醇组成。此技术也是本研发团队之一汪祖华参与研制的，但此研发团队经过进一步研究后，发现其使用的聚合物材料并非是最佳的，其生物降解性能、安全性、肿瘤特异性和显像能力均需有待进一步提高。另外CKAAKN-PEG-PLGA的合成方法是将聚乳酸-羟基乙酸两种物质同时进行反应，并需要在氩气保护下室温磁力搅拌反应24h后再进行下一步操作，反应条件较为苛刻且操作更为复杂，不适合下一步的量化生产。
(二)发明人经过对现有技术进行分析，发现申请号：201510356845.9，发明名称：一种透明质酸维生素E衍生物及制备和应用，发明未经过多肽的修饰，有以下缺陷:1)聚合物胰腺癌靶向对比剂的注射量较大，对人体的毒副作用相对较大；2)聚合物胰腺癌靶向对比剂的肿瘤靶向性较弱；3)做为靶向磁共振造影剂特异性和显像能力较弱。
基于以上发明的缺陷，本发明人在现有技术基础上进行了深入的研究，将透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束进行CKAAKN多肽修饰，并采取将透明质酸、维生素E琥珀酸酯两种物质分开进行反应，与申请号201510141402.8的技术相比，无需在氩气保护下室温磁力搅拌反应，反应条件和操作更为简单，适合量化生产。本发明所制备得到的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒具有肿瘤双靶向、生物安全性和降解性更好的特点，在胰腺癌早期诊断中能特异性靶向胰腺癌细胞，可为胰腺癌早期诊断提供一种特异性和显像能力更强的靶向磁共振造影剂-胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒。
2、CKAAKN-HA-VES合成使用物质的用量筛选试验
本研发团队为了研发胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒，首先对 CKAAKN-HA-VES的合成使用物质的用量做了筛选试验，由于制备过程一样，所以对维生素E琥珀酸酯(VES,Mw:530.78)的用量重点摘录0.50g、 0.68g和0.75g三个用量的试验情况，具体如下：
(一)CKAAKN-HA-VES的合成试验
称取0.5g、0.68g和0.75g的维生素E琥珀酸酯(VES,Mw:530.78), 分别用适量二甲基亚砜(DMSO)溶液在超声下溶解均匀，然后各加入 2.47g碳二亚胺(EDC,Mw:191.7)和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS, Mw:115.09)，在60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺(Mw:152.27)1.99g(3份)用适量DMSO溶液溶解分别加入到上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A。称取1.0g透明质酸钠(HA，3份，Mw≈48000)用适量的DMSO溶液和去离子水溶解，再分别加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸上的羧基，后在同温度下缓慢滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，冷冻干燥，得到不同维生素E琥珀酸酯反应质量比(50％、68％和75％)的HA-VES聚合物。各称取0.5g纯化后的维生素E琥珀酸酯/透明质酸质量比为50％、68％和75％的HA-VES聚合物用适量去离子水溶解，在碳二亚胺存在下加入20mg靶向多肽CKAAKN(Mw:633.77)，常温下磁力搅拌反应10h后用去离子水透析，冷冻干燥，得到不同维生素E琥珀酸酯反应质量比的CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-HA-VES聚合物。
(二)测试
1)氢核磁图谱
取靶向聚合物CKAAKN-HA-VES 5mg溶于0.5mL D2O中，使其最终浓度为 10mg/mL，用磁共振仪记录核磁共振氢谱，通过对比透明质酸(HA)和维生素E琥珀酸酯(VES)的核磁共振氢谱，对靶向聚合物CKAAKN-HA-VES进行结构分析。
参见图1，结果显示，HA氢核磁图谱中δ＝4.69-4.61处的双峰信号归属为类呋喃氢-CH-质子峰；维生素E琥珀酸酯(VES)氢核磁图谱中δ＝1.20-1.28处的特质峰归属为VES维生素E分子中的-CH2-质子峰信号； CKAAKN氢核磁图谱中δ＝3.0-3.06处的特征峰归属于CKAAKN多肽中半胱氨酸中的-CH2-质子峰信号。在靶向聚合物CKAAKN-HA-VES的氢核磁图谱中，同时出现了上述三种物质的特征峰，说明靶向聚合物CKAAKN-HA-VES已被成功合成。
2)临界胶束浓度测定
以芘为荧光探针，采用荧光分光光度法测定不同维生素E琥珀酸酯/透明质酸反应质量比为50％、68％和75％的HA-VES和CKAAKN多肽修饰的靶向聚合物CKAAKN-HA-VES在水溶液中的临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)。精密称取芘12mg，置于100mL容量瓶，用丙酮定容，使最终浓度为0.12mg/mL。用移液管移取1mL芘的丙酮溶液(0.12mg/mL)于100mL容量瓶，用丙酮定容至终浓度为0.0012mg/mL。精密称定CKAAKN-HA-VES20mg，于去离子水中超声分散，再用去离子水定容至 20mL，得到浓度为1.0mg/mLCKAAKN-HA-VES聚合物溶液。以此作为母液，用去离子水进行梯度稀释，得到不同浓度(终浓度范围从0.002mg/mL到 1.0mg/mL)的HA-VES和CKAAKN-HA-VES溶液各5mL。分别精密移取0.5mL 芘的丙酮溶液(0.0012mg/mL)，置于10mL玻璃试管中于50℃下将丙酮挥发完全，后分别加入5mL上述系列浓度的HA-VES和CKAAKN-HA-VES聚合物溶液，使得芘的终浓度为6.0×10-7M)，室温下水浴超声30min。用荧光分光光度计扫描芘的激发光谱和发射光谱(激发光波长337nm，发射波长范围为300-470nm激发光狭缝与发射光狭缝分别为10nm和2.5nm)，记录第一个峰值(I1＝374nm)和第三个峰值(I3＝385nm)，计算二者的比值(I1/I3)，从而得到HA-VES和CKAAKN-HA-VES聚合物的临界胶束浓度。
经测定，不同维生素E琥珀酸酯反应质量比为50％、68％和75％的HA-VES 和CKAAKN-HA-VES靶向聚合物的临界胶束浓度(CMC)见表1和图3。结果发现，在水性环境中，维生素E琥珀酸酯反应质量比为68％的HA-VES和 CKAAKN-HA-VES聚合物具有较低的临界胶束浓度和更好的自组装形成聚合物胶束的能力；50％与75％的自组装形成聚合物胶束的能力次之。
表1：不同维生素E琥珀酸酯/透明质酸质量比为50％、68％和75％的HA- VES和CKAAKN-HA-VES靶向聚合物的临界胶束浓度(CMC)
Figure BDA0001861001770000171
Figure BDA0001861001770000181
3)透射电镜观察
精密称取CKAAKN-HA-VES聚合物5mg，分散于去离子水中并定容至 10mL，得到浓度为0.5mg/mLCKAAKN-HA-VES聚合物溶液。用移液枪移取上述溶液滴加到覆盖有碳膜的电镜铜网上，停留约30s后用滤纸吸去多余液体，然后滴加1滴2％磷钨酸进行染色,风干后置于透射电镜下观察靶向聚合物的形态和大小。
参见图2-a，结果显示，靶向聚合物空白胶束CKAAKN-HA-VES的形态较规则，外观呈球形或椭圆形。
(三)靶向聚合物磁性纳米粒的制备及理化性质测定
以溶剂扩散法制备维生素E琥珀酸酯反应质量比为68％和不同Fe3O4装载的靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-HA-VES@USPIO。具体方法为：称取50mg CKAAKN-HA-VES聚合物溶于适量去离子水中，在超声搅拌下加入50、80、 100、120和150μL油溶性的Fe3O4(5nm,5mg/mL)磁性纳米粒溶液，超声下搅拌20min后，在55～60℃水浴下旋蒸，得到维生素E琥珀酸酯反应质量比为68％和不同Fe3O4装载的靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-HA- VES@USPIO。
取聚合物纳米粒溶液适量，用一定量的去离子水进行稀释，用3000 HS粒度与表面电位分析仪分别测定纳米粒的粒径和聚合指数。
经测定，不同Fe3O4装载的靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-HA- VES@USPIO的粒径和聚合指数见表2。结果发现，在CKAAKN-HA-VES聚合物一定的情况下，当Fe3O4装载在100μL以下时，最终的靶向聚合物磁性纳米粒均保持较好的分散性，而超过100μL时，其纳米粒的聚合指数和粒径均有所增加。
表2：CKAAKN-HA-VES@USPIO靶向聚合物纳米粒的聚合指数和粒径分布
Figure BDA0001861001770000182
将一定浓度的聚合物磁性纳米粒(Fe3O4装载为100μL)样品滴于覆盖有碳膜的铜网(300目)上，用滤纸吸去多余液体后，滴加1滴2％磷钨酸进行染色,干燥后透射电镜观察其形态及粒径大小。
参见图2，结果显示聚合物磁性纳米粒具有较好的粒径分布，外观呈球形或椭圆形，大小均乎均匀一致，其内部可见包裹的黑色Fe3O4纳米颗粒。
(四)细胞毒性实验
采用四唑蓝比色法(MTT Assay)对CKAAKN-HA-VES聚合物和CKAAKN- HA-VES@USPIO聚合物磁性纳米粒的体外细胞毒性进行评价。取对数生长期的人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和人胰腺癌细胞BxPC-3，胰酶消化后用含10％新生牛血清的1640培养基进行稀释使细胞密度为2.5×104个 /mL，接种于96孔培养板(NalgeNunc International，Naperville，IL，USA)中，每孔200μL，于37℃，5％CO2孵箱中培养24h至细胞贴壁，加入不同浓度的CKAAKN-HA-VES和USPIO@CKAAKN-HA-VES溶液，以未处理的细胞作为空白对照，每个浓度设3个平行组。继续培养72h后，每孔加入 20μL的MTT溶液(浓度为5.0mg/mL)，于孵箱中继续培养4h，弃去上清液，每孔加入200μL DMSO，恒温下振荡20分钟，在570nm处用酶联检测仪测定其吸光度，按如下公式计算细胞存活率：
Figure BDA0001861001770000191
式中：I％为细胞存活率；Acontrol为空白对照组在570nm处的吸光度； Atreat为样品组在570nm处的吸光度。
参见图4和图5，结果显示，CKAAKN-HA-VES聚合物和USPIO@CKAAKN- HA-VES聚合物磁性纳米粒在1mg/ml高浓度下，与HPDE6-C7细胞和BxPC-3 细胞共孵育72h，细胞存活率仍然保持在80％以上。
(五)细胞竞争性摄取研究
取适量10mg香豆素6(Coumarin 6，Mw＝350.43)溶于氯仿中，超声溶解配制成浓度为10mg/mL的香豆素6氯仿溶液备用。分别称取50mg HA-VES和CKAAKN-HA-VES聚合物溶于适量去离子水中，在超声搅拌下分别加入100μL油溶性的Fe3O4(5nm,5mg/mL)磁性纳米粒溶液和50μL香豆素6氯仿溶液(10mg/mL)，超声下搅拌20min后，在55～60℃水浴下旋蒸，得到香豆素6标记的HA-VES@USPIO和CKAAKN-HA-VES@USPIO聚合物磁性纳米粒。
以人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和人胰腺癌细胞BxPC-3为模型细胞，于37℃，5％CO2孵箱中进行培养，待细胞长至对数生长期时，用胰酶消化收集两种细胞，其中将BxPC-3细胞用细胞膜染料 PKH67(绿)进行染色(HPDE6-C7细胞不染色)，分别对两种细胞进行细胞计数，然后每孔各加入0.5×104个HPDE6-C7细胞和0.5×104个BxPC-3细胞，用移液枪吹打使两种细胞分散均匀于同一孔中，置于孵箱中共孵育培养。待两种细胞均贴壁生长后，依次加入HA-VES@USPIO和CKAAKN-HA-VES@USPIO聚合物磁性纳米粒，一起共孵育1h后，置于激光共聚焦显微镜下观察。
参见图6和图7，结果显示，经靶向多肽CKAAKN修饰的聚合物磁性纳米粒对胰腺癌细胞BxPC-3具有更高的特异性，能够显著增强磁共振对比剂 USPIO在靶细胞中的摄取。
(六)靶向聚合物磁性纳米粒的体外磁共振成像
将靶向聚合物磁性纳米粒与对数生长期的人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和人胰腺癌细胞BxPC-3一起孵育1h,然后除去培养液，用PBS洗两次，胰酶消化后,离心收集两种细胞并用琼脂糖凝胶 (0.5％，200μL)混合培养细胞，用3.0T磁共振扫描仪(GE，Discovery750，USA)对收集处理的细胞样品进行体外磁共振成像实验。
参见图8和图9，结果显示，靶向组CKAAKN-HA-VES@USPIO纳米粒在BxPC-3细胞中的信号强度明显减弱，而非靶向组HA-VES@USPIO纳米粒在两种细胞中的信号强度并无显著性差异。结果提示，本发明可作为新型的胰腺癌靶向磁共振对比剂应用于胰腺癌的早期精准诊断。
三、对比试验：
发明人将本发明实施例14的产品、对比文件1的产品、对比文件2 的产品进行了细胞毒性实验、细胞竞争性摄取、靶向聚合物磁性纳米粒的体外磁共振成像对比，具体如下：
1、样品
1)本发明实施例14的产品(因制备方法一样，只是用量的差别，所以只选择实施例14做对比试验)。
2)对比文件1的产品成分及制备方法：
申请号：201510141402.8，发明名称:靶向聚合物胶束磁性纳米粒及制备和应用。
成分：磁性纳米粒由94％F-68溶液、4％CKAAKN多肽-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嫁接物、1％四氧化三铁纳米溶液及1％油酸乙醇组成。
制备方法为：
(1)CKAAKN-PEG-PLGA的合成取市售聚乳酸-羟基乙酸溶于二甲基亚枫溶液中，分别加入N,N'-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，在氩气保护下室温磁力搅拌反应24h后，慢慢滴加含聚乙二醇的二甲基亚枫溶液，继续反应6h后，经透析、离心、冷冻干燥后用丙酮溶解，再用去离子水复溶，经冷冻干燥后得到PEG-PLGA共聚物，取PEG-PLGA共聚物、CKAAKN多肽和N,N'-二环己基碳二亚胺溶解在二甲基亚枫溶液中，室温下磁力搅拌反应8h后，用去离子水混合，并透析、离心、干燥，即得到CKAAKN-PEG-PLGA嫁接物，其结构通过氢谱核磁共振进行确证；(2) 胰腺癌特异靶向聚合物胶束磁性纳米粒的制备，秤取CKAAKN-PEG-PLGA 嫁接物溶于去离子水中，在超声搅拌条件下，加入油溶性的Fe3O4为核心的磁性纳米粒溶液，超声搅拌10min后，在60℃水浴条件下旋蒸，得聚合物胶束磁性纳米粒：CKAAKN-PEG-PLGA-USPIO。
3)对比文件2的产品制备方法：申请号：201510356845.9，发明名称：一种透明质酸维生素E衍生物及制备和应用。
制备方法为：
透明质酸维生素E衍生物合成
称取0.5g维生素E琥珀酸酯(VES)，0.45g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.1gN-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS) 装入50ml单口烧瓶中，加入25ml二甲基亚砜(DMSO)，常温下搅拌溶解60min。另称取0.2g己二胺，用10mlDMSO溶解，缓慢滴加到反应液中，常温下搅拌8h以上，得到反应液A。称取0.38g分子量约为6700 (n+m＝17)透明质酸钠(HA-Na)，0.45g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.1g珀酰亚胺(NHS)装入100ml单口烧瓶中，加入60ml水和乙醇混合溶液，常温下搅拌溶解60min，缓慢滴加反应液 A，常温下搅拌4h。反应液在去离子水中透析3-4天除去催化剂及未反应的单体，冷冻干燥得到HAVES-1。
透明质酸维生素E胶束的制备
称取0.1gHAVES-1，溶于50ml去离子水中，超声溶解10min得到 2mg/ml的HAVES-1胶束水溶液。
对比试验1细胞毒性实验
采用四唑蓝比色法(MTT Assay)对对比文件1的产品、对比文件2的产品、CKAAKN-HA-VES@USPIO聚合物磁性纳米粒的体外细胞毒性进行评价。取对数生长期的人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和人胰腺癌细胞BxPC- 3，胰酶消化后用含10％新生牛血清的1640培养基进行稀释使细胞密度为 2.5×104个/mL，接种于96孔培养板(NalgeNuncInternational， Naperville，IL，USA)中，每孔200μL，于37℃，5％CO2孵箱中培养24 h至细胞贴壁，加入对比文件1、对比文件2和USPIO@CKAAKN-HA-VES溶液，以未处理的细胞作为空白对照，每个浓度设3个平行组。继续培养72h后，每孔加入20μL的MTT溶液(浓度为5.0mg/mL)，于孵箱中继续培养4h，弃去上清液，每孔加入200μL DMSO，恒温下振荡20分钟，在570nm处用酶联检测仪测定其吸光度，按如下公式计算细胞存活率：
Figure BDA0001861001770000211
式中：I％为细胞存活率；Acontrol为空白对照组在570nm处的吸光度； Atreat为样品组在570nm处的吸光度。
结果显示，USPIO@CKAAKN-HA-VES聚合物磁性纳米粒在1mg/ml高浓度下，与HPDE6-C7细胞和BxPC-3细胞共孵育72h，细胞存活率仍然保持在80％以上。而对比文件1的产品细胞存活率为70％，对比文件1说明书中记载孵育48h后，细胞存活率才高于80％；对比文件2的产品细胞存活率为56％,根据对比文件2说明书记载的结果是均未造成细胞超过90％的死亡。可见本发明的毒性低于对比文件1与对比文件2的产品，说明本发明生物安全性优于对比文件1的产品与对比文件2的产品。
对比试验2细胞竞争性摄取研究
取适量10mg香豆素6(Coumarin6，Mw＝350.43)溶于氯仿中，超声溶解配制成浓度为10mg/mL的香豆素6氯仿溶液备用。分别称取50mg对比文件1的产品、对比文件2的产品、CKAAKN-HA-VES聚合物溶于适量去离子水中，在超声搅拌下分别加入100μL油溶性的Fe3O4(5nm,5mg/mL)磁性纳米粒溶液和50μL香豆素6氯仿溶液(10mg/mL)，超声下搅拌20min后，在55～60℃水浴下旋蒸，得到香豆素6标记的HA-VES@USPIO和CKAAKN-HA- VES@USPIO聚合物磁性纳米粒。
以人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和人胰腺癌细胞BxPC-3为模型细胞，于37℃，5％CO2孵箱中进行培养，待细胞长至对数生长期时，用胰酶消化收集两种细胞，其中将BxPC-3细胞用细胞膜染料 PKH67(绿)进行染色(HPDE6-C7细胞不染色)，分别对两种细胞进行细胞计数，然后每孔各加入0.5×104个HPDE6-C7细胞和0.5×104个BxPC-3细胞，用移液枪吹打使两种细胞分散均匀于同一孔中，置于孵箱中共孵育培养。待两种细胞均贴壁生长后，依次加入对比文件1的产品、对比文件2的产品和CKAAKN- HA-VES@USPIO聚合物磁性纳米粒，一起共孵育1h后，置于激光共聚焦显微镜下观察。
结果显示，经靶向多肽CKAAKN修饰的聚合物磁性纳米粒对胰腺癌细胞 BxPC-3具有更高的特异性，能够显著增强磁共振对比剂USPIO在靶细胞中的摄取，而对比文件1、对比文件2产品的特异性较弱，并不能增强磁共振对比剂USPIO在靶细胞中的摄取。
对比例试验3靶向聚合物磁性纳米粒的体外磁共振成像
将对比文件1的产品、对比文件2的产品、靶向聚合物磁性纳米粒与对数生长期的人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和人胰腺癌细胞 BxPC-3一起孵育1h,然后除去培养液，用PBS洗两次，胰酶消化后, 离心收集两种细胞并用琼脂糖凝胶(0.5％，200μL)混合培养细胞，用3.0T磁共振扫描仪(GE，Discovery750，USA)对收集处理的细胞样品进行体外磁共振成像实验。
结果显示，靶向组CKAAKN-HA-VES@USPIO纳米粒在BxPC-3细胞中的信号强度明显减弱，而对比文件1的产品与对比文件2的产品的信号强度并无显著性差异。结果提示，本发明作为新型的胰腺癌靶向磁共振对比剂应用于胰腺癌的早期精准诊断优于对比文件1与对比文件2的产品。
综上所述，1、USPIO@CKAAKN-HA-VES聚合物磁性纳米粒在1mg/ml 高浓度下，与HPDE6-C7细胞和BxPC-3细胞共孵育72h，细胞存活率仍然保持在80％以上。而对比文件1的产品细胞存活率为70％，对比文件1 说明书中记载孵育48h后，细胞存活率才高于80％；对比文件2的产品细胞存活率为56％,根据对比文件2说明书记载的结果是均未造成细胞超过90％的死亡，可见本发明的毒性低于对比文件1与对比文件2的产品，说明本发明生物安全性优于对比文件1的产品与对比文件2的产品。 2、经靶向多肽CKAAKN修饰的聚合物磁性纳米粒对胰腺癌细胞BxPC-3 具有更高的特异性，能够显著增强磁共振对比剂USPIO在靶细胞中的摄取，而对比文件1、对比文件2产品的特异性较弱，并不能增强磁共振对比剂USPIO在靶细胞中的摄取。3、本发明作为新型的胰腺癌靶向磁共振对比剂应用于胰腺癌的早期精准诊断优于对比文件1与对比文件2的产品。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒，其特征在于,所述磁性纳米粒由以下成分组成：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束40-60mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液50-150μL、去离子水16-24ml；
所述的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束由以下成分及方法合成：
成分：CKAAKN 15-25mg、透明质酸钠0.5-1.5g、维生素E琥珀酸酯0.40-1.10g；
合成方法：1)称取0.40-1.10g维生素E琥珀酸酯,用2-5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入1-4g碳二亚胺和0.5-2g N-羟基琥珀酰亚胺，在50-70℃磁力搅拌下反应0.5-2h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.08-3.01g用1-3ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中,继续磁力搅拌反应4-8h，得反应液A；
2)称取0.5-1.5g透明质酸钠用3-7ml二甲基亚砜溶液和3-7ml去离子水溶解，再加入1.20-5.45g碳二亚胺和0.75-3.29g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6-10h后用去离子水透析，在-85℃至-42℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称0.4g-0.6g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用8-12mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与15-25mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证。
2.根据权利要求1所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒，其特征在于，所述磁性纳米粒由以下成分组成：CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束50mg、四氧化三铁磁性纳米粒溶液100μL、去离子水20ml。
3.根据权利要求1-2任一项所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒，其特征在于，所述磁性纳米粒由以下方法制成：以透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束作为载体，并在其表面修饰CKAAKN胰腺癌靶向配体，在聚合物胶束的疏水内核包载油溶性的四氧化三铁纳米微粒。
4.一种制备权利要求1-2任一项所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的方法，其特征在于具体由以下步骤制成：称取CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于去离子水中，在超声搅拌下加入油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15-25min后，在45-65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
5.根据权利要求1所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒，其特征在于，所述的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束由以下成分及方法合成：
成分：CKAAKN 20mg、透明质酸钠1.0g、维生素E琥珀酸酯0.68g制备方法：
1)称取0.68g维生素E琥珀酸酯,用3ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2.47g碳二亚胺和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺，在60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.99g用1.5ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A；
2)称取1.0g透明质酸钠，用5ml二甲基亚砜溶液和5ml去离子水溶解活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，在-55℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.5g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用10ml去离子水溶解，在碳二亚胺存在下进一步与20mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束。
6.一种制备权利要求1-2任一项所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的方法，其特征在于由以下步骤制成：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.40-1.10g维生素E琥珀酸酯,用2-5ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入1-4g碳二亚胺和0.5-2gN-羟基琥珀酰亚胺，在50-70℃磁力搅拌下反应0.5-2h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.08-3.01g用1-3ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应4-8h，得反应液A；
2)称取0.5-1.5g透明质酸钠，用3-7ml二甲基亚砜溶液和3-7ml去离子水溶解，再加入1.20-5.45g碳二亚胺和0.75-3.29g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应6-10h后用去离子水透析，在-85℃至-42℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)称取0.4g-0.6g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，用8-12mL去离子水中溶解，在碳二亚胺存在下进一步与15-25mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯胶束，其结构通过核磁共振氢谱进行确证；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取40-60mg CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束，溶于16-24ml去离子水中，在超声搅拌下加入50-150μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌15-25min后，在45-65℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
7.根据权利要求6所述的胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的方法，其特征在于由以下步骤制成：
(1)CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束的合成
1)称取0.68g维生素E琥珀酸酯,用3ml二甲基亚砜溶液在超声下溶解均匀，然后加入2.47g碳二亚胺和1.49g N-羟基琥珀酰亚胺，60℃磁力搅拌下反应1h以活化维生素E琥珀酸酯上的羧基，后将反应连接物胱胺1.99g用1.5ml二甲基亚砜溶液溶解加入上述反应液中，继续磁力搅拌反应6h，得反应液A；
2)称取1.0g透明质酸钠，用5ml二甲基亚砜溶液和5ml去离子水溶解，再加入1.44g碳二亚胺和0.85g N-羟基琥珀酰亚胺，活化透明质酸钠上的羧基，后在同温度下滴加反应液A，磁力搅拌反应8h后用去离子水透析，在-55℃冷冻干燥，得到透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
3)用0.5g纯化后的透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束用10ml去离子水溶解，在碳二亚胺存在下进一步与20mg胰腺癌靶向多肽CKAAKN发生共轭反应，最终得到CKAAKN多肽修饰的CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束；
(2)胰腺癌双靶向聚合物磁性纳米粒的制备
称取50mgCKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯聚合物胶束溶于20ml去离子水中，在超声搅拌下加入100μL油溶性的四氧化三铁磁性纳米粒溶液，超声下搅拌20min后，在55-60℃水浴下旋蒸，得到靶向聚合物磁性纳米粒CKAAKN-透明质酸-维生素E琥珀酸酯@USPIO。
8.如权利要求1-2任一项所述的双靶向聚合物磁性纳米粒在制备胰腺癌早期诊断的磁共振对比剂中的应用。
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