CN104274842B - 一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，包括：利用溶剂热法制备得到PEI修饰的Mn3O4纳米颗粒，然后对纳米颗粒进行分离纯化；其次，将示踪分子异硫氰酸荧光素FI标记到纳米颗粒上；而后，将聚乙二醇PEG分子修饰在PEI的氨基上；最后，将靶向试剂叶酸FA分子通过PEG修饰到PEI上并进行完全乙酰化处理，即得。本发明得到的造影剂能在细胞水平示踪纳米颗粒被癌细胞的吞噬情况，并且对FA受体高表达癌细胞株系具有显著的靶向作用，可实现癌症的早期诊断，同时因该方法制备简易，原材料廉价易得，可实现大批量生产。
Description
技术领域
本发明属于核磁共振造影剂的制备领域，特别涉及一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法。
背景技术
癌症(cancer)，医学术语亦称恶性肿瘤，现在已直接或间接的影响许多人的生活，成为威胁人类健康的头号杀手。因此，早期的诊断和治疗成为治愈癌症的关键。在肿瘤的早期诊断方面，传统的影像技术只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，而分子影像学技术可以获得更多的检测参数，如肿瘤生长动力学评估，恶变前的分子异常检测，肿瘤细胞标记物等，且活体分子成像可以实现在无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研究，并帮助破译复杂的分子运动轨迹。目前应用于临床的分子影像学技术主要包括超声成像、核医学PET成像、CT成像和核磁共振成像(MRI)等。作为分子影像学的重要组成部分，造影剂的适当选择可以大大地提高成像诊断的灵敏性、特异性。而作为理想的且能应用于临床癌症早期靶向诊断的纳米材料体系，在生物安全性得以保障的同时，更要兼顾能同时携带靶向分子、成像试剂分子、制备方法简便、原材料价廉易得几个主要因素。目前应用于临床的造影剂，如应用于CT成像的Omnipaque，用于MRI的六种钆基小分子造影剂都存在不可克服的缺陷，如血液循环时间过短、无组织特应性，尤其是钆基造影剂一定浓度下还存在肾毒性。显而易见，金属或者金属氧化物纳米颗粒相对于金属离子螯合物要更加具有安全性，并且一定尺寸的纳米颗粒经表面修饰后不仅能延长血液循环时间，还能特异靶向肿瘤细胞或组织。至今已有大量文献报道利用金、银纳米颗粒，磁性氧化铁纳米颗粒应用于癌症的早期靶向诊断。然而，金银作为贵重金属，成本高在一定程度上限制了其临床应用，而氧化铁纳米颗粒通常是作为MRI阴性造影剂。因为在人体血液中、钙离子富集区、金属离子沉积以及人体组织损伤部位在T2成像过程中也会出现信号减弱现象而得到负造影图像，这往往会干扰临床诊断。因此，临床医学界更期望开发具有信号增强作用的T1造影剂。
PEI是一种水溶性聚胺，其大分子链上拥有大量的氨基，不仅能提供影响纳米颗粒胶体稳定性的电荷排斥力，还使得纳米颗粒表面带上正电荷的氨基官能团，为纳米颗粒的表面多功能修饰提供了可行性。本发明选取的靶向分子叶酸(FA)，具有分子量小、无毒、无免疫原性、生物相容性好、稳定性高、廉价易得、易于修饰等多种优势。有专利成果显示PEI修饰的磁性氧化铁纳米颗粒可以通过简易的水热法合成(Li et.al.,Biomaterials 34(2013)8382-8392)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。制备的Mn3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
本发明的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，包括：
(1)将聚乙烯亚胺PEI分散在溶剂中，得到聚乙烯亚胺PEI溶液，然后将锰盐分散在聚乙烯亚胺溶液中，空气气氛下搅拌0.5-1小时，然后转移至高压反应釜中，搅拌至混匀，在150-180℃反应12-24小时，冷却，离心，透析，冷冻干燥，即得PEI修饰的四氧化三锰纳米颗粒Mn3O4-PEI；
(2)将上述PEI修饰的四氧化三锰纳米颗粒Mn3O4-PEI分散在溶剂中，超声，然后加入异硫氰酸荧光素FI溶液，搅拌反应12-24小时，得到Mn3O4-PEI-FI；
(3)将叶酸FA溶解在溶剂中，用EDC和NHS活化3小时，然后逐滴加入到NH2-PEG-COOH溶液中，搅拌反应48-72小时，透析，冷冻干燥，得到COOH-PEG-FA；
(4)将上述COOH-PEG-FA、EDC和NHS溶解于溶剂中，搅拌活化3小时；然后将活化后的COOH-PEG-FA溶液加入到步骤(2)制备的Mn3O4-PEI-FI溶液中，搅拌反应3天，得到Mn3O4-PEI-FI-(PEG-FA)纳米颗粒溶液；
(5)将上述Mn3O4-PEI-FI-(PEG-FA)纳米颗粒溶液中加入EDC和NHS活化1-3小时后，加入mPEG-COOH，搅拌反应48-72小时得到Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒，然后加入三乙胺搅拌10-30min，再加入乙酸酐，继续搅拌反应12-24小时，透析，真空冷冻干燥，即得聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒。
所述步骤(1)中溶剂为二甘醇DEG；锰盐为乙酰丙酮锰Mn(acac)2；PEI为支状，分子量为25000。
所述步骤(1)中锰盐、溶剂、PEI比例为0.375g：15mL：0.15g。
所述步骤(1)中离心为将产物转移至50mL离心管中8000rpm离心5分钟，收取上清液；透析为用截留分子量为30000的透析袋透析3天(每次透析用水2L，共换水9次)。
所述步骤(2)中FI与Mn3O4-PEI表面PEI的摩尔比为5：1。
所述步骤(3)中FA、EDC和NHS的摩尔比为1：5：5，FA和NH2-PEG-COOH的摩尔比为3：1，其中NH2-PEG-COOH的分子量为2000。
所述步骤(3)中透析为用截留分子量为2000的透析袋对蒸馏水透析三天共换水9次，2L/ 次。
所述步骤(4)中COOH-PEG-FA与EDC、NHS的摩尔比为1：5：5；COOH-PEG-FA与Mn3O4纳米颗粒表面PEI的摩尔比为10：1。
所述步骤(5)中mPEG-COOH与Mn3O4纳米颗粒表面PEI的摩尔比为20：1；mPEG-COOH与EDC和NHS的摩尔比为1：5：5。
所述步骤(5)中三乙胺、乙酸酐与Mn3O4纳米颗粒表面PEI上的氨基摩尔比为6：5：1。
所述步骤(5)中透析为用截留分子量为25000的透析袋透析3天(共换蒸馏水9次，2L/次)。
所述步骤(2)-(5)中溶液溶剂均为二甲基亚砜DMSO。
所述步骤(1)、(3)、(5)中透析时间均为2-3天。
本发明采用了一步溶剂热法合成出具有良好胶体稳定性的PEI修饰的Mn3O4纳米颗粒。随后，Mn3O4纳米颗粒表面的PEG-FA修饰不仅增加了纳米颗粒的水溶性和生物相容性，为进一步的体内成像应用提供了保障；同时也提高了Mn3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位的靶向性，从而使核磁共振成像诊断更加准确、灵敏。
本发明先利用一步溶剂热法合成PEI修饰的Mn3O4磁性纳米颗粒，然后将FI和PEG-FA，以及mPEG修饰在纳米颗粒的表面，最后对纳米颗粒表面结合的PEI上剩余氨基进行乙酰化修饰。
本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和生物相容性。与没有FA修饰的对照材料相比，FA修饰的Mn3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位具有更高的靶向性。该方法制备的FA靶向Mn3O4纳米颗粒在MRI分子影像诊断领域有着潜在的应用。
本发明使用X射线衍射(XRD)、核磁共振波谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势、水合粒径和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过核磁共振成像仪测定纳米颗粒的T1弛豫性能和r1弛豫率，然后通过溶血实验、MTT法和相差显微镜评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，再利用流式细胞仪、激光共聚焦显微成像以及体外和体内核磁共振成像实验检测FA修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。具体测试结果如下：
(1)X射线衍射(XRD)测试结果
通过与标准晶体结构卡片对比和分析X-射线衍射图谱(如图1)，溶剂热法合成的材料和标准品Mn3O4的图谱完全一致，表明本发明一步溶剂热法得到的锰氧化物晶体结构为标准的Mn3O4晶体。
(2)红外光谱(FT-IR)测试结果
通过对得到的图谱(如图2)进行解析，图谱中3419cm-1处的峰为吸附的水分子上O-H的吸收峰和PEI上N-H的伸缩振动峰，PEI上2952cm-1和2851cm-1处的峰，和Mn3O4-PEI上的2924cm-1与2847cm-1处的峰都归属于PEI上亚甲基的伸缩振动。同时，PEI上的1459-1642cm-1(C＝O的伸缩振动)和1120cm-1(C-O的伸缩振动)处的峰，均在Mn3O4-PEI样品上得到体现。而636cm-1上多出PEI的峰为Mn3O4上Mn-O的伸缩振动(图2)。红外光谱图结果表明在合成的四氧化三锰表面确实有PEI存在。
(3)核磁共振分析(1H NMR)的测试结果
通过分析COOH-PEG-FA在氘代水中的氢谱谱峰(如图3)可知，COOH-PEG-FA在6-9ppm出现的谱峰证明FA已经成功连接到PEG上，并通过积分峰面积计算可知，每一个PEG上连接了0.85个FA。
(4)紫外吸收(UV-Vis)测试结果
通过分析Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的紫外图谱(图4)发现，两个材料在510nm处均有一个明显的FI的紫外特征吸收峰，这说明已经成功地将FI修饰到Mn3O4-PEI纳米颗粒表面。
(5)纳米颗粒Zeta电势及水合粒径测试结果
本发明制备得到的Mn3O4纳米颗粒表面有大量的PEI存在而具有较高的正电荷，较高的正电荷会制约该材料在生物医学领域的应用。因此本发明对修饰后的实验组材料和对照组材料进行了完全乙酰化处理，以期降低纳米颗粒的表面电势，从而提高其生物相容性。表面电势和水合粒径测定结果如表1所示：合成得到的PEI包裹的Mn3O4表面电势和水合粒径分别为+39.17mV和186.5nm。而经过修饰和完全乙酰化之后，实验组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为+18.77mV和571nm，而对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为+29.00mV和387.7nm。从实验结果得出，完全乙酰化成功地降低了纳米颗粒的表面电势。而水合粒径的增加也反应了FA、FI以及mPEG成功地连接到Mn3O4-PEI纳米颗粒表面。
(6)热重分析(TGA)测试结果
通过对样品PEI、Mn3O4-PEI、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)进行热重分析得出，Mn3O4-PEI的失重量为54.9％(图5b)，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的失重分别是71.8％(图5d)和68.1％(图5c)，由此定量分析出Ac-FI-mPEG和PEG-FA连接到Mn3O4-PEI纳米颗粒的表面的上载率分别为13.2％和3.7％。
(7)透射电子显微镜(TEM)测试结果
通过TEM观察本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(图6a)纳米颗粒和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(图6b)纳米颗粒的形态和粒径。TEM测试结果显示制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒呈球形或者近似球形状，经过统计分析后得到Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG平均直径为8.0±1.7nm，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的平均直径为8.1±1.7nm，两者的平均直径并没有明显的区别。
(8)r1弛豫率测量结果
r1弛豫率反映Mn3O4纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度锰的纵向弛豫时间，可通过不同浓度下的T1弛豫时间的倒数拟合计算得到。图7为本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的T1弛豫时间倒数与Mn浓度的线性拟合图，可以看出这两种Mn3O4纳米材料的弛豫时间倒数随着锰浓度的增加(在0-0.8mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的r1弛豫率分别为0.566mM-1s-1和0.590mM-1s-1。因此，本发明所制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG均可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂。
(9)T1加权MR成像测量结果
图8是本发明制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的T1加权MR成像性能测试，从图中可以看出随着锰浓度(0.05-0.8mM)的提高，MRI信号逐渐增强，并且呈良好的梯度关系。结果说明制备得到的两组材料都具有良好的MRI信号增强造影剂应用潜质。
(10)血液相容性
由于造影剂的给药途径多数情况下是经由静脉注射方式进入人体内的。因此，造影剂势必会与血液直接接触。而造影剂的介入会不会产生溶血或者其他不良症状便成为科研工作者不得不考虑的重要因素之一。本发明通过溶血试验评估了制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的血液相容性。图9中显示了Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(图9a)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(图9b)在不同锰浓度(5、10、25、50、100μg/mL)下经过1个小时孵育之后离心观察溶血结果，结果显示阳性对照组(水)完全溶血，阴性对照组(PBS)、实验组以及对照组并未出现溶血现象。此外，还通过测量上层清液中血红蛋白的吸光值来定量分析纳米材料的溶血性能。如图9中柱状图所示，即使在锰浓度达到100μg/mL时，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组 Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒的溶血率均小于5％，说明制备得到的纳米材料具有良好的血液相容性，具有安全用于生物体内MRI成像的潜质。
(11)MTT细胞活力和相差显微镜测试结果
通过MTT比色法测定KB细胞的活力来检测本发明制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的细胞毒性(如图10)。KB细胞分别与Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒(锰浓度为5、10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，以缓冲液PBS组的吸收值为基准，不同浓度的材料处理后的吸收值与之相比计算得到KB细胞的存活率。实验结果显示Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒在浓度5到50μg/mL范围内对KB细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上，当浓度增加到100μg/mL时细胞的存活率略微下降，但依然保持在70％(如图10)。这说明Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG具有良好的细胞相容性。同时，还通过相差显微镜观察材料是否会对KB细胞的形貌产生影响，如图11所示。不同浓度的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米材料(锰浓度分别为5、10、25、50和100μg/mL)处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞相比，没有明显的变化，说明了合成的材料不会对细胞产生影响，进一步证明材料在给定浓度范围内具有细胞相容性。
(12)流式细胞术检测结果
通过流式细胞术检测KB细胞对本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG在不同浓度下的处理后细胞的平均荧光强度(如图12)来检测FA的靶向性效果。KB细胞分别与Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(Mn浓度为0、25、50、75和100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。然后通过流式细胞术检测细胞的平均荧光强度。在图12中，随着Mn浓度的提高，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)处理后细胞的平均荧光强度显著增加，而Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG处理后细胞的平均荧光强度增加不明显。这些结果说明修饰FA赋予了纳米颗粒对KB细胞的特异靶向能力。
(13)激光共聚焦显微镜检测结果
FA的靶向性能同样通过激光共聚焦显微镜来验证(如图13)，KB细胞分别与PBS、本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(Mn浓度为50μg/mL)在37℃下共培养4小时，然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号。在图13中，经过PBS处理的细胞内没有荧光， Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG处理的细胞内显示出比较微弱的荧光信号，而Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)处理的细胞内显示出明显的荧光信号，这进一步说明FA修饰的纳米颗粒对KB细胞有更好的靶向性，从而为该材料成功高效地应用于体内MR成像提供了可靠的依据。
(14)体外细胞MRI成像结果
在进行体内实验之前，评价了本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的细胞MR成像效果(如图14所示)。KB细胞分别与Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒(Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。如图14所示，随着Mn浓度的提高，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG或者Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号增强的趋势，说明随着Mn浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Mn浓度下，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒处理后的细胞比对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG处理后的MRI信号增强更明显，说明靶向分子FA的存在使得细胞对Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒的吞噬量要大大高于Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒。图15是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI成像信号值，从图中明显看出，随着Mn浓度的提高，细胞的MRI信号值均逐渐增加，而且在相同的Mn浓度下，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒处理后细胞的MRI信号值要明显高于对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MRI成像效果，而且证明了FA介导的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒对KB细胞的特异靶向性。
(15)体内肿瘤MR成像结果
通过尾静脉注射本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG来评价肿瘤部位的MRI成像效果(如图16)，与注射前的对照组相比较，在注射后30分钟到4小时内，注射对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(Mn：500μg)的裸鼠肿瘤部位明暗程度变化并不明显，而注射Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(Mn：500μg)的裸鼠肿瘤明显变亮，展示出FA修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图17是相应注射时间点的肿瘤MRI信号值变化，在注射后30分钟到4小时，注射Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的裸鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射 Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的裸鼠肿瘤MRI信号值明显，这与图16的结果一致。这些结果说明本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MRI肿瘤成像诊断。
有益效果
(1)本发明采用简单的一步溶剂热法制备水溶性良好的PEI包覆的Mn3O4纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面先后连接FI、mPEG和PEG-FA分子，最后对纳米颗粒的表面氨基进行乙酰化修饰得到用于MRI造影剂的Mn3O4纳米颗粒；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；
(2)本发明制备的Mn3O4纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水不会出现团聚或者沉淀现象；PEI的包覆增加了Mn3O4纳米颗粒的稳定性，PEG-FA的表面修饰不仅增加了Mn3O4纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的靶向特异性；这些优点使制备的FA靶向性Mn3O4纳米颗粒可以有效地用作体内MR成像的阳性造影剂；
(3)本发明利用简易的溶剂热法制备得到表面结合可供功能化修饰的PEI分子，并以此为平台将示踪分子、靶向分子以及能提高纳米颗粒在体内循环时间的PEG分子修饰到纳米颗粒表面，得到的造影剂能在细胞水平示踪纳米颗粒被癌细胞的吞噬情况，并且对FA受体高表达癌细胞株系具有显著的靶向作用，可实现癌症的早期诊断，同时因该方法制备简易，原材料廉价易得，可实现大批量生产。
附图说明
图1是本发明制备的Mn3O4-PEI的X射线衍射图；
图2是PEI，Mn3O4-PEI的红外光谱图；
图3是本发明制备的COOH-PEG-FA在氘代水中的核磁共振氢谱谱图；
图4是FI(a)、FA(b)和本发明制备的对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(c)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(d)的紫外光谱图；
图5是PEI(a)和本发明制备的Mn3O4-PEI(b)、对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(c)以及Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(d)的热重分析图；
图6是本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(a)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(b)纳米颗粒的TEM图(左)和直径分布柱状图(右)；
图7是本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG
纳米颗粒的T1弛豫时间倒数与Mn浓度的线性关系图；
图8本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(图8a)对照组材料和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(图8b)纳米颗粒在锰浓度为0.05-0.8mM的MR T1加权成像；
图9是本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG在锰浓度为5-100μg/mL下溶血率柱状图；插图为：(a)Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)为(b)为Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG；在不同锰浓度(5、10、25、50、100μg/mL)下经过1个小时孵育之后离心观察的溶血结果图；
图10是MTT法测得KB细胞经过PBS缓冲液(对照)、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG在锰浓度为(5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)处理24小时后的细胞活力；
图11是KB细胞经过PBS缓冲液(对照(a)、(L))、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(b-f)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(g-k)在锰浓度分别为(5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)处理24小时后的相差显微镜细胞形貌图；
图12是KB细胞经过PBS缓冲液、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒在Mn浓度范围在5-100μg/mL，处理4小时后细胞的平均荧光强度；
图13是KB细胞经过PBS缓冲液(a)、对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(b)和实验组Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(c)在Mn浓度为50μg/mL时处理4小时后细胞的激光共聚焦显微成像图片；
图14是KB细胞经过PBS缓冲液、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(a)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(b)在锰浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM时处理4小时后的T1加权MR成像图；
图15是KB细胞经过PBS缓冲液、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG在不同锰浓度下处理4小时后的T1加权MR成像信号值柱状图；
图16是尾静脉注射本发明制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(Mn：500μg)后不同时间点裸鼠肿瘤的T1加权MR成像图片(白色小星指示肿瘤位置)；
图17是尾静脉注射本发明制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(Mn：500μg)后不同时间点裸鼠肿瘤的MRI信号值变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将0.150g PEI溶解在15mL一缩二乙二醇(DEG)中，常温下搅拌至均匀分散，然后称量0.3795g Mn(acac)2放入上述混合溶液中，持续搅拌1小时后，将得到的混合物溶液转移到高压反应釜中，于180℃反应24小时。反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色溶液在8000rpm下离心5分钟，收集上清液，选用截留分子量为30000的透析袋将副产物和溶剂除去(透析3天，每天换水3次，每次使用2L蒸馏水)，待透析结束，取出所有透析液真空冷冻干燥，取适量Mn3O4-PEI粉末用于X-射线衍射检测和FTIR测试。XRD结果显示了Mn3O4-PEI纳米颗粒的出峰位置与标准品四氧化三锰晶体结构一致(如图1)。此外，FTIR图谱中也体现出PEI的特征峰，由此表明Mn3O4纳米颗粒表面包裹了PEI(如图2)。
COOH-PEG-FA的合成方法按照本课题组之前的实验步骤合成(Li et.al.,Biomaterials 34(2013)8382-8392)，将纯化后的COOH-PEG-FA溶解在氘代水中并做核磁氢谱分析(如图3)。如图3所示COOH-PEG-FA在6-9ppm出现的谱峰说明FA已经成功连接到PEG上。通过积分峰面积计算可知，每一个PEG上连接了0.85个FA。
取9.17mg Mn3O4-PEI溶解于10mL DMSO中使其分散均匀，然后称取0.79mg FITC溶解到2mL DMSO中，在搅拌情况下，将FI溶液逐滴加入到Mn3O4-PEI中，避光持续搅拌24小时，即得粗产物Mn3O4-PEI-FI(12mL)。将FA-PEG-COOH 18.75mg溶解在4mL DMSO中，同时取5.8mg EDC和3.5mg NHS分别溶解在1mL DMSO中使其完全溶解，和上述FA-PEG-COOH溶液混合，并搅拌活化3小时。然后将上述活化后的溶液(6mL)逐滴加入到Mn3O4-PEI-FI溶液中(12mL)，持续搅拌反应三天，即得粗产物Mn3O4-PEI-FI-(PEG-FA)(18mL)。之后称取mPEG-COOH 8mg溶解于2mL DMSO中，然后分别称量EDC 3.82mg，NHS 2.3mg分别溶解在1mL DMSO中，加入上述mPEG-COOH溶液中，室温下搅拌活化3小时。然后将活化后的mPEG-COOH溶液加入到Mn3O4-PEI-FI-(PEG-FA)溶液中，持续搅拌反应3天，即得粗产物Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)溶液(22mL)。
最后，向Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)溶液(22mL)中滴加100μL三乙胺(密度为0.726～0.729g/mL，浓度为99.0％)，搅拌30分钟，然后再加入57μL乙酸酐(密度为1.08g/mL，浓度为98.5％)。三乙胺、乙酸酐与Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)表面的氨基摩尔比为6：5：1，继续搅拌反应24小时，即得产物Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)。将反应得到的产物 用截留分子量为8000-14000的透析袋透析除去副产物和其他试剂(PBS缓冲液透析1天，换液三次，蒸馏水透析2天，每天换3次水，每次用PBS缓冲液或水均为2L)，将透析后的产物冷冻干燥备用。
实施例2
分别取实施例1制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对比例1制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒2mg溶解在超纯水中，得到纳米颗粒悬液，超声均匀，测紫外吸收图谱(见图4)。紫外可见光谱测试结果表明，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG在510nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到Mn3O4-PEI纳米颗粒表面。
称取实施例1制备得到的两种材料：Mn3O4-PEI，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对比例1得到的对照组材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG 2-4mg进行热重分析(如图5所示)。TGA测试结果表明，Mn3O4-PEI纳米颗粒的失重量为54.9％(图5b)，按PEI表面氨基与PEG摩尔比例30：1修饰后，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的失重量分别是68.1％(图5d)和71.8％(图5c)；经过计算，FI-mPEG和PEG-FA的上载率分别为13.2％和3.7％，由此表明Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和FI-mPEG-COOH已成功连接到Mn3O4-PEI纳米颗粒的表面。
同样称取本发明制备的Mn3O4-PEI、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(实施例1)和及对比例1中的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG各1mg，分散在1mL超纯水中用于测试表面电势和水动力学直径(如表1)。Mn3O4-PEI的表面电势为+39.17mV，经修饰并完全乙酰化处理后的两种材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的表面电势分别降到了+18.77mV和+29.00mV，表明乙酰化处理能有效地降低纳米颗粒的表面电势。经测定Mn3O4-PEI、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的水合粒径分别为186.5nm，387.7nm和571.0nm。从水合粒径逐渐增加可以看出Mn3O4-PEI表面成功地修饰上了FI、mPEG以及FA分子。
为了对制备得到的纳米颗粒的尺寸和形貌进行表征，分别取本发明实施例1制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对比例1制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒溶解在100μL超纯水中配制成纳米颗粒悬浮液。各取5μL Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒悬浮液各滴在铜网表面，并在空气中晾干后用于TEM测试(如图6所示)。TEM结果显示Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(图6a)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(图6b)纳米颗粒的形貌均为球形或近似球形，经过统计分析后得到Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG平均直径为8.0±1.7nm，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的平 均直径为8.1±1.7nm。
将本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(实施例1)纳米颗粒和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(对比例1)通过ICP-OES测试法测得溶液中Mn元素的浓度，再用超纯水配制Mn浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mM的水溶液2mL，测定不同Mn浓度下的T1弛豫时间(如图7所示)和T1加权成像(如图8所示)。弛豫率测试结果表明Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒的T1弛豫时间倒数在Mn浓度为0.05-0.8mM范围内随着锰浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可知Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的r1弛豫率0.566mM-1s-1，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的r1弛豫率为0.590mM-1s-1，都具有良好的T1弛豫效应和r1弛豫率。同时T1加权成像也显示两种材料随锰浓度的提高，信号强度增强。因此，本发明所制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂。
实施例3
为了确保本发明制备的纳米颗粒能安全地用于体内生物成像诊断，评价了制备得到的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的血液相容性。根据实施例2中测定的两种材料的锰浓度计算称量出Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒(实施例1)和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(对比例1)中锰元素总量各1mg的两种纳米颗粒，分别分散于PBS中配制成1mg/mL的浓度为母液，然后用PBS依次配制浓度为5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的纳米颗粒悬浮液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm，5分钟)去上清液，然后将血红细胞用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS稀释10倍。再将Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米材料(5-100μg/mL)与红细胞混合静置2小时后，10000rpm离心1分钟，拍照并测上清液的紫外吸收值。该过程以超纯水作为阳性对照，PBS作为阴性对照。图9中显示了Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(图9a)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(图9b)在浓度5、10、25、50和100μg/mL下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光度值定量评价纳米材料的溶血性。如图9下方柱状图显示，在浓度达到100μg/mL时，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的溶血率都小于5％，说明制备的这些纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MR成像。
实施例4
以KB细胞为模型细胞评价本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG对细胞存活的影响。称取相应重量的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒(实施例1)和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(对比例1)干粉 (两种材料锰元素的含量为1mg)，分散在无菌PBS中配制成1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS配制浓度为5、10、25、50和100μg/mL的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒悬浮液。KB细胞种植于96孔板后分别与Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒(浓度为5、10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时后，弃去培养液，并加入100μL DMSO，振荡20分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(如图10)。与对照组相比，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG在实验浓度0到100μg/mL范围内对KB细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在70％以上。这充分说明合成的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG均具有良好的细胞相容性，可以应用到生物体内MRI成像检测。通过相差显微镜观察法来验证制备得到的材料对细胞形态是否会产生影响。如图11所示，不同浓度的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米材料(5、10、25、50和100μg/mL)处理24小时后的细胞形态和PBS处理后的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的良好细胞相容性。
实施例5
通过流式细胞术检测不同浓度的纳米颗粒(5、10、25、50、100μg/mL)与KB细胞共培养4小时后细胞的平均荧光强度(如图12)来评价叶酸的靶向性效果。采用实施例2中和对比例1中按照锰元素含量配置成相应浓度为5、10、25、50和100μg/mL的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG两种纳米颗粒悬液。KB细胞以2×105/孔种植于12孔板，过夜培养后再分别与Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒(Mn浓度为5、10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于1mL PBS中。通过流式细胞仪检测处理后细胞的平均荧光强度。在图12中随着Mn浓度的增加，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)处理后细胞的平均荧光强度显著增加，而对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG处理后细胞的平均荧光强度增加不明显。这说明叶酸修饰后赋予了纳米颗粒对FA受体高表达的KB细胞具有较高的特异靶向能力。
实施例6
本发明通过激光共聚焦显微镜来验证FA的靶向性效果。先将灭菌后的盖玻片放置于12孔细胞培养板中并加入1640培养基浸泡12小时，然后每孔补充1.0mL培养基并接种1×105个KB细胞，过夜后分别与PBS、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒(Mn浓度为50μg/mL)在37℃下共培养4小时，接着用PBS洗三次，然后依次用 2.5％戊二醛(0.5mL)固定15分钟、Hochest33342(0.4mL)染色15分钟，最后将盖玻片放置于载玻片上，通过油镜观察拍照记录。如图13所示，经过PBS和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG处理的细胞内几乎没有荧光信号，而Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)处理的细胞内显示出明显的荧光信号，这进一步说明FA修饰的纳米颗粒对FA受体高表达的KB细胞具有较高的靶向特异性，从而为该材料能有效地应用于体内MR成像提供了可靠的依据。
实施例7
在体内成像实验之前，评价了纳米颗粒的细胞MR成像效果，通过ICP-OES测定实施例1中Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和对比例1中Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG材料中的锰元素含量。用无菌PBS分别配制成Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的两种纳米颗粒悬浮液。KB细胞以3×106/孔种植于25cm2细胞培养瓶中，培养过夜后，分别与PBS、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒在37℃下共培养4小时。培养结束后细胞用PBS洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS(含0.5％琼脂糖)中。用核磁共振成像仪测各细胞样品的T1加权成像(如图14)。如图所示，随着Mn浓度的增加，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(图14a)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(图14b)纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号增强的趋势，说明随着Mn浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在同样Mn浓度下，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒处理后的细胞比Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG处理后细胞的MRI信号增强低更明显，说明细胞对Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒的吞噬量要大大高于Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒。图15是细胞被不同浓度的纳米颗粒处理后的MR成像信号值，从图中明显看出，随着Mn浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐增加，而且在相同的Mn浓度下，Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒处理后细胞的MRI信号值要明显高于Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒对肿瘤细胞的特异靶向性。
实施例8
将本发明制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(实施例1)和对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(对比例1)按照ICP-OES测定的锰浓度配置成1mg/mL的0.5mL PBS分散液。2×106个KB细胞接种到裸鼠体内，三周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过尾静脉注射Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)和Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG纳米颗粒PBS溶液来评价肿瘤部位的MR成像效果(如图16)。与注射前相比较，在注射后30分钟到4小时内，注射0.5mL对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG(Mn：500μg)的裸鼠肿瘤部位稍微变暗，而注射 0.5mL Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)(Mn：500μg)的裸鼠肿瘤明显变亮，展示出FA修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图17是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后30分钟到4小时，注射对照材料Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的裸鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)的裸鼠肿瘤MRI信号值明显增强。这些结果说明该制备的Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内肿瘤靶向MRI成像诊断的造影剂。
对比例1
为了比较FA的靶向性，本发明按照实施例1中的方法和步骤合成得到Mn3O4-PEI-FI-mPEG纳米颗粒。首先合成得到Mn3O4-PEI-FI，然后称取mPEG-COOH 12mg溶解于4mL DMSO中，再分别称量EDC 5.73mg，NHS 3.45mg分别溶解在1mL DMSO中，加入上述mPEG-COOH溶液，室温下搅拌活化3小时。待到达设定时间将活化后的mPEG-COOH溶液加入到Mn3O4-PEI-FI溶液中，持续搅拌反应3天，即得粗产物Mn3O4-PEI-FI-mPEG溶液(18mL)。
向实上述Mn3O4-PEI-FI-mPEG溶液(18mL)中先滴加100μL三乙胺(密度为0.726～0.729g/mL，浓度为99.0％)，搅拌30分钟，然后再加入57μL乙酸酐(密度为1.08g/mL，浓度为98.5％)。三乙胺、乙酸酐与Mn3O4-PEI-FI-mPEG的表面氨基摩尔比设定为6:5:1，继续搅拌反应24小时，即得对照组产物Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG。将反应得到的产物用截留分子量为25000的透析袋透析出去副产物和其他试剂(PBS透析1天，换液三次后改用蒸馏水透析2天，每天换3次水，每次用PBS和水均为2L)，将透析后的产物冷冻干燥备用。产物Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG的表征祥见实施例2。
表1.Mn3O4-PEI、Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG和Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)的电势和水动力直径。
| 样品 | 电势(mV) | 水动力直径(nm) | 多分散系数 |
| Mn3O4-PEI | +39.17 | 186.5 | 0.219 |
| Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG | +29.00 | 387.7 | 0.275 |
| Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA) | +18.77 | 571.0 | 0.459 |
Claims (10)
1.一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，包括：
(1)将聚乙烯亚胺PEI分散在溶剂中，得到聚乙烯亚胺PEI溶液，然后将锰盐分散在聚乙烯亚胺溶液中，空气气氛下搅拌0.5-1小时，然后转移至高压反应釜中，搅拌至混匀，在150-180℃反应12-24小时，冷却，离心，透析，冷冻干燥，即得PEI修饰的四氧化三锰纳米颗粒Mn3O4-PEI；
(2)将上述PEI修饰的四氧化三锰纳米颗粒Mn3O4-PEI分散在溶剂中，超声，然后加入异硫氰酸荧光素FI溶液，搅拌反应12-24小时，得到Mn3O4-PEI-FI；
(3)将叶酸FA溶解在溶剂中，用EDC和NHS活化3小时，然后逐滴加入到NH2-PEG-COOH溶液中，搅拌反应48-72小时，透析，冷冻干燥，得到COOH-PEG-FA；
(4)将上述COOH-PEG-FA、EDC和NHS溶解于溶剂中，搅拌活化3小时；然后将活化后的COOH-PEG-FA溶液加入到步骤(2)制备的Mn3O4-PEI-FI溶液中，搅拌反应3天，得到Mn3O4-PEI-FI-(PEG-FA)纳米颗粒溶液；
(5)将上述Mn3O4-PEI-FI-(PEG-FA)纳米颗粒溶液中加入EDC和NHS活化1-3小时后，加入mPEG-COOH，搅拌反应48-72小时得到Mn3O4-PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒，然后加入三乙胺搅拌10-30分钟，再加入乙酸酐，继续搅拌反应12-24小时，透析，真空冷冻干燥，即得聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂Mn3O4-PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶剂为二甘醇DEG；锰盐为乙酰丙酮锰Mn(acac)2；PEI为支状，分子量为25000。
3.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中锰盐、溶剂、PEI比例为0.375g：15mL：0.15g。
4.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中FI与Mn3O4-PEI表面PEI的摩尔比为5：1。
5.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中FA、EDC和NHS的摩尔比为1：5：5，FA和NH2-PEG-COOH的摩尔比为3：1，其中NH2-PEG-COOH的分子量为2000。
6.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中COOH-PEG-FA与EDC、NHS的摩尔比为1：5：5；COOH-PEG-FA与Mn3O4纳米颗粒表面PEI的摩尔比为10：1。
7.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中mPEG-COOH与Mn3O4纳米颗粒表面PEI的摩尔比为20：1；mPEG-COOH与EDC和NHS的摩尔比为1：5：5。
8.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中三乙胺、乙酸酐与Mn3O4纳米颗粒表面PEI上的氨基摩尔比为6：5：1。
9.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)-(5)中溶液或溶剂均为二甲基亚砜DMSO。
10.根据权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺介导的多功能四氧化三锰纳米颗粒核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(3)、(5)中透析时间均为2-3天。
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